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1、中国农业大学博士学位论文葡萄与葡萄酒中黄烷醇类多酚和果实原花色素合成相关酶表达规律的研究姓名：温鹏飞申请学位级别：博士专业：食品科学与工程指导教师：黄卫东20050501中文摘要本研究在建立葡萄和葡萄酒中黄烷3 醇和原花色素检测体系的前提下，跟踪北京龙徽酿酒有限公司2 0 0 3 年度赤霞珠和霞多丽酿造过程，研究了千红、千白葡萄酒酿制过程中黄烷-3 醇和原花色素的变化规律；同时，以酿酒品种赤霞珠(H t i sv 加瓣L cv C a b e r n e tS a u v i g n o n)和霞多丽(H t i sv 抽舱r aLC V C h a r d o n n a y)果实为试材，研
2、究了葡萄果实发育过程中不同部能黄烷_ 3-醇和原花色素含量的变化规律及其合成相关酶的表达规律，并在基因转录水平上就外源S A 的诱导作用做了初步探讨。本研究建立了葡萄与葡萄酒中黄烷3 醇和原花色素检测体系，首次成功地分离了葡萄酒中儿茶素(+)一c a t e c h i n C A T C)、表儿茶素(-)一e p i c a t e c h i n，E C)、表儿茶素没食于酸酯(-)-e p i c a t e c h i ng a l l a t e，E C G)、表桔儿茶素(-)-e p i g a l l o c a t e c h i n，E G C)、表桔儿茶素没食子酸酯(-)-e
3、 p i g a l l o c a t e c h i ng a l l a t e，E G C G)五种黄烷一3 醇及其衍生物，证实了葡萄洒中存在E G C 和E G C G。对国产1 2 种葡萄酒检测结果表明，黄烷_ 3 醇和原花色素含量与葡萄酒的类型、原料品种、酿制丁艺等密切相关。对葡萄酒酿制过程监测发现，黄烷3 一醇和原花色素在发酵过程中迅速进入洒体中。贮藏或陈酿过程中，五种黄烷-3 醇含量变化互不相同，而原花色素含量有所下降，且其平均聚合度降低。果实发育过稗中，黄烷3 醇和原花色素均特异性累积于果皮和种子，果肉中含量极低；但不同部位两者的积累方式有所不同。赤霞珠粟皮中，黄烷。一醇在
4、幼果期大最累积，随后表现为持续F 降；原花色素在幼果期和花后5 0 6 0 天(转色期前)含量较高，随果实成熟，含量下降。种子中的黄烷3 醇幼果期含量较低，转色期时达到最高，随后表现为含量下降；原花色素在幼果期大量台成，随果实发育表现为持续下降。霞多丽果实中黄烷-3 醇和原花色素变化与赤霞珠相似。采用R T-P C R 技术，研究了果实发育过程中原花色素生物合成相关酶基因的表达规律。果实发育过程中，原花色素合成相关酶基因(P A L、C H S、F 3 H、D F R、u)O x)表达存在着时空性和品种特异性。赤霞珠果皮中，幼果期和果实成熟期各基因大量表达，而霞多丽果皮则仅在幼果期大量表达。在
5、两者的果肉和种子中，各基因则仅在幼果期大帚表达。以花后7 0 天(转色期)和1 0 0 天(成熟期)赤霞珠果实为试材，分别采用果实圆片孵育和果实低压渗透技术，首次证实了S A 能够诱导原花色素合成相关酶(P A L、C H S、F 3 H、D F R、L D O X)基因的表达。戈键词：葡萄，葡萄酒，黄烷3 醇，原花色素，H P L C，R T-P C RA b s t r a c tT h ew i n e sm a d ei nC h m aa n dt h eg r a p e(H a sv i n i f e r aLc v C a b e r n e tS a n v i g n o
6、 mb e r r yw e r eu s e da sm a t e r i a l，a n dt h ea n a l y t i c a ls y s t e mo ff l a v a n-3-o l sa n dp r o a n t h o c y a n i d i n sw e r ee s t a b l i s h e d F i v ek i n d so ff l a v a n-o l s，i n c l u d i n g(+)-c a t e c h i n(C A T C 0，(-)-e p i g a l l o c a t e c h i n(E G c)，
7、()-e p i g a n o c a t e c h i ng a l l a t e(E G C G)，(-)-e p i c a t e c h i n(E C)，a n d(-)-e p i c a t e c h i ng a l l a t e(E C G)，w e r es e p a r a t e da n dd e t e r m i n e df i r s t l yt h r o u g hac h r o m a t o g r a p h i cc o l u m no f5 2 mL i C h r o s p h e rI O O R P 1 8 e(2 5
8、 0 x 4 0 m mI D，M e r c k)b yt h em o b i l ep h a s eg r a d i e n te l u t i o no fg l a c i a la c e t i ca c i ds o l u t i o n，a n da sw ek n o w n，i ti st h ef i r s tt i m et od e t e r m i n eE G C，a n dE G C Gi nt h ew i n e s T h ea n a l y t i c a ls y s t e mo fp r o a n t h o c y a n i
9、d i n si nt h ew i n e sw a sa l s oe s t a b l i s h m e n tb a s e do nt h ep u b l i s h e dr e p o r t T h ec o n c e n t r a t i o n，t h em e a nd e g r e ea n dt h ec o m p o s i t i o no fp r o a n t h o c y a n i d i n sh a sb e e ns t u d i e du s i n g(1)f r a c t i o n a t i o na n dp u r
10、 i f i c a t i o no nT S KH W-5 0(F)(T o s o h，J a p a n)b yd i f f e r e n ts o l v e n t s，(2)f r a c t i o n a t i o nf o l l o w e db ya c i d-c a t a l y z e dd e g r a d a t i o ni nt h ep r e s e n c eo fp h l o r o g l u c i n 0 1 T h er e s u l t so f 1 2t y p eo fw i n e sm a d ei nC h i n
11、 ab yd i f f e r e n tm a n u f a c t u r e ri n d i c a t e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no ff i a v a n 一3-o l sa n dp r o a n t h o c y a n i d i n si nt h ew i n e sw a sd e p e n d e do nt h et y p e，m a t e r i a l，a n dt h ew i n e-m a k i n gt e c h n o l o g y C A Ta n dE Ci st h em
12、 o s t l ya b u n d a n tm o n o m e r i cf l a v a n 3-o l si nr e dw i n e s，a n dt h em e a nd e g r e ep o l y m e r i z a t i o n(m D P)，c o m p o s i t i o no fp r o a n t h o c y a n i d i n si nt h ew i n e sw e r ed i v e r s i f i e d C A Ta n dE Cw a st h em o s t l yt e r m i n a lu n i
13、t so fp r o a n t h o c y a n i d i n s，a n dt h eE Cw a st h em o s t l ye x t e n s i o nu n i t s D u r i n gt h ef e r m e n t a t i o no fC a b e m e tS a u v i g n o na n dC h a r d o r m a y,t h ef l a v a n 一3-o l sa n dp r o a n t h o c y a n i d i n st r a n s f e n e dr a p i d l yf r o m
14、s o l i dp a r t so ft h eg r a p ec l u s t e ri n t ot h ew i n e T h ec o n c e n t r a t i o no f5k i n d so ff l a v a n 一3 一o l s，e s p e c i a l l yC A Ta n dE C，w e r ea Ui n c r e a s e d C A Ta n dE C，a so n eg r o u p，g e tt h eh i g h e s ta t5“d a yo ft h ef e r m e n t a t i o n，A st h
15、 eo t h e rg r o u p，E C G,E G C,E G C Gg e tt h eh i 曲e s ta tt h ef i r s td a yo ft h ef e r m e n t a t i o n D u r i n gt h ea g i n gi nt h eo a kb a r r e l，t h ec o n c e n t r a t i o no fC A T,E C，a n dE C Gw e r ei n c r e a s e d，a n dE G Cw a sd e c r e a s e dd r a m a t i c a l l y T
16、h ec o n c e n t r a t i o na n dt h el l 屺a nd e g r e ep o l y m e r i z a t i o n(m D P)o fp r o a n t h o c y a n i d i n sd e c r e a s e d，w h e r e a st h ec o m p o s i t i o no fp r o a n t h o c y a n i d i nc h a n g e ds l i g h t l y T h ec h a n g e so nt h ec o n c e n t r a t i o na
17、n dc o m p o s i t i o no ff l a v a n-3-o l sa n dp r o a n t h o c y a n i d i n si nd i f f e r e n tt i s s u ew e r es t u d i e dd u r i n gt h ed e v e l o p m e n to fg r a p eb e r r yb yu s i n g7-y e a r so l dC a b e m e tS a u v i g n o n(H t i sv i n 盼阳L)a n dC h a r d o r m a y(H t i
18、sv m i f e r aL)b e r r y F l a v a n-3-o l sa n dp r o a n t h o c y a n i d i n sw e r em a i n l ya c c u m u l a t e di nt h es k i na n ds e e d sd u r i n gt h eg r a p eb e r r yd e v e l o p m e n t D u r i n gt h eg r a p eb e r r yd e v e l o p m e n to fC a b e m e tS a u v i g n o n，f l
19、a v a n-3-o l si nt h es k i ng o th i g h e s ta tt h e2 0d a y sa f t e rf u l lb l o o m，a n dt h e nd e c l i n e d P r o a n t h o c y a n i d i n sw e r er e a c h e dh i g h e s ta tt h e2 0d a y sa n d5 0 6 0d a y sa f t e r f u l lb l o o m a n dt h e nd e c r e a s e dd u r i n gt h er i p
20、 e n i n g 1 ut h es e e d s,f l a v a n-3-o l sm o n o m e r s，p l o a n t h o c y a n i d i n si n c f e a s e du pt ov e r a i s o n(7 0d a y sa f t e rf u l lb l o o m),5 0d a y sa f t e rb l o o m，r e s p e c t i v e l y,b u td e c l i n e dt h e r e a f t e r T h ec h a n g e so ff l a v a n-3
21、 o l sa n dp m a n t h o c y a n i d i n si I lt h eC h a r d o n n a yw e r el i k e l yt ot h eC a b e r n e tf l a n v l g n o n U s e dt h eg r a p eb e r r yo fC a b e r n e tS a u v i g n o na n dC h a r d o r m a y,t h ee x p r e s s i o no fg e n ei n v o l v e dt h ep r o a n t h o c y a n
22、i d i n sb i o s y n t h e s i s，C H S，F 3 H，D F R，a n dL D O Xi ns k i n，f l e s h，a n ds e e d sd u r i n gg r a p eb e r r yd e v e l o p m e n tw e r ee x a m i n e db yR T-P C R A l lo ft h eg e n e sw e t ee x p r e s s e di nt h es k i n，f l e s ha n ds e e d，b u tt h ep a t t e r no fe x p r
23、 e s s i o ni nd i f f e r e n tt i s s u e st e s t e dw a sd i f f e r e n t T h em R N Al e v e le n c o d i n gP A LC H S，F 3 H，D F R，a n dL D O Xw e r eh i g ha t2 0d a y sa f t e rf u l lb l o o mi na l lt i s s u e s，a n dt h e nd e c r e a s e de x c e p ti nt h es k i no fC a b e r n e tS a
24、 u v i g n o n T h ei n d u c e m e n to fS Ao nt h eg e n e si n v o l v e dt h ep r o a n t h o c y a n i d i n sb i o s y n t h e s i sw e r ed e t e c t e db yu s i n g nv i v op r e i n c u b a t i o no ft h eg r a p eb e r r yt i s s u ea n dl o wp r e s s u r ep e n e t r a t i o no fg r a p
25、eb e r r yi nt h eS A-c o n t a n i e dm e d i u m T h er e s u l t ss h o w e dt h a tS Ac o u l di n d u c et h ee x p r e s s i o no fP A LC H S，F 3 H，D F R，a n dL D O Xg e n e，a n dt h em R N Aa c c u m u l a t i o nr e a c h e dm a x i m u ma t3 0m i n，1 6 2 4hr e s p e c t i v e l y T oo u rk
26、n o w l e d g e，i ti st h ef i r s tt i m et or e p o r tt h ei n d u c e m e n to fS Ao nt h eg e n e si n v o l v e dt h ep r o a n t h o c y a n i d i n sb i o s y n t h e s i si ng r a p eb e r r y K e yw o r d s：g r a p eb e r r y,w i n e，f l a v a n-3 一o l s，p r o a n t h o c y a n i d i n s，H
27、 P L C，R T-P C R图表清单图1 1 几类主要的类黄酮物质结构示意图F i g 1 1S t r u c t u r e o f m a i ns u b c l a s s e s o f f l a v o n o i d l图1 2 黄烷3 一醇结构示意图F i g 1 2S t r u c t u r eo f f l a v a n-3 一o l s。“2图1 3 原花色素结构示意图F i g 1 3 S t r u c t u r e o f p r o a n t h o c y a n i d i n。3图1 4 A、B 型原花色素的结构F i g 1 4S t r
28、 u c t u r eO f A B t y p ep r o a n t h o c y a n i d i n。3图1 5 黄烷3 一醇、原花色素生物合成途径F i g 1 5B i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f f l a v a n-3-o l sa n dp r o a n t h o c y a n i d i n。”9图1 6 四种(表)儿茶素异构体及A N R 反应机理F 遮1 6 F o u rc a t e c h i n i e p i c a t e c h i r t i s o m e r sa n d p o t e n
29、 t i a l m e c h a n i s m so f t h e A N Rr e a c t i o n 1 1图1 7B 型原花色素缩合机理假说F i g1 7 P o t e n t i a l m e c h a n i s m so f B-t y p e p r o a n t h o c y a n i d i n 1 3表1 1 拟南芥中参与原花色素生物合成的转录因子(D i x o n 等，2 0 0 5)T a b l e1 1T r a n s c r i p t i o nf a c t o r si n v o l v e di np r o a n t h
30、 o c y a n i d i nb i o s y n t h e s i si nA r a b i d o p s i sf D i x o ne ta 1，2 0 0 5)_ _。1 5表2 1 黄烷3 醇及其衍生物吸收范围和最大吸收峰T a b l e 2 1 A b s o r b a n c er a n g ea n d m a x i m u ma b s o r b a n c e o f 5 f l a v a n 一3-o l s 2 3图2 1 五种黄烷-3 一醇标样色谱图F i g 2 1C h r o m a t o g r a p h o f 5f l a v
31、 a n-3-o l s _。_。2 3图2 2 样品色谱图F i g 2 2 C h r o m a t o g r a p ho f S a m p l e 2 3表2 2 五种黄烷3 醇及其衍生物的保留时间、回归方程和检出限T a b l e 2 2R e t e n t i o nt i m e，r e g r e s s i o ne q u a t i o n s，d e t e c t i o nl i m i t so f f l a v a n-3-o l s 2 4表2 _ 3 色谱稳定性检验T a b l e 2 3R e s u l t so fr e p e a t
32、a b i l i t y f o rs a m p l et e s t(n=5)2 4表2 4 精密度和加标回收实验结果(n=4)T a b l e 2 4R e s u l t so f p r e c i s i o na n dr e c o v e r yt e s t(n=4)2 5I V图2 3r 醇盐酸法标准曲线F i g 2,3S t a n d a r dC n l N eo f B u O H-H C l 2 8表2,5T S K H W-5 0(F)柱回收率(n=3)T a b l e 2 5R e c o v e r ye f f i c i e n c yo f
33、T S K H W-5 0(F)(n=3)2 9图2 4 三种黄烷3 醇标准品色谱图F i g 2 4H P L Cc h r o m a t o g r a mo f 3f l a v a n o l o l s 2 9图2 5 样品P A 酸解后色谱刚F i g 2 5 H P L C c h r o m a t o g r a m o f p r o a n t h o c y a n i d i nc l e a v a g e p r o d u c t s f r o m S a m p l e 2 9表2 6=种黄烷_ 3 一醇的保留时间、同归方程和检出限T a b l e 2
34、6R e t e n t i o nt i m e，r e g r e s s i o ne q u a t i o n s，d e t e c t i o nl i m i t so f 3f l a v a n-3-o l s 3 0表2 7 色谱重复性检验结果T a b l e 2 7 R e s u l t s o fr e p e a t a b i l i t y f o rs a m p l e t e s t(n=3)。3 0表2 8 精密度和加标回收实验结果(n=4)T a b l e 2 8R e s u l t so f p r e c i s i o na n dr e
35、 c o v e r yt e s t(n=z n。“3 1表3 1 葡萄酒样品表T a b l e3 1L i s to f t h ea n a l y z e dw i n es a m p l e s 一3 4图3 1 不同类型葡萄酒中黄烷-3 醇的含量F i g 3 1C o n t e n t s o f f l a v a n-3-o l s i n t h e d i f f e r e n t k i n do f w i n e s 3 6图3 2 不同类型葡萄酒中原花色素的含量F i g 3 2C o n t e n t so f p r o a n t h o c y
36、a n i d i n si nd i f f e r e n tk i n d so f w i n e s 3 6表3 2 不同类型葡萄酒中原花色素平均聚合度及其组成T a b l e3 2 m D P,C o m p o s i t i o no f P o l y m e r i c P r o a n t h o c y a n i d i n i n5k i n d s o f W i n e s(=3)。”3 7表3 3 不同年份酒红葡萄酒中黄烷3 醇含量T a b l e3,3 C o n t e n t s(m g，L)o f f l a v a n-3 一o l s i n
37、 t h er e d w i n e s(n=3)3 7表3 4 不同年份红葡萄酒中原花色素的组成T a b l e3 4c o m p o s i t i o no f p r o a n t h o c y a n i d i n si nr e dw i n e s(n=3)3 8图4 1 赤霞珠、霞多丽发酵期问糖度、温度、黄烷一3 一醇及其衍生物变化F i g 4 1C h a n g e so fs u g a r,t e m p e r a t u r e，f l a v a n 3-o l sa n di t sd e r i v a t i v e sd u r i n gf
38、 e r m e n t a t i o no fC a b e r n e tS a u v i g n o na n dC h a r d o n n a y 4 3表4 1 赤霞珠、霞多丽发酵期间黄烷3 醇含量与糖度相关分析T a b l e4 1R e g r e s s i v ea n a l y s i sb e t w e e nf l a v a n-3-o l sa n ds u g a rd u r i n gf e r m e n t a t i o no fc a b e r n e tS a u v i g n o na n dC h a r d o n n a y
39、 4 4V图4 2 贮藏对葡萄酒中5 种黄烷3 醇及其衍生物的影响F i g4 2 E f f e c t o fs t o r i n g o nc o n c e n t r a t i o n o f 5 f l a v a n-3-o l sa n d i t s d e r i v a t i v e s 4 5图4 3 办霞珠和霞多丽发酵过程中原花色素含量、糖度及温度变化F i g 4 3C h a n g e so nt h ec o n c e n t r a t i o no fp r o a n t h o c y a n i d i n，s u g a La n dt e
40、 m p e r a t u r ed u r i n gf e r m e n t a t i o no f C a b e m e tS a u v i g n o na n dC h a r d o n n a y 4 9表4 2 赤霞珠、霞多丽发酵期间原花色素含量、组成与糖度相关分析T a b l e4 2R e g j e s s i v ea n a l y s i sb e t w e e nc o n c e n t r a t i o n，c o m p o s i t i o no fp r o a n t h o c y a n i d i n sa n ds u g a
41、 rd u r i n g f e r m e n t a t i o no f C a b e r n e t S a u v i g n o na n d C h a r d o n n a y。”4 9图4 4 赤霞珠、霞多丽发酵期问原花色素总摩尔数的变化F i g 4 4C h a n g e so nm o l eo fp r o a n t h o c y a n i d i n sd u l i n gf e r m e n t a t i o no fC a b e m e tS a u v i g n o na n dC h a r d o n n a y。”5 0图4 5
42、赤霞珠和霞多丽发酵期间原花色素组成变化F i g 4 5C h a n g e s0 1 1t h ec o m p o s i t i o no fp r o a n t h o c y a n i d i nd u r i n gf e r m e n t a t i o no fC a b e m e tS a u v i g n o na n dC h a r d o n n a y 5 1表4 3 贮藏对原花色素组成的影响T a b l e4 3 E f f e c to fs t o r i n g o n t h ec o m p o s i t i o n o f p r o
43、a n t h o c y a n i d i n 5 2图4 6 不同类型橡木桶对黄烷3 醇及其衍生物的影响F i g 4 6 E f f e c t o f d i f f e r e n t o a kb a r r e l o n t h ec o n c e n t r a t i o n o f f l a v a n-3 o l sa n d i t sd e r i v a t i v e s。5 6图4 7 不同类型橡木桶对原花色素含量和平均聚合度的影响F i g 4 7 E f f e c to f d i f f e r e n t o a kb a r r e lo n
44、 t h ec o n c e n t r a t i o na n d m D P o f p r o a n t h o c y a n i d i n s 5 6图4 8 不同类型橡木桶陈酿过程中黄烷3 醇及其衍生物的变化F i g 4 8C h a n g e so nc o n c e n t r a t i o no ff l a v a n-3-o l sa n di t sd e r i v a t i v e si nd i f f e r e n to a kb a r r e ld u r i n ga g i n g 5 7图4 9 不同类型橡术桶陈酿过程中原花色素平均
45、聚合度的变化F i g 4 9 C h a n g eo n m D P o f p r o a n t h o c y a n i d i n s i nd i f f e r e n to a kb a r r e l d u r i n ga g i n g 5 7图4 1 0 不同类型橡木桶陈酿过程中原花色素起始单元的变化F i g 4 1 0C h a n g e sO i lt e r m i n a lu n i t so fp r o a n t h o c y a n i d i n si nd i f f e r e n to a kb a r r e ld u r i n
46、 ga g i n g 5 8图4 1 1 不同类型橡本桶陈酿过程中原花色素延伸单元的变化F i g 4 11C h a n g e so ne x t e n s i o n a lu n i t so fp r o a n t h o c y a n i d i n si nd i f f e r e mo a kb a r r e ld u r i n ga g i n g 5 9图5 1 葡萄果实发育过程F i g 5 1T h ed e v e l o p m e n to fg r a p eb e n y 6 3表5 1 葡萄果实发育过程中不同部位黄烷一3 一醇含量变化V lT
47、a b l e5 1C o n c e n t r a t i o no ff l a v a n-3-o l si ns k i n，f l e s h，a n ds e e dd u r i n gg r a p eb e r r yd e v e l o p m e n t。”6 4图5 2 葡萄果实发育不同时不同部位黄烷_ 3-醇的含量变化F i g 5 2C h a n g eo f f l a v a n-3-o l si nd i f f e r e n tt i s s u ed u r i n gg r a p eb e r r yd e v e l o p m e n t6
48、 5图5 3 葡萄果实发育过程中不同部位原花色素的积累F i g 5 3C h a n g e so fp r o a n t h o c y a n i d i n si ns k i n，f l e s h，a n ds e e dd u r i n gg r a p eb e r r yd e v e l o p m e n tt。7 0图5 4 葡萄果实发育过程中原花色素含量的变化F i g 5 4 C h a n g e o nc o n c e n t r a t i o no f p r o a n t h o c y a n i d i n sd u r i n g g r a
49、 p e b e r r y d e v e l o p m e n t 7 1图5 5 葡萄果实发育过程中不同部位原花色素平均聚合度的变化F i g 5 5C h a n g eo nm D Po fp r o a n t h o c y a n i d i n si nd i f f e r e n tt i s s u ed u r i n gg r a p eb e r r yd e v e l o p m e n t。7 l图5 6 果实发育过程中原花色素起始单元的变化F i g，5 6C h a n g eo nt h et e r m i n a lu n i t so fp r
50、 o a n t h o c y a n i d i n sd u r i n gg r a p eb e r r yd e v e l o p m e n t。7 2图5 7 泉实发育过程中原花色素延伸单元的变化F i g 5 7C h a n g eo nt h ee x t e n s i o nu n i t so f p r o a n t h o c y a n i d i n sd u r i n gg r a p eb e r r yd e v e l o p m e n t。7 4圈6 1 异硫氰酸胍法、C T A B 法提取总R N A 效果F i g 6 1E l e c