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1、原生质体融合进技术与基因改组技术第1页，本讲稿共11页原生质体融合技术 原生质体融合技术是一种通过人为的方法，是遗传性状不原生质体融合技术是一种通过人为的方法，是遗传性状不同的体细胞的原生质体发生融合，并发生遗传重组以产生同的体细胞的原生质体发生融合，并发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗产性状稳定的融合子的过程。同时带有双亲性状的、遗产性状稳定的融合子的过程。真核细胞和原核细胞都可以进行原生质体融合。原生质体真核细胞和原核细胞都可以进行原生质体融合。原生质体融合可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进融合可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。行。第2页，本讲稿共11页第
2、3页，本讲稿共11页第4页，本讲稿共11页原生质体制备 主要是在主要是在高渗溶液高渗溶液中加入中加入细胞壁分解酶细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性切活性 影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素（1 1）菌体的前处理）菌体的前处理（2 2）菌体的培养时间）菌体的培养时间（3 3）酶浓度）酶浓度（4 4）酶处理温度）酶处理温度（5 5）破壁时的）破壁时的phph值值（6 6）渗透压稳定剂）渗透压稳定剂第5页，本讲稿共11页原生质体融合 制备好的二亲本原生质体可
3、通过融合剂的作用进行融制备好的二亲本原生质体可通过融合剂的作用进行融合，融合剂有化学融合剂和物理融合剂。现在普遍采用合，融合剂有化学融合剂和物理融合剂。现在普遍采用的是的是PEGPEG（聚乙二醇）介导的化学融合法。（聚乙二醇）介导的化学融合法。影响原生质体融合的因素影响原生质体融合的因素（1 1）PEGPEG（2 2）无机离子）无机离子（3 3）温度）温度（4 4）亲株的亲缘关系）亲株的亲缘关系（5 5）原生质体的活性）原生质体的活性（6 6）细胞浓度）细胞浓度第6页，本讲稿共11页原生质体再生 融合后的原生质体在加稳定剂的再生培养基上能重新形成细融合后的原生质体在加稳定剂的再生培养基上能重新
4、形成细胞壁，恢复正常的细胞形态，并能生长繁殖，形成菌落。胞壁，恢复正常的细胞形态，并能生长繁殖，形成菌落。影响原生质体再生的因素影响原生质体再生的因素（1 1）菌种本身特性）菌种本身特性（2 2）原生质体制备条件）原生质体制备条件（3 3）再生培养基成分）再生培养基成分（4 4）再生培养条件）再生培养条件第7页，本讲稿共11页基因组改组技术 基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一种菌种选育新技术，首先选择一个原始亲株，通过经典的诱种菌种选育新技术，首先选择一个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得多个表型得到提高的菌株，构建突变候选株
5、变育种方法获得多个表型得到提高的菌株，构建突变候选株文库，以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融合的直接亲文库，以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融合的直接亲株，然后进行多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获株，然后进行多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌株作得第一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮的多亲株融合，为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株 第8页，本讲稿共11页第9页，
6、本讲稿共11页 Genome shuffling 技术的具体方法 从基因组改组技术的原理来看，进行基因组改组，首先要从基因组改组技术的原理来看，进行基因组改组，首先要运用诱变育种的方法，以获得目的性状得到改进的正向突变运用诱变育种的方法，以获得目的性状得到改进的正向突变菌株的基因组库，并作为首轮多亲株融合的直接亲株。诱变菌株的基因组库，并作为首轮多亲株融合的直接亲株。诱变育种的具体操作要根据不同菌种的特性而异。然后进行多亲育种的具体操作要根据不同菌种的特性而异。然后进行多亲株的递推式融合（株的递推式融合（recursive fusionrecursive fusion）。递推式融合的操作方法与原生质体融合技术基本相同，递推式融合的操作方法与原生质体融合技术基本相同，首先要进行原生质体制备，随后是原生质体融合、再生、首先要进行原生质体制备，随后是原生质体融合、再生、鉴定和挑选等鉴定和挑选等 。第10页，本讲稿共11页第11页，本讲稿共11页