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1、酶促反应动力学实验本讲稿第一页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响。观察底物浓度对酶促反应速度的影响。2.2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响。观察抑制剂对酶促反应速度的影响。3.3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的k km m值。值。本讲稿第二页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 酶促反应动力学酶促反应动力学:影响酶促反应速度影响酶促反应速度(V)(V)的因素的因素:研究酶促反应的速度以及研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学影响此速度的各种因素的科学。1.1.底物浓度底物浓度 S 2.
2、S 2.酶的浓度酶的浓度 3.3.温度温度 4.pH 4.pH5.5.酶的激活剂酶的激活剂 6.6.酶的抑制剂酶的抑制剂本讲稿第三页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷（一）底物浓度对酶促反应速度的影响（一）底物浓度对酶促反应速度的影响 当底物浓度较低时当底物浓度较低时,V,V随随SS的增大而急剧上升的增大而急剧上升,两者两者成正比关系成正比关系.随着底物浓度继续增加随着底物浓度继续增加,反应速度增加反应速度增加,而幅度不断下降而幅度不断下降,若继续加大若继续加大SS反应速度就不再增反应速度就不再增加加,达到一个极限值达到一个极限值V Vmax.max.VmaxS(V)本讲稿第四页，
3、共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷SS与与V V的关系的关系:米米-曼氏方程曼氏方程Vmax-Vmax-最大反应速度最大反应速度 Km-Km-米氏常数米氏常数当当V V1/2Vmax1/2Vmax时，时，KmKmS S KmKm值的物理意义值的物理意义:即即KmKm值是当酶反应速率达到最大值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。反应速率一半时的底物浓度。本讲稿第五页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷KmKm和和VmaxVmax值的测定值的测定 (1)(1)测定不同底物浓度的反应初速率，以测定不同底物浓度的反应初速率，以V-SV-S作作 图可图可以得到以得到V V
4、maxmax，再从，再从1/2V1/2Vmaxmax，可求得相应的，可求得相应的 SS，即，即K Km m值。值。Vmax VmaxSvKm本讲稿第六页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 (2)(2)双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒 数，以数，以1/V-1/S1/V-1/S作图，得出一直线作图，得出一直线.KmKm和和VmaxVmax值的测定值的测定本讲稿第七页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷（二）抑制剂对酶促反应速度的影响（二）抑制剂对酶促反应速度的影响 酶的抑制剂：酶的抑制剂：抑制作抑制作用类型用类型可逆性可逆性不可逆性不可
5、逆性竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制 凡能降低酶的活性，甚至使酶完凡能降低酶的活性，甚至使酶完 全全丧失活性，但不使底物变性的物质。丧失活性，但不使底物变性的物质。本讲稿第八页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷1.竞争性抑制曲线图竞争性抑制曲线图 竞争性抑制剂与酶的底物竞争性抑制剂与酶的底物结构相似结构相似,与底物竞争酶的活与底物竞争酶的活性中心性中心,从而阻碍酶与底物的从而阻碍酶与底物的结合结合.特点特点:（1 1）V V下降下降，发生抑制，发生抑制（2 2）VmaxVmax不变不变（3 3）KmKm增大增大，亲和力下降，亲和力下降本讲稿第九页
6、，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷2.非竞争性抑制曲线图非竞争性抑制曲线图 抑制剂与酶活性中心以外抑制剂与酶活性中心以外的必需基团结合的必需基团结合,不影响酶与底不影响酶与底物的结合物的结合,底物与抑制剂之间没底物与抑制剂之间没有竞争关系有竞争关系.特点特点:（1 1）V V下降，下降，发生抑制发生抑制（2 2）VmaxVmax减小减小（3 3）KmKm不变不变本讲稿第十页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷3.反竞争性抑制曲线图反竞争性抑制曲线图特点特点:(1)(1)V V下降下降，发生抑制，发生抑制(2)(2)VmaxVmax减小减小(3)(3)KmKm减小减小本讲稿
7、第十一页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷（三）本次实验方案（三）本次实验方案碱性碱性磷酸苯二钠磷酸苯二钠 本次实验以本次实验以 为底物为底物,为催化剂为催化剂,作为抑制作为抑制剂，分别观察无抑制剂和有抑制剂时底物剂，分别观察无抑制剂和有抑制剂时底物浓度与酶促反应速度之间的关系浓度与酶促反应速度之间的关系。磷酸酶磷酸酶AKPAKP磷酸氢二钠磷酸氢二钠本讲稿第十二页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=O H3C-NOH+C6H5NH3C-NH3C-CC-N=C=O H3C-NOK3Fe(CN)6OH-4-氨基安替比林氨基安替比林醌
8、衍生物醌衍生物O-P=OONaONa磷酸苯二钠磷酸苯二钠+H2O AKPOHHO-P=OONaONa+酚酚 醌衍生物为红色醌衍生物为红色,根据红色深浅测出光密度值根据红色深浅测出光密度值,计算不同底计算不同底物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）物浓度时酶的反应速度（以产物的生成量表示）,以以1/V-1/S1/V-1/S双倒数作图，获得双倒数作图，获得KmKm值。值。本讲稿第十三页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷添加试剂（两人一组，添加试剂（两人一组，1 1人人按照按照p45 p45，另，另1 1人按照人按照p50 p50 的要求量取溶液）的要求量取溶液）3737摄氏度水浴准
9、摄氏度水浴准确保温确保温1515分钟分钟立即加入碱性溶立即加入碱性溶液液1.10ml1.10ml终止反终止反应应0.3%4-0.3%4-氨基氨基安替比林安替比林1.00ml1.00ml0.5%0.5%铁铁氰化钾氰化钾2.00ml2.00ml每步充分混匀每步充分混匀,室温放置室温放置1010分分钟钟以以0 0管调零管调零,波长波长510nm510nm比比色色本讲稿第十四页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 计算公式计算公式 1.1.计算出无抑制剂和有抑制剂时各管中底物浓度计算出无抑制剂和有抑制剂时各管中底物浓度S S.2.2.计算出无抑制剂和有抑制剂时各管的反应速度计算出无抑制剂和有
10、抑制剂时各管的反应速度V V.反应速度用产物的生成量来表示反应速度用产物的生成量来表示:每每mlml酶液在酶液在3737反应反应1515分钟产生酚的量分钟产生酚的量S=CS=C基质液基质液VV基质液基质液/V/V总总产物生成量产物生成量=A=A测测/A/A标标 C C标酚标酚 V V标酚标酚 1ml/0.1ml 1ml/0.1ml本讲稿第十五页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷12345678标标A AA Ai i表表1.1.不同底物浓度时溶液的光密度值不同底物浓度时溶液的光密度值 12345678标标 S (mol/L)1/S (mol/L)-1 V (mg/15min)1/V
11、(mg/15min)-1 Vi (mg/15min)1/Vi (mg/15min)-1 计算结果计算结果 表表2.2.底物浓度及反应速度底物浓度及反应速度本讲稿第十六页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 作图作图 1/S1/S1/V1/V-1/K-1/Km m 根据图获得根据图获得Km,Km,并判并判断磷酸氢二钠为何种抑制断磷酸氢二钠为何种抑制剂剂.时间时间:仪器型号仪器型号:仪器编号仪器编号:作图者作图者:1/Vmax本讲稿第十七页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.两人一组，一人做无抑制剂的，另一人做有抑制剂的两人一组，一人做无抑制剂的，另一人做有抑制剂的实验
12、。实验。2.2.取样量准确取样量准确,保温准确，加样顺序要一致，每步均混匀。保温准确，加样顺序要一致，每步均混匀。3.3.同一组实验用相同的比色计。同一组实验用相同的比色计。4.4.作图时作图时,实验点不在同一条直线上时实验点不在同一条直线上时,尽量使各点平均尽量使各点平均分布在直线的两侧分布在直线的两侧,两图画在同一坐标纸上两图画在同一坐标纸上,便于判断。便于判断。本讲稿第十八页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.米氏常数（米氏常数（KmKm）有无单位？为什么？）有无单位？为什么？2.2.本实验中能否不用计算反应速度，直接以各管本实验中能否不用计算反应速度，直接以各管 测得
13、的光密度代表各管中酶的反应速度行不行？测得的光密度代表各管中酶的反应速度行不行？为什么？为什么？3.3.如果不用本实验原理中所列的几种变换公式，如果不用本实验原理中所列的几种变换公式，是否还可以从实验结果求出是否还可以从实验结果求出KmKm值值?如有应如何求？如有应如何求？思思 考考本讲稿第十九页，共二十页 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 下次实验预习下次实验预习 1.1.核酸的分类，以及在细胞中的分布情况。核酸的分类，以及在细胞中的分布情况。2.2.核酸的组成。核酸的组成。3.3.离心技术的定义及离心机的正确使用。离心技术的定义及离心机的正确使用。4.4.实验六的实验原理及操作。实验六的实验原理及操作。本讲稿第二十页，共二十页