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1、第四章蛋白质的共价结构生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期本讲稿第一页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期Chapter4 Protein的共价结构的共价结构第一节第一节 蛋白质通论蛋白质通论 蛋白质蛋白质存在于所有的生存在于所有的生物细胞中，是构成生物物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和体最基本的结构物质和功能物质。功能物质。蛋白质蛋白质是生命活动的物是生命活动的物质基础，它参与了几乎质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。所有的生命活动过程。Protein本讲稿第二页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与
2、环境工程学院2003/2004学年第1学期 早在早在18781878年，思格斯就在反杜林论中指出：年，思格斯就在反杜林论中指出：“生命是蛋生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。学组成部分的不断的自我更新。”可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。在方式的本质就是蛋白体与其外
3、部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断。木瓜蛋白酶（组织蛋白酶）木瓜蛋白酶（组织蛋白酶）本讲稿第三页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期（一）蛋白质的化学组成和分类（一）蛋白质的化学组成和分类1 1、蛋蛋白白质质是是一一类类含含氮氮有有机机化化合合物物，除除含含有有C、H、O外外，还还有有N和和少少量量的的S、P 。某某些些蛋蛋白白质质还还含含有有其其他他一一些些元元素素，主主要要是是P P、Fe、Cu、Co、Mn、Zn等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：等。这些元素
4、在蛋白质中的组成百分比约为：碳碳 50 50 氢氢 7 7 氧氧 23 23 氮氮 16%16%硫硫 0 03 3 其他其他 微微 量量Protein本讲稿第四页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期2 2 2 2、蛋白质的含氮量、蛋白质的含氮量、蛋白质的含氮量、蛋白质的含氮量氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由由于于大大多多数数蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量接接近近于于16%16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋蛋白白质质含含量量（克克%）=每每克克生生物物样样品品
5、中中含含氮氮的的克克数数 6.256.25本讲稿第五页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期3 3 3 3、蛋白质的大小与分子量、蛋白质的大小与分子量、蛋白质的大小与分子量、蛋白质的大小与分子量 蛋白质是分子量（蛋白质是分子量（MrMr）很大的生物分子。对任一）很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。均一的蛋白质。4、蛋白质的分类、蛋白质的分类什么叫单纯蛋白质、缀合蛋白质？
6、辅基（或配体）？分类方法（什么叫单纯蛋白质、缀合蛋白质？辅基（或配体）？分类方法（158页）；页）；球状蛋白质、纤维状蛋白质、膜蛋白（质）；球状蛋白质、纤维状蛋白质、膜蛋白（质）；单体蛋白质、寡聚蛋白质、亚基（亚单位）；单体蛋白质、寡聚蛋白质、亚基（亚单位）；本讲稿第六页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期（二）蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次（二）蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象。为了表示蛋白质结构的不同组织层次，一般采用下列专门术语：Protein的一级结
7、构（的一级结构（primary structure)Protein的二级结构（的二级结构（secondary structure)Protein的三级结构的三级结构(tertiary structure)Protein的四级结构（的四级结构（quarternary structure)（三）蛋白质功能的多样性（三）蛋白质功能的多样性（160页）页）本讲稿第七页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期一、一、Amino acid 的连接方式的连接方式肽键肽键(peptide bond)二、肽（二、肽（peptide)1、定义：、定义：Amino acid
8、 通过肽键连接起来的化合物称为肽。通过肽键连接起来的化合物称为肽。2、分类：寡肽、分类：寡肽(oligopeptide)、多肽和游离活性肽（如谷胱苷肽（、多肽和游离活性肽（如谷胱苷肽（GSH）、）、脑啡肽、生长素、催产素等）。脑啡肽、生长素、催产素等）。三、多肽链（三、多肽链（polypeptide chain)1、氨基末段（、氨基末段（-NH2）和羧基末端（）和羧基末端（-COOH）2、命名：、命名：“某氨基酰某氨基酰某氨基酰某氨基酰 某氨基酸某氨基酸”3、肽链和肽键；主链和侧链；氨基酸残基、肽链和肽键；主链和侧链；氨基酸残基 4、二硫键、链内二硫键和链间二硫键、二硫键、链内二硫键和链间二硫
9、键第二节第二节 多多 肽肽本讲稿第八页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期肽和肽键的结构肽和肽键的结构肽和肽键的结构肽和肽键的结构 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键酰胺键称为称为肽键肽键，所形成的化合物称为肽。，所形成的化合物称为肽。l由由两两个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为二二肽肽，由由多多个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽则则称称为为多多肽肽。组组成成多多肽肽的的氨氨基基酸酸单单元元称称为为氨氨基基酸残基。酸残基。本讲稿第九页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与
10、环境工程学院2003/2004学年第1学期在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或氨基，称为氨基端或N-N-端；端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或羧基，称为羧基端或C-C-端。端。氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨基酸残基为终点端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln本讲稿第十页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期
11、 肽肽肽肽 键键键键 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面酰胺平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。本讲稿第十一页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期肽键肽键肽肽键键中中的的C-NC-N键键具具有有部部分分双双键键性性质，不能自由旋转。质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构在大多数情况下，以反式结构存在。存在。本讲稿第十二页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期四肽的结构四肽的结构本讲稿第十三页，共三十七页
12、生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期本讲稿第十四页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。本讲稿第十五页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-CO
13、O-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽脑啡肽 Leu-脑啡肽脑啡肽本讲稿第十六页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-ValL-OrnL-OrnL-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短杆菌肽短杆菌肽S(S(环十肽环十肽)由细菌分泌的多肽，有时也都含有由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-D-氨基酸氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine,Ornithine,缩写为缩写为 OrnOrn）。）。本讲稿第十七页，共三十七页生物化学
14、主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期第三节第三节 蛋白质的水解蛋白质的水解l蛋白质分子量的上下限是人为规定的，蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。义。l某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基亚基(多肽链多肽链)通过非共价结合而成的，通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。子量可高达数百万甚至数千万。本讲稿第十八页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期1 1
15、 1 1、酸水解、酸水解、酸水解、酸水解常常用用6 6 mol/Lmol/L的的盐盐酸酸或或4 4 mol/Lmol/L的的硫硫酸酸在在105-110105-110条件下进行水解，反应时间约条件下进行水解，反应时间约2020小时。小时。此此法法的的优优点点是是不不容容易易引引起起水水解解产产物物的的消消旋旋化化。缺缺点点是是色氨酸色氨酸被沸酸完全破坏；被沸酸完全破坏；含含有有羟羟基基的的氨氨基基酸酸如如丝丝氨氨酸酸或或苏苏氨氨酸酸有有一一小小部部分分被被分分解解；门门冬冬酰酰胺胺和和谷谷氨氨酰酰胺胺侧侧链链的的酰酰胺胺基基被被水水解解成成了羧基。了羧基。本讲稿第十九页，共三十七页生物化学 主讲
16、 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期2 2 2 2、碱水解、碱水解、碱水解、碱水解一般用一般用5 mol/L5 mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-2010-20小时。小时。由由于于水水解解过过程程中中许许多多氨氨基基酸酸都都受受到到不不同同程程度度的的破破坏坏，产率不高。产率不高。部分的水解部分的水解产物发生消旋化产物发生消旋化。该法的优点是该法的优点是色氨酸色氨酸在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。本讲稿第二十页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期3 3 3 3、酶水解（重点掌握、酶水解（重点掌握、酶水解（重点掌握、酶水
17、解（重点掌握173173173173页）页）页）页）目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzymeproteolytic enzyme）或称蛋白酶）或称蛋白酶（proteinaseproteinase）已有十多种。）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的化。水解的产物为较小的肽肽段。段。最常见的蛋白水解酶有以下几种：最常见的蛋白水解酶有以下几种：本讲稿第二十一页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期Tryps
18、in ：R1=R1=赖氨酸赖氨酸LysLys和精氨酸和精氨酸ArgArg侧侧链（专一性较强，链（专一性较强，水解速度快）。水解速度快）。肽链肽链水解位点水解位点胰胰蛋蛋白白酶酶本讲稿第二十二页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：）：R1=R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu，蛋氨酸蛋氨酸MetMet和组氨和组氨酸酸HisHis水解稍慢水解稍慢。肽链水解位点水解位点糜糜蛋蛋白白酶酶本讲稿第二十三页，共三十七页生物
19、化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期Pepsin：R1R1和和R2R2R1=R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu以以及其它疏水性氨基及其它疏水性氨基酸水解速度较快。酸水解速度较快。肽链水解位点水解位点胃胃蛋蛋白白酶酶本讲稿第二十四页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期thermolysin)：R2=R2=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,Phe,色氨酸色氨酸Trp,Trp,酪酪氨酸氨酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu，异亮氨酸，异亮氨酸Il
20、eu,Ileu,蛋氨酸蛋氨酸MetMet以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。肽链水解位点水解位点嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶本讲稿第二十五页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期分别从肽链羧基端和分别从肽链羧基端和氨基端水解氨基端水解肽链水解位点水解位点羧羧肽肽酶酶和和氨氨肽肽酶酶本讲稿第二十六页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期蛋白质是由一条或多条多肽蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链链以特殊方式结合而成的生物大分子。以特殊方式结合而成的生物大分子
21、。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在子量在60006000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大,从大约从大约60006000到到10000001000000道尔顿甚至更大。道尔顿甚至更大。第四节第四节 蛋白质的结构蛋白质的结构本讲稿第二十七页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primary structure)包括包括组成蛋白质的多肽链数目组成蛋白质的多肽链数目.多肽
22、链的氨基酸顺序，多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。生物功能的基础。本讲稿第二十八页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期一、一、Protein的一级结构（的一级结构（primary structure)（一）定义：是指构成蛋白质的各种氨基酸的种类、数量、连接方（一）定义：是指构成蛋白质的各种氨基酸的种类、数量、连接方式式 和排列顺序，由遗传信息（遗传密码）所决定。涉及的化学键是和排列顺序
23、，由遗传信息（遗传密码）所决定。涉及的化学键是肽键和少量的二硫键。肽键和少量的二硫键。（二）研究意义（二）研究意义 1、从分子水平上研究蛋白质的结构和功能，为蛋白质的人、从分子水平上研究蛋白质的结构和功能，为蛋白质的人工合成奠定了物质基础。工合成奠定了物质基础。2、诊断遗传病、合成基因探针等高新技术的研究具有重要、诊断遗传病、合成基因探针等高新技术的研究具有重要意义。意义。本讲稿第二十九页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期二、蛋白质一级结构的测定二、蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研
24、究的基础。自从础。自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定了胰岛素的一测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。一级结构被测定。本讲稿第三十页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期1 1，样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）；以上）；2 2，知道蛋白质的分子量；，知道蛋白质的分子量；3 3，知道蛋白质由几个亚基组成；，知道蛋白质由几个亚基组成；4 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。每种氨
25、基酸的个数。5 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。（1 1）测定蛋白质的一级结构的要求）测定蛋白质的一级结构的要求本讲稿第三十一页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期（2 2）测定步骤）测定步骤1、多肽链的拆分。多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定本讲稿第三十二页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期（2 2 2 2）测定步骤）测定步骤）测定步骤）测定步骤1、多肽链的拆分。多肽链的拆分。几条多肽链借
26、助非共价键连接在一起，称几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚亚基基).).蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定本讲稿第三十三页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期（2 2 2 2）测定步骤）测定步骤）测定步骤）测定步骤2、测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白
27、质分子量之通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定168页以自学为主页以自学为主本讲稿第三十四页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期（2 2 2 2）测定步骤）测定步骤）测定步骤）测定步骤3、二硫键的断裂二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原巯基乙醇处理，使
28、二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。基，以防止它重新被氧化。蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定本讲稿第三十五页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期4 4、测定每、测定每条多肽链条多肽链的氨基酸的氨基酸组成，并组成，并计算出氨计算出氨基酸成分基酸成分的分子比；的分子比；蛋蛋白白质质一一级级结结构构的的测测定定现在已有氨基酸自动分析仪和肽链氨基酸现在已有氨基酸自动分析仪和肽链氨基酸顺序自动测定仪，对蛋白质多肽氨基酸排顺序自动测定仪，对蛋白质多肽氨基酸排列顺序的测定提供了极大的方便。列顺序的测定提供了极大的方便。本讲稿第三十六页，共三十七页生物化学 主讲 吴石金生物与环境工程学院2003/2004学年第1学期第五节第五节 蛋白质的氨基酸序列与生物蛋白质的氨基酸序列与生物学功能学功能（阅读材料（阅读材料181181页）页）现在已有氨基酸自动分析仪和肽链氨基酸顺序自动测定仪，现在已有氨基酸自动分析仪和肽链氨基酸顺序自动测定仪，对蛋白质多肽氨基酸排列顺序的测定提供了极大的方便。对蛋白质多肽氨基酸排列顺序的测定提供了极大的方便。本讲稿第三十七页，共三十七页