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1、第五次普通微生物学实验第1页，共26页，编辑于2022年，星期二二、二、实验原理实验原理n1.1.培养基的概念培养基的概念n是根据微生物满足生长的是根据微生物满足生长的营养营养需求，需求，人工人工配制的混配制的混合营养基质。合营养基质。必需的养分必需的养分 适合的环境适合的环境n不同类的微生物因生理类型不同而表现出不同的营养不同类的微生物因生理类型不同而表现出不同的营养需求所以需求所以不同类的微生物一般采用不同的培养基不同类的微生物一般采用不同的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基细菌专用细菌专用 马铃薯蔗糖培养基马铃薯蔗糖培养基 真菌专用真菌专用 高氏一号培养基高氏一号培养基 放线菌
2、专用放线菌专用第2页，共26页，编辑于2022年，星期二2.2.培养基的分类培养基的分类n（1 1）按存在的物理状态分）按存在的物理状态分 液体培养基液体培养基 （不含凝固剂）（不含凝固剂）半固体培养基（凝固剂半固体培养基（凝固剂琼脂琼脂含含0.2-0.5%0.2-0.5%）固体培养基固体培养基 （凝固剂（凝固剂琼脂琼脂含含1.5-2.0%1.5-2.0%）。）。n（2 2）按照培养基的用途差异分）按照培养基的用途差异分 基础培养基基础培养基 加富培养基加富培养基 选择培养基选择培养基 鉴别培养基鉴别培养基第3页，共26页，编辑于2022年，星期二（3）按组成成分分）按组成成分分n天然培养基天
3、然培养基n合成培养基合成培养基n半合成培养基半合成培养基n琼脂的特性琼脂的特性：成分是多缩半乳糖，绝大多数微生物成分是多缩半乳糖，绝大多数微生物不能分解利用。不能分解利用。96溶解，溶解，45凝固对微生物生凝固对微生物生长没有毒害作用长没有毒害作用n培养基的作用培养基的作用：微生物微生物分离、培养、增殖、保藏及鉴分离、培养、增殖、保藏及鉴定定。第4页，共26页，编辑于2022年，星期二3.3.培养基配制原则培养基配制原则n选择适宜的选择适宜的营养物质营养物质n营养物质浓度及营养物质浓度及配比配比合适合适n控制控制pH条件条件n控制氧化还原电位控制氧化还原电位n原料来源的选择原料来源的选择n根据
4、培养根据培养目的目的不同调配不同调配n灭菌处理灭菌处理第5页，共26页，编辑于2022年，星期二4.配制培养基的步骤配制培养基的步骤n原料的预处理原料的预处理n计算用量计算用量n称量称量n溶解溶解n调调pHpHn过滤过滤 n分装：分装：试管：固体：试管：固体：1/51/5试管；液体：试管；液体：1/4-1/51/4-1/5。三角瓶：三角瓶：1/3-1/21/3-1/2n包扎包扎n灭菌：灭菌：一般培养基，一般培养基，121 121 0 0C,15-30minC,15-30min；含糖培养基：含糖培养基：112 112 0 0C,15-30minC,15-30min；易产生沉淀的物质：分别灭菌后再
5、混合易产生沉淀的物质：分别灭菌后再混合n摆斜面（固体，试管）摆斜面（固体，试管）n无菌检查无菌检查第6页，共26页，编辑于2022年，星期二第7页，共26页，编辑于2022年，星期二四、作业四、作业n2人人1组组n配制配制阿须贝培养基阿须贝培养基2000ml（全班），每（全班），每组用组用250ml三角瓶装三角瓶装120ml；n装蒸馏水装蒸馏水3支，每支支，每支4.5 ml 第8页，共26页，编辑于2022年，星期二注 意 事 项1 1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；2 2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；、蛋白胨极易吸湿，称取
6、时动作要迅速；3 3、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；外溢；4 4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/51/5，液体培养基的装量约为管高的，液体培养基的装量约为管高的1/41/4，三角瓶的装量不超过瓶体的，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2 1/2；5
7、 5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。起污染。第9页，共26页，编辑于2022年，星期二实验实验12 12 灭菌和消毒灭菌和消毒 一、实验目的一、实验目的n学习微生物实验的一些准备方法（灭菌学习微生物实验的一些准备方法（灭菌培养皿的准备、灭菌吸管的准备、无菌培养皿的准备、灭菌吸管的准备、无菌水的准备、培养基平板和斜面的准备等）水的准备、培养基平板和斜面的准备等），为后续实验做准备。，为后续实验做准备。n了解消毒与灭菌应用范围及基本原理，了解消毒与灭菌应用范围及基本原理，学习并掌握实验室常用消毒与灭
8、菌的方学习并掌握实验室常用消毒与灭菌的方法法第10页，共26页，编辑于2022年，星期二二、实验原理二、实验原理 灭菌灭菌是应用理化方法杀灭物体上是应用理化方法杀灭物体上所有所有微生物微生物 消毒消毒是应用理化方法杀灭物体上是应用理化方法杀灭物体上部分部分微生物微生物（主（主要是病原微生物）要是病原微生物）。三三、灭菌的常用方法灭菌的常用方法 物理法：物理法：高温灭菌高温灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌、紫外线灭菌、过滤除菌 化学法：化学药剂杀菌化学法：化学药剂杀菌第11页，共26页，编辑于2022年，星期二高温灭菌高温灭菌干热灭菌干热灭菌(dry heat sterilization)n1.1.火
9、焰灭菌火焰灭菌：酒精灯、接种环：酒精灯、接种环n2.2.干燥热空气箱灭菌：干燥热空气箱灭菌：干燥热空气箱干燥热空气箱160-170160-170,2,2小时小时（利用热空气灭菌（利用热空气灭菌)n适用范围适用范围：金属器皿、玻璃器皿：金属器皿、玻璃器皿第12页，共26页，编辑于2022年，星期二湿热灭菌湿热灭菌(moist heat sterilization)(moist heat sterilization)利用饱和热蒸汽灭菌。利用饱和热蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌锅采用高压蒸汽灭菌锅采用高压高压蒸汽灭菌法蒸汽灭菌法是湿热灭菌的一种。是湿热灭菌的一种。利用水的沸点随水利用水的沸点随水蒸气压力的增
10、加而上升以达到高温灭菌目的的方法蒸气压力的增加而上升以达到高温灭菌目的的方法na 方法方法：一般：一般121（1kg/cm2或或15磅磅/英寸英寸2）20-30min。nb 适用适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。：耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。nc 注意事项注意事项：灭菌开始排净冷空气；灭菌终了，自然缓慢降压回：灭菌开始排净冷空气；灭菌终了，自然缓慢降压回零；灭菌结束，趁热取出物品。零；灭菌结束，趁热取出物品。第13页，共26页，编辑于2022年，星期二高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅原理：原理：利用饱和热蒸汽灭菌。利用水的利用饱和热蒸汽灭菌。利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升以达
11、沸点随水蒸气压力的增加而上升以达到高温灭菌的目的。到高温灭菌的目的。方法：方法：一般一般121（1kg/cm2或或15磅磅/英寸英寸2）20-30min。适用：适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。皿。注意事项：注意事项：灭菌开始，外筒加水，桶盖灭菌开始，外筒加水，桶盖对称拧紧，排净冷空气；对称拧紧，排净冷空气；灭菌终了，自然缓慢降压回零；灭菌终了，自然缓慢降压回零；灭菌结束，趁热取出物品。灭菌结束，趁热取出物品。第14页，共26页，编辑于2022年，星期二四四、高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌操作步骤操作步骤n(1)灭菌前的准备灭菌前的准备：将高压蒸汽灭菌锅的内桶
12、取出，向外锅内加入：将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出，向外锅内加入适量的水，将内桶放入。适量的水，将内桶放入。n(2)装放待灭菌物品装放待灭菌物品：将已包扎好的物品放入内桶。盖上锅盖，以：将已包扎好的物品放入内桶。盖上锅盖，以两两两对称两对称方式同时旋紧螺栓，勿使漏气。方式同时旋紧螺栓，勿使漏气。n(3)加热排气加热排气：接通电源，同时打开排气阀，待见有大量水：接通电源，同时打开排气阀，待见有大量水汽排出时，维持汽排出时，维持3-5min，锅内空气排尽，关上排气阀。，锅内空气排尽，关上排气阀。n(4)升温保压升温保压：压力为压力为1.05kg/cm2,121.3,2030minn(5)出锅出锅；隔断
13、热源，自然降温，；隔断热源，自然降温，待压力表指针回到零待压力表指针回到零，打，打开排气阀，稍等一些时间，再开盖取物。开排气阀，稍等一些时间，再开盖取物。第15页，共26页，编辑于2022年，星期二实验实验13 13 微生物的纯系分离微生物的纯系分离 n1 了解土壤微生物的了解土壤微生物的分离纯化及测数分离纯化及测数的基的基本原理。本原理。n2 学习并掌握学习并掌握微生物微生物分离纯化分离纯化技术方法技术方法。n3 学习并掌握学习并掌握微生物平板菌落微生物平板菌落计数的技术计数的技术方法方法。第16页，共26页，编辑于2022年，星期二二、基本原理二、基本原理 土壤是微生物生活的大本营，其中含
14、有大量不同类土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行离进行纯培养纯培养，并能对特定类群进行数量测定。，并能对特定类群进行数量测定。基本原理是通过基本原理是通过稀释稀释使菌体细胞充分分散，单使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成细胞得以生长发育形成菌落菌落，可使用稀释法或平板，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。单位重量土壤样品含有微生物的数量。第17页，共26页，编辑于2022年，星期二
15、图14-1 从土壤中分离微生物操作过程第18页，共26页，编辑于2022年，星期二三、实验步骤三、实验步骤土壤样品采集土壤样品采集n在待测田块上，若田块面积小于在待测田块上，若田块面积小于5050平方平方米则按对角线三点采样；米则按对角线三点采样；n若田块面积大于若田块面积大于5050平方米按对角线五点平方米按对角线五点采样。采样。n采样一般定点于耕作层采样一般定点于耕作层0-20cm0-20cm，先除去，先除去表土表土1-2cm1-2cm，以无菌铲采土足量充分混，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。匀后用无菌塑料袋分装。第19页，共26页，编辑于2022年，星期二固氮菌的分离纯化及测
16、数固氮菌的分离纯化及测数n1.1.制备土样稀释液制备土样稀释液n2.培养基的准备培养基的准备n3.倾注法接种倾注法接种n4.保温培养保温培养n5.分区划线法纯化分区划线法纯化n6.计数计数第20页，共26页，编辑于2022年，星期二1 1 制备土样稀释液制备土样稀释液n吹吸三次混匀，无菌操作吹吸三次混匀，无菌操作第21页，共26页，编辑于2022年，星期二2 2 培养基的准备培养基的准备 融化阿须贝培养基，融化后保温在融化阿须贝培养基，融化后保温在4848。并取。并取3 3个无个无菌培养皿，分别在皿底贴好标签，注明菌培养皿，分别在皿底贴好标签，注明1010-2-2、1010-3-3、1010-
17、4 4。3 3 倾注法接种倾注法接种 先按先按1010-4-4 、1010-3-3 、1010-2-2 的顺序将不同稀释度菌悬液接的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中（每个平皿接入入对应平皿中（每个平皿接入1ml1ml），再向每个平皿倾），再向每个平皿倾注约注约15 ml15 ml的阿须贝培养基（的阿须贝培养基（5050）待冷凝，混合均匀。）待冷凝，混合均匀。4 4 保温培养保温培养 将已经接种的平皿静置将已经接种的平皿静置10min10min后，放入温箱倒置培养后，放入温箱倒置培养7 7日日（3030），观察结果。），观察结果。第22页，共26页，编辑于2022年，星期二第23页，共26页，编辑于2022年，星期二5 菌种纯化菌种纯化n平板划线分离，其划线方法有以下两种：平板划线分离，其划线方法有以下两种：分段划线分段划线 连续划线连续划线第24页，共26页，编辑于2022年，星期二第25页，共26页，编辑于2022年，星期二6 计数：要求30300之间计数。作业：作业：P 10-12P 10-12下次实验：实验十五、十六下次实验：实验十五、十六第26页，共26页，编辑于2022年，星期二