第五章氨基酸发酵机制精选文档.ppt

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1、第五章氨基酸发酵机制本讲稿第一页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制谷氨酸，学名：谷氨酸，学名：-氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨酸钠，商品名称味精，是重要的调味品。氨酸钠，商品名称味精，是重要的调味品。早期生产谷氨酸的方法有两种，一是提取法：早期生产谷氨酸的方法有两种，一是提取法：甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处理可得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋理可得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋加酸水解，再分离提纯。加酸水解，再分离提纯。第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 谷氨酸谷氨酸本讲稿第二页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制195

2、7年发酵法生产谷氨酸在日本协和发酵公司年发酵法生产谷氨酸在日本协和发酵公司投产。投产。日本在谷氨酸发酵生产方面居世界领先地位。味之日本在谷氨酸发酵生产方面居世界领先地位。味之素、协和等均是其中代表。我国近年的发展也比较素、协和等均是其中代表。我国近年的发展也比较快快;如河南的莲花味精公司，目前味精产量已从如河南的莲花味精公司，目前味精产量已从1983年的年的400吨上升到目前拥有吨上升到目前拥有30万吨味精的年生万吨味精的年生产能力。产能力。第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第三页，共七十七页谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300多倍

3、的谷氨酸，研究发现：大量积累是由于：多倍的谷氨酸，研究发现：大量积累是由于：代谢调节控制；代谢调节控制；细胞膜通透性的特异调节；细胞膜通透性的特异调节；发酵条件的适合；发酵条件的适合；第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四页，共七十七页一、谷氨酸生物合成途径及调节机制一、谷氨酸生物合成途径及调节机制第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 第一节第一节谷氨酸发酵机制谷氨酸发酵机制本讲稿第五页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第六页，共七十七页（一）（一）EMP途径、途径、HMP途径途径谷氨酸生产菌存在着两种代谢途径：谷

4、氨酸生产菌存在着两种代谢途径：EMP、HMP；EMP/HMP=90/10。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第七页，共七十七页（二）（二）TCA、DCA和和CO2固定作用固定作用1.TCA环（三羧酸循环）环（三羧酸循环）第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 P69表表5-2：谷氨酸是通过三羧酸循环途径合：谷氨酸是通过三羧酸循环途径合成的；为此：成的；为此：-酮戊二酸之前的代谢必须畅通；酮戊二酸之前的代谢必须畅通；-酮戊二酸脱氢酶活性丧失或很小；酮戊二酸脱氢酶活性丧失或很小；本讲稿第八页，共七十七页葡萄糖6-P-葡萄糖3-磷酸甘油醛丙酮酸乙酰CoA磷酸丙

5、糖磷酸烯醇丙酮酸草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸-酮戊二酸琥珀酸富马酸苹果酸CO2Fe2+CO26-P-葡萄糖酸5-P-核糖HMP乙酰CoA乙醛酸CO2谷氨酸NADPH+H+NADPNADP排出细胞DCACO2柠檬酸合成酶顺乌头酸酶异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第九页，共七十七页2.DCA环（乙醛酸循环）：环（乙醛酸循环）：乙醛酸乙醇乙酸CoA烃类乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸乙酰CoA苹果酸富马酸琥珀酸异柠檬酸-氧化第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第十页，共七十七页3.CO2固定固定苹果酸酶苹果酸脱氢酶CO2草酰

6、乙酸CO2NAD+NADH+H+PEPGDPCO2GTPPEP羧化酶丙酮酸苹果酸草酰乙酸+第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 实验表明：草酰乙酸靠实验表明：草酰乙酸靠CO2的固定来补充；已发的固定来补充；已发现的途径有二条：现的途径有二条：本讲稿第十一页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 PEP的分解和羧化受细胞能量代谢水平调节；的分解和羧化受细胞能量代谢水平调节；PEP羧化酶的羧化酶的Km较高；较高；本讲稿第十二页，共七十七页（三）氨的导入（三）氨的导入第五章 氨基酸发酵机制氨的导入有三种方式：氨的导入有三种方式：-酮戊二酸还原氨基化酮戊二酸还

7、原氨基化谷氨酸谷氨酸天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移，将氨基转天冬氨酸或丙氨酸通过氨基转移，将氨基转给给-酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸合成酶途径，该酶谷氨酸合成酶途径，该酶Km仅谷氨酸脱氢酶的仅谷氨酸脱氢酶的1/10，且不被谷氨酸抑制。，且不被谷氨酸抑制。第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 氨是氨基酸基本结构之一，氨的导入是氨基酸合成氨是氨基酸基本结构之一，氨的导入是氨基酸合成中的基本过程。中的基本过程。本讲稿第十三页，共七十七页二、细胞膜通透性控制二、细胞膜通透性控制谷氨酸生产菌的主要生化特点：谷氨酸生产菌的主要生化特点：-酮戊二酸脱氢酶活性极低或缺失酮戊二酸脱氢酶活性极低或缺失谷氨酸脱氢酶活性很高，不被

8、低浓度的谷氨谷氨酸脱氢酶活性很高，不被低浓度的谷氨酸抑制酸抑制细胞膜对谷氨酸的通透性高细胞膜对谷氨酸的通透性高第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第十四页，共七十七页C17酸(佶抗)C18酸C16酸油酸C18(限量)n-石蜡-KGA-磷酸甘油脂肪酸生物素磷脂质磷酸二羟丙酮青霉素心磷脂磷脂酰甘油磷脂酰肌醇磷脂酰肌醇二甘露糖酸乙酰CoA3-磷酸甘油醛葡萄糖葡萄糖生物素乙酸细胞膜细胞壁L-GAL-GA柠檬酸聚氧乙二醇十七酸盐第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第十五页，共七十七页三、菌种选育模型与控制方法三、菌种选育模型与控制方法控制磷脂的合成控制磷脂

9、的合成使细胞膜受损（如表面活性剂）使细胞膜受损（如表面活性剂）青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜通过油酸的合成通过油酸的合成通过甘油合成通过甘油合成直接控制磷脂合成直接控制磷脂合成提高细胞膜的谷氨酸通透性提高细胞膜的谷氨酸通透性控制磷脂含量控制磷脂含量第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第十六页，共七十七页1.从生物素入手：从生物素入手：菌种选育模型及控制方法菌种选育模型及控制方法CH2-COSCoA+CO2+ATP(乙酰CoA)生物素Mg2+乙酰CoA羧化酶COOH-CH2CoA+ADP+Pi(丙二酰CoA)生物素是羧化酶的辅酶，促进脂肪

10、酸合成，再合成生物素是羧化酶的辅酶，促进脂肪酸合成，再合成磷脂。磷脂。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第十七页，共七十七页选育生物素缺陷型菌株限制外源性生物素供应（适量贫乏）磷脂细胞膜结构不完整细胞膜对谷氨酸通透性抑制不饱和脂肪酸合成磷脂第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第十八页，共七十七页2.选育油酸缺陷型选育油酸缺陷型3.选育甘油缺陷型选育甘油缺陷型4.选育温度敏感型突变株选育温度敏感型突变株由于磷脂结构复杂，又是细胞膜的必要成分，由于磷脂结构复杂，又是细胞膜的必要成分，所以磷脂合成障碍必须是条件型突变，如温度所以磷脂合成障碍必须是条件

11、型突变，如温度敏感型突变株才能存活，反之，从温度敏感型敏感型突变株才能存活，反之，从温度敏感型突变株中可以找到细胞膜合成有缺陷的突变株。突变株中可以找到细胞膜合成有缺陷的突变株。5其他，如营养缺陷型；药物抗性突变株；敏感其他，如营养缺陷型；药物抗性突变株；敏感型突变株等型突变株等第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第十九页，共七十七页微生物的代谢产物可分为：微生物的代谢产物可分为：初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的、自初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。身生长和繁殖所必需的物质。特征：不同的微生物初级代谢产物基本相同；初特征：不同

12、的微生物初级代谢产物基本相同；初级代谢产物合成过程是连续不断的，与菌体的生级代谢产物合成过程是连续不断的，与菌体的生长呈平行关系。长呈平行关系。第五章 氨基酸发酵机制第二节第二节微生物代谢调节及代谢工程微生物代谢调节及代谢工程第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第二十页，共七十七页次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。特征：不同的微生物次级代谢产物不同；次级特征：不同的微生物次级代谢产

13、物不同；次级代谢产物的通常在菌体的生长后期合成；在多代谢产物的通常在菌体的生长后期合成；在多数情况下，增加前体是有效的。数情况下，增加前体是有效的。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第二十一页，共七十七页一、微生物代谢的自我调节一、微生物代谢的自我调节第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 微生物细胞的代谢调节方式很多，其中以调节微生物细胞的代谢调节方式很多，其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括两个方面，一代谢流的方式最为重要，它包括两个方面，一是是“粗调粗调”，即调节酶的合成量；二是，即调节酶的合成量；二是“细调细调”，即调节现成酶分子的催化活力，两

14、者密切，即调节现成酶分子的催化活力，两者密切配合和协调，以达到最佳调节效果。配合和协调，以达到最佳调节效果。微生物自我调节部位：微生物自我调节部位：1养分的吸收和排泄养分的吸收和排泄2限制基质与酶的接近限制基质与酶的接近3控制通量控制通量本讲稿第二十二页，共七十七页（一）酶活性的调节（一）酶活性的调节酶活性的调节：酶活性的调节：在酶分子水平上，通过改变现成的酶分子活性来在酶分子水平上，通过改变现成的酶分子活性来调节代谢。包括：抑制；激活；调节代谢。包括：抑制；激活；第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第二十三页，共七十七页1.酶活性的激活酶活性的激活常见的酶活性的激活是

15、前体激活，多发生在分常见的酶活性的激活是前体激活，多发生在分支代谢途径，即代谢途径中的后面的反应可被支代谢途径，即代谢途径中的后面的反应可被较前面的一种代谢中间产物所促进。较前面的一种代谢中间产物所促进。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第二十四页，共七十七页2.酶活性的抑制酶活性的抑制酶活性的抑制包括：竞争性抑制；反馈抑制。在酶活性的抑制包括：竞争性抑制；反馈抑制。在代谢调控中，主要是反馈抑制。代谢调控中，主要是反馈抑制。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 反馈抑制：反应途径中某些中间产物或末端产物反馈抑制：反应途径中某些中间产物或末端产物对该途径

16、中前面反应的影响。有正反馈和负反馈对该途径中前面反应的影响。有正反馈和负反馈之分。之分。本讲稿第二十五页，共七十七页反馈抑制的类型反馈抑制的类型直线式代谢途径中的反馈抑制直线式代谢途径中的反馈抑制第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第二十六页，共七十七页分支代谢途径中的反馈抑制。分支代谢途径中的反馈抑制。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 为避免在一个分支上的产物过多时不致同时为避免在一个分支上的产物过多时不致同时影响另一分支上产物的供应，微生物已发展影响另一分支上产物的供应，微生物已发展出多种调节方式。出多种调节方式。本讲稿第二十七页，共七十七页（1

17、）同功酶调节）同功酶调节同功酶同功酶能催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结能催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结构有差异的一类酶，它们虽同存于一个个体或同构有差异的一类酶，它们虽同存于一个个体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在着差别。着差别。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 如：大肠杆菌天冬氨族氨基酸合成途径中，有三如：大肠杆菌天冬氨族氨基酸合成途径中，有三个同功酶：天冬氨酸激酶个同功酶：天冬氨酸激酶，分别受赖氨酸、，分别受赖氨酸、苏氨酸、硫氨酸反馈调节。苏氨酸、硫氨酸反馈调节。本讲稿第二十八页，共七十七页第五章 氨基酸发酵

18、机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第二十九页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制（2）协同反馈抑制：）协同反馈抑制：分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶。抑制共同途径中的第一个酶。本讲稿第三十页，共七十七页（3）累积反馈抑制：）累积反馈抑制：催化分支合成途径第一步反应的酶有几种末端催化分支合成途径第一步反应的酶有几种末端产物抑制物，但每一种如过量，按一定百分率产物抑制物，但每一种如过量，按一定百分率单独抑制共同途径中的第一个酶活性，总的抑单独抑制共同途径中的第一个酶活性，总的抑制效果是累

19、加的，各末端产物所起的抑制作用制效果是累加的，各末端产物所起的抑制作用互不影响，只影响这个酶促反应的速率。互不影响，只影响这个酶促反应的速率。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第三十一页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 两种末端产物同时存在时，可以起着比一两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。种末端产物大得多的反馈抑制作用。本讲稿第三十二页，共七十七页（4）增效反馈抑制：代谢途径中任何一种末端）增效反馈抑制：代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同途径中的第一个酶产物过量时，仅部分抑制共同途径中的第

20、一个酶活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和。可超过各产物存在的抑制能力的总和。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第三十三页，共七十七页（5）顺序反馈抑制：每个分支末端产物抑制分）顺序反馈抑制：每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制作用。通过逐步支后的第一个酶，产生部分抑制作用。通过逐步有顺序的方式达到的调节。有顺序的方式达到的调节。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第三十四页，共七十七页（二）酶合成的调节（酶量）（二）酶合成的调节（酶量）这是一种在基因

21、表达水平上的调节。分诱导和阻这是一种在基因表达水平上的调节。分诱导和阻遏调节。遏调节。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 这种调节方式是较间接而缓慢的调节方式。其优这种调节方式是较间接而缓慢的调节方式。其优点则是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物点则是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节两在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节两者是同时存在且密切配合、协调进行的。者是同时存在且密切配合、协调进行的。本讲稿第三十五页，共七十七页1.诱导诱导诱导酶：某些酶只有在它们催化的底物（或底诱导酶：某些酶只有在

22、它们催化的底物（或底物的结构类似物）存在时才能合成，此种酶称物的结构类似物）存在时才能合成，此种酶称为诱导酶。为诱导酶。诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似物诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。而临时合成的一类酶。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第三十六页，共七十七页能促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是能促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。分外源诱导物：外源加入的；是底物的前体物质。分外源诱导物：外源加入的；内源诱导物：菌体代谢途

23、径的某些中间产物也能内源诱导物：菌体代谢途径的某些中间产物也能诱导该途径的某些酶系的合成，这些中间产物称诱导该途径的某些酶系的合成，这些中间产物称为内源诱导物。为内源诱导物。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第三十七页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第三十八页，共七十七页酶的诱导合成类型酶的诱导合成类型同时诱导同时诱导:当诱导物加入后，微生物能同时或几当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖加入到代谢途径中。例如，将乳糖加入到E.co

24、li培养基培养基中后，即可同时诱导出中后，即可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、半乳糖苷透性酶、-半半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成；乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成；顺序诱导顺序诱导:先合成能分解底物的酶，再依次合成分先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。分段调节。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第三十九页，共七十七页2.阻遏阻遏当代谢途径中某末端产物过量时，通过阻遏作用当代谢途径中某末端产物过量时，通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的来阻碍代谢途径中包括关

25、键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。物的合成。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四十页，共七十七页反馈阻遏：代谢终产物达到一定浓度时，反反馈阻遏：代谢终产物达到一定浓度时，反馈阻遏该代谢途径的一种或几种酶的生物合馈阻遏该代谢途径的一种或几种酶的生物合成。成。阻遏的类型主要有两种阻遏的类型主要有两种:末端代谢产物阻遏末端代谢产物阻遏分解代谢产物阻遏。分解代谢产物阻遏。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四十一页，共七十七页（1）末端产物阻遏）末端产物阻遏对直线式反应

26、途径对直线式反应途径，末端产物阻遏的情况较为，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏。之合成受阻遏。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四十二页，共七十七页对分支代谢途径来说，情况较复杂。对分支代谢途径来说，情况较复杂。每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。径的酶。多价阻遏：有两种或两种以上的末端产物的分支代多价阻遏：有两种或两种以上的末端产物的分支代谢途径中，当分支代谢途径中的几种末端产物同时谢途径中，当分支代谢途径中的几种末端产物同时过

27、量就反馈阻遏其分支点以前的共同途径的过量就反馈阻遏其分支点以前的共同途径的“公共公共酶酶”的合成，仅一种产物过量无阻遏作用。的合成，仅一种产物过量无阻遏作用。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四十三页，共七十七页（2）分解代谢产物阻遏）分解代谢产物阻遏细胞内同时有两种分解底物（如碳源）或其分细胞内同时有两种分解底物（如碳源）或其分解产物存在时，被菌体迅速利用的那种分解底解产物存在时，被菌体迅速利用的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四十四页，共七十七

28、页分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的底分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的底物本身直接作用的结果，而是通过其分解过程中物本身直接作用的结果，而是通过其分解过程中所产生的中间代谢物所引起。即：代谢反应链中，所产生的中间代谢物所引起。即：代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶的合成。如葡萄糖效应。代谢途径中一些酶的合成。如葡萄糖效应。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四十五页，共七十七页两种调节的对比两种调节的对比酶合成的调节酶活性的调节不同点调节对象通过酶量的变化控制代谢速率控制酶活

29、性，不涉及酶量变化调节效果相对缓慢快速、精细调节机制基因水平调节，调节控制酶合成酶分子水平调节，调节酶活性相同点细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四十六页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制（三）能荷的调节（三）能荷的调节本讲稿第四十七页，共七十七页R曲线曲线合成系统，如磷酸果糖激酶、柠檬酸合成合成系统，如磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶等。酶等。U曲线曲线消耗消耗ATP的酶系，柠檬酸裂解酶、磷酸的酶系，柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等。核糖焦磷酸合成酶等。当能荷当能荷0.75

30、，合成受到抑制，酶活性急速下，合成受到抑制，酶活性急速下降，消耗降，消耗ATP的酶活性急速上升。两系统在的酶活性急速上升。两系统在0.85处交叉，酶系达到平衡。处交叉，酶系达到平衡。这种现象存在于许多生长状态的细胞中。细胞通这种现象存在于许多生长状态的细胞中。细胞通过调节腺苷酸的比例，来协调分解代谢与合成代过调节腺苷酸的比例，来协调分解代谢与合成代谢的代谢速率。谢的代谢速率。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四十八页，共七十七页二、代谢调控二、代谢调控微生物在正常生长条件下，可以通过自我调节使微生物在正常生长条件下，可以通过自我调节使机体内的代谢途径与代谢类型互相协

31、调与平衡，机体内的代谢途径与代谢类型互相协调与平衡，通常不会过量积累初级代谢产物。在某种条件下，通常不会过量积累初级代谢产物。在某种条件下，过量积累的中间代谢产物也能够被诱导酶转化为过量积累的中间代谢产物也能够被诱导酶转化为次级代谢产物。但在人为条件的控制下，可以使次级代谢产物。但在人为条件的控制下，可以使微生物过量产生各种初级代谢产物和次级代谢产微生物过量产生各种初级代谢产物和次级代谢产物。物。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第四十九页，共七十七页初级代谢产物控制比较简单。它的形成一般初级代谢产物控制比较简单。它的形成一般只需要营养条件即可生成。只需要营养条件即可

32、生成。通过改变发酵工通过改变发酵工艺条件如艺条件如pH、温度、培养基组成和微生物遗、温度、培养基组成和微生物遗传特性等，达到改变菌体内的代谢平衡，过传特性等，达到改变菌体内的代谢平衡，过量产生所需要产物的目的。量产生所需要产物的目的。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 实践中，通过以下途径来实现：实践中，通过以下途径来实现：发酵条件控制发酵条件控制改变细胞的渗透性改变细胞的渗透性改变菌种的遗传特性改变菌种的遗传特性本讲稿第五十页，共七十七页（一）发酵条件的控制（一）发酵条件的控制1.改变发酵条件改变发酵条件如：啤酒酵母在中性和酸性条件下培养，可将葡如：啤酒酵母在中性和酸性条件

33、下培养，可将葡萄糖氧化生成乙醇和二氧化碳；当在培养基中加萄糖氧化生成乙醇和二氧化碳；当在培养基中加入亚硫酸氢钠或在碱性条件下培养时，则并不产入亚硫酸氢钠或在碱性条件下培养时，则并不产生乙醇，而是产生甘油。生乙醇，而是产生甘油。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第五十一页，共七十七页2.使用诱导物使用诱导物如：在木霉发酵生产纤维素酶中，加入槐糖可以如：在木霉发酵生产纤维素酶中，加入槐糖可以诱导纤维素酶的产生；木糖可以诱导半纤维素酶诱导纤维素酶的产生；木糖可以诱导半纤维素酶的生成。青霉素酰化酶可用苯乙酸为诱导物。的生成。青霉素酰化酶可用苯乙酸为诱导物。第五章 氨基酸发酵机

34、制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第五十二页，共七十七页3.添加生物合成的前体添加生物合成的前体第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第五十三页，共七十七页4.培养基成分和浓度的控制培养基成分和浓度的控制培养基即要保证微生物机体生长需要，又要培养基即要保证微生物机体生长需要，又要利于代谢产物的合成，其组成和浓度应避免利于代谢产物的合成，其组成和浓度应避免引起分解代谢阻遏（采用适当的速效和迟效引起分解代谢阻遏（采用适当的速效和迟效碳源、氮源及配比）。碳源、氮源及配比）。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 如，用甘油代替果糖作为碳源培养嗜热脂肪酵母，如

35、，用甘油代替果糖作为碳源培养嗜热脂肪酵母，可以使淀粉酶的产量提高可以使淀粉酶的产量提高25倍以上；用甘露糖代倍以上；用甘露糖代替乳糖作为培养荧光假单胞菌的碳源，使纤维素替乳糖作为培养荧光假单胞菌的碳源，使纤维素酶产量提高酶产量提高1500倍以上。倍以上。本讲稿第五十四页，共七十七页（二）改变细胞透性（二）改变细胞透性控制影响细胞膜通透性控制影响细胞膜通透性,有利于代谢产物的分泌，有利于代谢产物的分泌，可以避免末端产物反馈抑制。可以避免末端产物反馈抑制。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 如，利用棒状杆菌的如，利用棒状杆菌的-酮戊二酸脱氢酶缺失突变酮戊二酸脱氢酶缺失突变株，在葡

36、萄糖培养基中发酵生产谷氨酸，当谷氨株，在葡萄糖培养基中发酵生产谷氨酸，当谷氨酸浓度达到酸浓度达到50mg/g(干细胞干细胞)时，由于反馈调节作时，由于反馈调节作用，谷氨酸的合成便终止。用，谷氨酸的合成便终止。本讲稿第五十五页，共七十七页（三）改变菌种的遗传特性（三）改变菌种的遗传特性改变微生物的遗传特性，即改变酶的活性或酶改变微生物的遗传特性，即改变酶的活性或酶的合成系统，使之对反馈调节不敏感，达到过的合成系统，使之对反馈调节不敏感，达到过量生产代谢产物的目的。量生产代谢产物的目的。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第五十六页，共七十七页次级代谢的调节类型次级代谢的调

37、节类型次级代谢产物的种类在不同的微生物中不同，次级代谢产物的种类在不同的微生物中不同，所以次级代谢调节类型的多样亦可想而知。所以次级代谢调节类型的多样亦可想而知。已知抗生素等次级代谢产物生物合成的调控已知抗生素等次级代谢产物生物合成的调控类型包括诱导调节、碳分解产物调节、氮分类型包括诱导调节、碳分解产物调节、氮分解产物调节、磷酸盐调节、反馈调节、生长解产物调节、磷酸盐调节、反馈调节、生长速度调节等。此就共性作一介绍：速度调节等。此就共性作一介绍：第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第五十七页，共七十七页酶合成的诱导调节酶合成的诱导调节在次级代谢途径中，某些酶也是诱导酶，

38、在底在次级代谢途径中，某些酶也是诱导酶，在底物或底物的结构类似物存在时才会产生。物或底物的结构类似物存在时才会产生。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第五十八页，共七十七页反馈调节反馈调节反馈调节在次级代谢产物的生物合成中有着重反馈调节在次级代谢产物的生物合成中有着重要的作用，包括要的作用，包括:次级代谢产物的自身反馈调节；次级代谢产物的自身反馈调节；分解代谢产物调节；分解代谢产物调节；初级代谢产物的反馈调节；初级代谢产物的反馈调节；第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第五十九页，共七十七页分解代谢产物调节分解代谢产物调节再次及代谢途径中，存在

39、与初级代谢相似的分解再次及代谢途径中，存在与初级代谢相似的分解产物调节现象。产物调节现象。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 在许多抗生素发酵中，都发现了葡萄糖的抑制作在许多抗生素发酵中，都发现了葡萄糖的抑制作用。一般是在葡萄糖等速效碳源耗至一定浓度才用。一般是在葡萄糖等速效碳源耗至一定浓度才开始才开始抗生素合成。除了葡萄糖外，凡能促开始才开始抗生素合成。除了葡萄糖外，凡能促进产生菌生长速度的碳源，对次级代谢产物生物进产生菌生长速度的碳源，对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用。次级代谢产物的合成速合成都表现出抑制作用。次级代谢产物的合成速率与产生菌的生长速率呈相反关系。率与

40、产生菌的生长速率呈相反关系。本讲稿第六十页，共七十七页初级代谢产物的调节初级代谢产物的调节某些初级代谢产物可以调节次级代谢产物的合成，某些初级代谢产物可以调节次级代谢产物的合成，有两种情况：有两种情况：1.初级代谢产物和次级代谢产物的合成有一条初级代谢产物和次级代谢产物的合成有一条共同的合成途径，当初级代谢产物积累时，反共同的合成途径，当初级代谢产物积累时，反馈抑制了次级代谢途径某一反应的进行，而最馈抑制了次级代谢途径某一反应的进行，而最终抑制了次级代谢产物的合成。终抑制了次级代谢产物的合成。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第六十一页，共七十七页2.初级代谢产物直接

41、参与次级代谢产物的生初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成，即初级代谢产物是次级代谢产物的物合成，即初级代谢产物是次级代谢产物的生物合成的前体，当此种初级代谢产物因为生物合成的前体，当此种初级代谢产物因为积累，反馈抑制了它自身的合成时，必然也积累，反馈抑制了它自身的合成时，必然也同时影响了次级代谢产物的合成。同时影响了次级代谢产物的合成。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第六十二页，共七十七页磷酸盐的调节磷酸盐的调节在次级代谢产物合成中，高浓度磷酸盐表现出在次级代谢产物合成中，高浓度磷酸盐表现出较强的抑制作用，称为磷酸盐调节。磷是微生较强的抑制作用，称为磷酸盐调节

42、。磷是微生物生长繁殖的必需元素，浓度为物生长繁殖的必需元素，浓度为0.3300mmol/L时，能支持微生物细胞的生长，但当浓时，能支持微生物细胞的生长，但当浓度超过度超过10mmol/L时，就能抑制许多抗生素的生时，就能抑制许多抗生素的生物合成。物合成。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第六十三页，共七十七页ATP的调节作用的调节作用在研究四环素的生物合成过程中发现，产生菌体在研究四环素的生物合成过程中发现，产生菌体内的内的ATP水平调节着四环素的合成。水平调节着四环素的合成。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第六十四页，共七十七页产生菌生长

43、速率的调节产生菌生长速率的调节在丰富培养基中进行的分批发酵动力学研究表明，在丰富培养基中进行的分批发酵动力学研究表明，大多数发酵过程都分为生长期和生产期。在生长大多数发酵过程都分为生长期和生产期。在生长期次级代谢产物合成酶受到阻抑作用，次级代谢期次级代谢产物合成酶受到阻抑作用，次级代谢产物不被合成。主要是一些抗生素合成酶受到抑产物不被合成。主要是一些抗生素合成酶受到抑制或阻遏。制或阻遏。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第六十五页，共七十七页次级代谢调节：次级代谢调节：1.酶合成的诱导调节酶合成的诱导调节2.反馈调节：次级代谢产物自身反馈调节：次级代谢产物自身分解代谢

44、产物的调节分解代谢产物的调节初级代谢产物的调节初级代谢产物的调节3.磷酸盐的调节：促进初级代谢，抑制次级代谢；磷酸盐的调节：促进初级代谢，抑制次级代谢；4.ATP调节调节5.产生菌生长速率的调节产生菌生长速率的调节第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第六十六页，共七十七页三、代谢工程三、代谢工程代谢工程：利用基因工程技术，定向地对代谢工程：利用基因工程技术，定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代代谢调控及生化工程相结合，构

45、建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。域。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第六十七页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 在代谢工程设计中，主要有改变代谢流、扩展在代谢工程设计中，主要有改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种。代谢途径和构建新的代谢途径三种。本讲稿第六十八页，共七十七页改变代谢途径改变代谢途径改变代谢途径是指改变分支代谢途径的流向，改变代谢途径是指改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目标产阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目标产物的目的。物的目的。

46、改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应、改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应、改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法。能量代谢途径等不同方法。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第六十九页，共七十七页头孢霉素头孢霉素C C的代谢工程菌的构建的代谢工程菌的构建-氨基己二酸氨基己二酸氨基己二酸氨基己二酸中间产物中间产物中间产物中间产物克隆了编码克隆了编码脱乙酰氧基脱乙酰氧基头孢霉素头孢霉素C合合成酶基因成酶基因cefEF青霉素青霉素青霉素青霉素N N头孢霉素头孢霉素头孢霉素头孢霉素C C限速步骤限速步骤限速步

47、骤限速步骤所得转化子头孢霉素所得转化子头孢霉素C产量提高了产量提高了25，而青霉素，而青霉素N的积累的积累量减少至原来的量减少至原来的1/16。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 青霉素N是头孢霉素合成的中间体。用顶头孢发酵时，发现了青霉素N的积累，这表明下一步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤。本讲稿第七十页，共七十七页改变分支代谢途径流向改变分支代谢途径流向提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，提高代谢分支点的某一代谢途径酶系的活性，在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势。在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本

48、讲稿第七十一页，共七十七页第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第七十二页，共七十七页赖氨酸合成，选育解除反馈抑制和缺失高丝赖氨酸合成，选育解除反馈抑制和缺失高丝氨酸脱氢酶的突变株，提高了赖氨酸的产量。氨酸脱氢酶的突变株，提高了赖氨酸的产量。为了获得苏氨酸的高产菌株，以解除了反馈抑为了获得苏氨酸的高产菌株，以解除了反馈抑制的赖氨酸产生菌棒状杆菌为宿主，转入高丝制的赖氨酸产生菌棒状杆菌为宿主，转入高丝氨酸脱氢酶基因，结果使原来不产生苏氨酸的氨酸脱氢酶基因，结果使原来不产生苏氨酸的赖氨酸产生菌的赖氨酸产量由赖氨酸产生菌的赖氨酸产量由65g/L下降至下降至4g/L，而苏氨酸产量

49、增加到，而苏氨酸产量增加到52g/L，使赖氨酸产生，使赖氨酸产生菌转变成苏氨酸产生菌。菌转变成苏氨酸产生菌。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第七十三页，共七十七页扩展代谢途径扩展代谢途径在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物。或使原来的代谢途径伸，产生新的末端产物。或使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。向前延伸，可以利用新的原料合成代谢产物。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第七十四页，共七十七页转移或构建新的代谢途径转移或构建新的代谢途径将催化一系列反应的多

50、个酶基因克隆到微生将催化一系列反应的多个酶基因克隆到微生物中，使之获得产生新的化合物的能力；或物中，使之获得产生新的化合物的能力；或利用基因工程手段，克隆少数基因，使细胞利用基因工程手段，克隆少数基因，使细胞原有无关的两条代谢途径联结起来，形成新原有无关的两条代谢途径联结起来，形成新的途径，产生新的代谢产物；或将催化某一的途径，产生新的代谢产物；或将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一生物中，使之代谢途径的基因组克隆到另一生物中，使之发生代谢转移，产生目的产物。发生代谢转移，产生目的产物。第五章 氨基酸发酵机制第二篇第二篇 发酵机制发酵机制 本讲稿第七十五页，共七十七页代谢工程实际上是基于基因工