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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。基因工程课程实验指导书-基因工程课程实验指导书生物技术专业黄淑坚黄良宗编写佛山科学技术学院2005年12月-目录前言实验一反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）1实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接7实验三重组DNA的转化10实验四重组DNA的鉴定13实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达16实验六表达产物的检测与分析SDS-PAGE18附录22参考文献34前言基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技
2、术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。编者2005年12月实验一反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）一、目的和要求了解反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR反应的基
3、本技术。二、实验内容RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。三、仪器、设备和实验准备1、 仪器恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。2、 试剂反转录酶、RNA酶抑制剂（RNaseInhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。3、实验准备用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。四、实验原理RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。反转录反应
4、是在反转录酶作用下，以RNA为模板指导合成互补的DNA链的过程。反转录反应可以使用反转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。（一）PCR
5、反应中的主要成份：1.引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm4(G+C)+2(A+T)。(3)四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4)引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5)在引物内,尤其在3端应不存在二级
6、结构。(6)两引物之间尤其在3端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。(7)引物5端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260n
7、m下,引物浓度可按下式计算：Xmol/LOD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。2.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200mol/L。理论上4种dNTP各20mol/L,足以在100l反应中合成2.6g的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNT
8、P的不足出现的错误掺入。3.Mg2+：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。4.模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比
9、环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102-105个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1g的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。5.TaqDNA聚合酶：在100lPCR反应中,1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加,过少
10、则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活TaqDNA聚合酶,灭活TaqDNA聚合酶的方法有：(1)PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。(3)99-100加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的试剂盒可用。6.反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/LTrisCl(20下pH8.3-8.8),50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+.TrisCl在20时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8.50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏
11、糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利，各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。（二）PCR反应参数1.变性：在第一轮循环前,在94下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量。一般变性温度与时间为941min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时
12、间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。2.退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度，实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时,应提高退火温度。退火温度越高,所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用94和60)完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37-6
13、0,1-2min。3.延伸：延伸反应通常为72,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20-85。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(7-10min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。4.循环次数：当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已
14、经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后,反应中TaqDNA聚合酶已经不足,如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经60轮循环后,扩增水平可达109-1010。五、实验步骤1反转录反应（合成cDNA第一链）（1）依照所列顺序加入以下试剂以建立一个20l的反应体系。（依据RNA的量，反应体积可以增减）：组分量MgCl2,25mM*4l反转录10X缓冲液2ldNTP混合物,10mM2lRNasin核糖核酸酶抑制剂0.5lAMV反转录酶（高浓度）15u上游引物或随机引物
15、*0.5g总RNA1g加无核酸酶的水至终体积为20l*注：*推荐的MgCl2浓度可根据已知序列进行优化以得到较高产量。*反转录反应可以利用特异引物、Oligo(dT)15或随机引物随机引物引导。如果需要由3Poly(A)区域引导，选用Oligo(dT)15引物；如果需要引导全长RNA，选用随机引物。当使用cDNA进行克隆及PCR反应时，通常选择Oligo(dT)15引物。如果cDNA用于RT-PCR,有时随机引物比较合适，特别当PCR引物定位于RNA5-末端时更是如此,由于猪流感病毒无Poly(A)结构，本试验不能用Oligo(dT)15引导。*反应组分的终浓度分别为：5mMMgCl2,1X反
16、转录缓冲液（10mMTris-HClPH9.0,25oC，50mMKCl,0.1%TritonX-100），1mM每种dNTP，1u/l重组RNasin核糖核酸酶抑制剂，15u/gAMV反转录酶（高浓度），0.5gOligo(dT)15引物或随机引物/gRNA，50ng/lPoly(A)+mRNA或总RNA。（2）如果使用Oligo(dT)15引物，将反应体系于42oC温育15分钟。如果使用随机引物，将反应体系于室温温育10分钟，然后于42oC温育15分钟。增加的室温温育步骤有利于引物的伸展，使得当温度升高到42oC时引物仍处于杂交状态。（3）将样品于95oC加热5分钟，然后于0-5oC放置5
17、分钟。这一步将使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合。第一链cDNA可用于第二链cDNA的合成、PCR扩增或琼脂糖凝胶分析。也可以将第一链cDNA存放于-20oC备用。2PCR反应（1）用TE缓冲液或无核酸酶的水将第一链cDNA合成反应的体积稀释到100l。（2）将下列试剂混合在一起以配制25l扩增反应体系。组分量第一链cDNA反应物(模板)10ldNTP混合物,2.5mM4l10XPCR缓冲液(含Mg2+)5l上游引物20M1l下游引物20M1lTaqDNA聚合酶2单位加无核酸酶的水至终体积为25l（3）将混合物在94下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒,使管壁上液滴沉至管底,加入TaqDNA
18、聚合酶（0.5l约2.5U），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。（4）用94变性30秒，55退火30秒,72延伸30秒,循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后,于72下保温10分钟，使反应产物扩增充分。（5）电泳检测PCR产物，取10l扩增产物用1琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。六、实验注意事项1、反转录操作过程中，严防RNase污染，应戴手套操作。2、TRizal试剂有致癌作用，避免皮肤接触。七、思考1.降低退火温度对反应有何影响？2.延长变性时间对反应有何影响？3.PCR循环次数是否越多越好？为何？4.如果出现非特异性带,可能有哪些原因？实验二DNA目的片段的
19、回收与DNA的体外连接一、目的和要求学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片断的基本技术，掌握目的DNA与载体连接的操作技术。二、实验内容1、从脂糖凝胶中回收酶切DNA目的片断(APPAPXI)。2、目的DNA片段与载体连接。三、仪器和实验准备1、器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴槽。2、试剂电泳缓冲液，溴化乙锭溶液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液，DNA分子量标准，DNA凝胶回收试剂盒。T载体，pMAL-c2X酶切载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddH2O。3、实验准备配制TAE电泳缓冲液
20、（10储存液），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；1.5ml离心管装入饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。四、实验原理DNA酶切片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA片断。在Mg2+和ATP存在下，T4DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。五、实验步骤1.DNA目的片段的回收（1）用1TAE
21、配制1%琼脂糖凝胶。（2）在胶上加样孔中加入50lDNA，电泳。（3）在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。（4）按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收DNA目的片段：1）SangonUNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作步骤：（1）按400ml/100mg凝胶的比例加入BindingBufferII，置于50-60水浴中10min，每2min混匀一次，使胶彻底熔化。（2）将熔化的胶溶液移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min。（3）8000rp
22、m室温离心1min。取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液。（4）将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500mlWashSolution，8000rpm室温离心1min。（5）重复上一步洗涤一次。（6）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回到同一个收集管中，12000rpm室温离心1min。（7）将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml微量离心管中，在柱子膜中央加40mlElutionBuffer（或ddwater，pH7.0），室温或37放置2min（55-80洗脱效果更好）。（8）12000rpm室温离心1min，离心管中的液体就是回收产物。2）华美生物公
23、司的RESINcolumnTM琼脂糖DNA纯化系统操作步骤：（1）向切割下来的胶块中加入等体积的熔胶剂，65水浴5-15min直到胶完全融化。（2）充分混匀琼脂糖-DNA纯化树脂，抽出0.6ml树脂悬浮液加入到0.2-0.6ml溶胶液中，颠倒4-5次混匀。（3）抽出注射器活塞，将注射器筒插入微量离心柱，并拧紧。然后将树脂-DNA混合物加入注射筒，静置1min。（4）将注射器活塞插入注射器，缓慢用力向下压，排出所有的液体和空气。（5）从微量离心柱上拔掉整个注射器，抽出活塞，将注射器筒插入微量离心柱，并拧紧。（6）将2mlI-型柱子清洗液加入注射器。将注射器活塞插入注射器，缓慢用力向下压，排出所有
24、的液体和空气。（7）取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新的1.5ml无盖离心管，并拧紧。（8）向离心柱中加入150ulI-型柱子清洗液，15000rpm室温离心1min。（9）将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管，并拧紧，向离心柱中加入30-50ulTE或ddwater，静置1min，12000rpm室温离心20s，洗脱DNA。（10）可取2l-5l回收产物电泳，检测是否有目的DNA带。2.DNA的体外连接1）PCR产物与T载体直接连接：（1）取一个灭菌的PCR管，加入：4mlPCR产物混合液1mlT载体0.5mlT4DNA连接酶（TaKaRa,350U/ul）1ml连接酶缓冲液3.5m
25、lddWater总量10ml体系（2）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C水中保温过夜。（3）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。2）DNA回收片断与载体（pMAL-c2X）连接：（1）取一个灭菌的PCR管，加入:4ml回收DNA片断1ml酶切后回收的pMAL-c2X载体0.5mlT4DNA连接酶（TaKaRa,350U/ul）1ml连接酶缓冲液3.5mlddH2O总量10ml体系（2）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16C干式恒温仪（或PCR仪）中保温过夜。（3）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。实验三重组DNA的转化一、目的和要求学
26、会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞，掌握重组DNA转化感受态受体细菌技术。二、实验内容三、仪器、设备和实验准备1、器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml微量离心管，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。2、试剂E.coliDH5a，E.coliBL21（DE3），LB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液，无菌ddWater3、实验准备1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液（灭
27、菌），无菌ddWater，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。四、实验原理细菌在0CCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态（感受态）。质粒DNA粘附在细菌感受态细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长，从而得到重组DNA转化菌。五、实验步骤1感受态细胞制备（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台
28、中加入2mlLB（不含抗菌素！）培养基。（2）从超低温冰柜中取出DH5a菌种和TB1菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2mlLB培养基的试管中，37摇床培养过夜。（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37下250r/min摇床培养23h，测定OD590为0.375（0.40.6，细胞数108/mL，此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。（4）将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000rpm离心10min。（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml冰冷的0.1mo
29、l/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。（6）4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。（7）4，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200L冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100mL分装到1.5mL离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80超低温冰柜中保藏（可存放数月）。（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。2重组DNA的转化（1）事先将恒温水浴的温度调到42。（2）从-70超低温冰柜中取出一管（100L）感受态菌，立即用手指加温
30、融化后插入冰上，冰浴510min。（3）加入5L连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。（4）轻轻摇匀后插入42水浴中12min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置35min。（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500LLB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37震荡1h。（6）在超净工作台中取上述转化混合液100300L，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40L2%X
31、-gal，7L20%IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。（8）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37恒温培养箱过夜。（9）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。（10）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。六、实验注意事项（1）调准转化温度，控制好热冲击时间。（2）制备Amp平板时，严禁温度过高时加入Amp，防止抗生素失效。七、思考（1）制作感受态菌的过程中，应注意那些关键步骤？（2）CaCl2溶液的作用是什么？（3）影响转化效率的因素有哪些？（4）白色菌落出
32、现的原理是什么？实验四重组DNA的鉴定一、目的和要求学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。二、实验内容酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。三、仪器、设备和实验准备1、器材旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。2、试剂LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内切酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/LMgSO4，0.025mol/LTrisClpH8.0）。3、实验准备无菌ddwater，
33、1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/mL氨苄青霉素。四、实验原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。五、实验步骤方法一：酶切鉴定（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mLLB（含50mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mLLB（含50mg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。用此
34、法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。（3）37摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4冰箱中。（4）将提取到的3管质粒样品与空质粒同时电泳，根据分子量判断和选区有插入片段的质粒，然后可用酶切、与目的片段一同电泳来鉴定其上的外源插入片断大小是否与预期相符。（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL菌液与500mL65%甘油混合后-80保存。（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。方法二：快速PCR筛选法（1）在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，接
35、种到1mlLB液体培养基中，37过夜培养。（2）在0.2mlPCR微量离心管中配制25l反应体系。ddwater17.5l10PCRbuffer2.5l2.5mmol/LdNTP2l（每种dNTP终浓度0.2mM）10mol/LPrimer11l（12.525pmoles）10mol/Lprimer21l（12.525pmoles）Taq酶0.5l（1.5u）菌液0.5l总体积25l（3）设置PCR仪的循环程序：945min9430s5630s723min30sgoto30times7210min（4）PCR结束后，取5l产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片断同时比对）。观察胶上是否有预计的主
36、要产物带。（5）根据需要进行放大培养提取其质粒。（6）提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，用酶切以进一步确认。六、思考（1）PCR法筛选的优点和缺点是什么？（2）酶切法与PCR法筛选方案哪个更可靠？（3）最终确认克隆的方法有哪些？实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达一、目的和要求了解外源基因在原核细胞中表达的特点，掌握原核诱导表达操作。二、实验内容IPTG诱导pMAL-c2XAPXI重组转化菌的表达。三、仪器、设备和实验准备1、器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml微量离心管，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光
37、度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。2、试剂LB培养基（加抗菌素），100mg/mlIPTG，20%葡萄糖3、实验准备无菌ddwater，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/mlIPTG（过滤灭菌）（100ml分装，-20C保存），100mg/mL氨苄青霉素（过滤灭菌）（100ml分装，-20C保存）。配制20%葡萄糖（8磅灭菌20分钟，添加至上述LB中，终浓度为0.2%）。四、实验原理外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下
38、游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。五、实验步骤（1）晚上9：00接种。在超净工作台中接种含有pMAL-c2XAPXI重组载体的菌株，培养于两个三角烧瓶各20mlLB-葡萄糖培养基（含抗菌素Amp120g/ml）的摇菌管中，70-90转/分钟30C摇菌过夜。（2）至第二天上午8：30OD600约为0.5，加IPTG至100g/ml，150-170转/分钟37C诱导1.5-3h。同时做不加IPTG诱导和非转化的空菌诱导的对照培养。（3）4000rpm离心15
39、min弃掉上清液，收获菌体，SDSPAGE电泳分析。菌体也可放在-20C以下保存备用。（4）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。六、思考（1）IPTG的作用原理是什么？（2）为什么要增加抗菌素的用量？实验六表达产物的检测与分析-SDS-PAGE一、目的和要求学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白。二、实验内容SDS-PAGE检测分析pMAL-c2XAPXI转化菌表达产物。三、仪器、设备和实验准备1、器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配
40、套的玻璃和密封条、梳子等，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，饭盒。2、试剂SDS（十二烷基磺酸钠），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N-亚甲基双丙烯酰胺），Tris（三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，盐酸，Aps（过硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量标准（97.4，66.2，43，31，20.1，14.4kDa），溴酚蓝，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巯基乙醇，考马斯亮蓝R250，甲醇，乙醇。3、实验准备n 4X分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCLpH8.8,0.4%SDS溶液,4保存；n 4X浓缩胶缓冲液：0.5mol/LTris-HCLpH6.8,0.4%SDS，4保存；n 1.
41、5mol/LTrisHCl，pH8.8（4C保存）；n 0.5mol/LTrisHCl，pH6.8（4C保存）；n 30%Acr/Bis（30gAcr+0.8gBisddwater定容至100mL，4C保存）；n 10%Aps（-20C保存）；n 2上样缓冲液（0.5mol/LTrisHCl，pH6.82mL，甘油2mL，20%SDS2mL，0.1%溴酚蓝0.5mL，b-2-巯基乙醇1.0mL，ddwater2.5mL，室温存放）；n 5电泳缓冲液（Tris7.5g，甘氨酸36g，SDS2.5g，加ddwater至500mL，使用时稀释5倍）；n 考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R2500.25g
42、+45ml甲醇+10mL冰醋酸，用ddwater定容至100mL）；脱色液（95%乙醇：冰醋酸：水=4.5：0.5：5，体积比）；四、实验原理蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。五、实验步骤（1）将表达后的菌体与2上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。（2）用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定要将超声波探头插入容液底部，在溶液表面或上部时容易起泡！（3）将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮35min。然后立即插入冰中。（可在-20C冰柜中保存）。（4）按照教
43、师的演示组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住（不能夹玻璃的上端以免以免夹断玻璃的突出段！）。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记。（5）配制10%分离胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（注意Tris为pH8.8）：10分离胶单位：ml4X分离胶缓冲液3.95H2O5.930丙稀酰胺5.010过硫酸胺0.15TEMED0.006总体积：15（6）加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回
44、移动加满ddwater（尽可能不破坏下面的胶液）。然后静置30min。直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏水，并倒置玻璃尽可能将水倒尽。（7）配浓缩胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（注意Tris为pH6.8）：5浓缩胶单位：ml4X浓缩胶缓冲液1.04H2O2.230丙稀酰胺0.6710过硫酸胺0.04TEMED0.004（8）加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min。烧杯中剩下的溶液倾斜放置直到溶液凝固。（此状态可以用塑料薄膜包起来放入冰箱过夜）。（9）小心拔出梳子以后，
45、用注射器针头（剪平尖部）吸取梳子齿形成的加样槽中的水，并修平加样槽底部的胶面。（10）选取几个形态好的加样槽，在一张纸上做好对应的标记，用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入20mL蛋白分子量，其它槽中加入1020mL自己制作的样品。（11）加完样品后，再用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平。电泳槽上部倒满电泳缓冲液（约250ml,淹没过加样槽的液面！），电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180ml）。（12）接好电极，将电流调至10mA，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电流调至18mA，电泳约23h，期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）！当溴酚蓝移到玻璃距
46、底部0.5cm时切断电源。（13）在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。（14）倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃，小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃板撬起（切不可损坏胶！）。用铲子切去上部的支持胶，并把分离胶从玻璃上剥离倒染液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。（15）染色2h后，将染液倒回瓶子里以备重复使用。把胶移入脱色液，过夜。（16）观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量（APXI蛋白约110kDa），判断是否是预期的基因产物。（17）清理桌面，写实验报告。六、思考（1）影响表达的因素有哪些？（2）如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？（4）本实验能否判断表达产物一定是APXI蛋白？还需要什么方法？（5）如何估计表达产物的分子量？附录1本实验使用表达载体相关资料IMPACTTMpMXB10蛋白表达纯化载体(蛋白单柱亲和纯化)概述:NEBIMPACTTM系统是一种新型的蛋白融合表达及纯化系统，能应用到蛋白质工程的许多重要领域。IMPACTTM表达的目的蛋白与蛋白自剪接元件(称为内含肽，intein)及几丁质结合蛋白形成融合蛋白,通过