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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。UVC诱导的嗜盐细菌Halococcushamelinensis溶解基质的DNA损伤修复的分子鉴定-JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology102(2011)140145UVC诱导的嗜盐细菌（Halococcushamelinensis）溶解基质的DNA损伤修复的分子鉴定摘要：我们从鲨鱼湾（澳大利亚西部）的有生命的叠层石分离到了嗜盐古细菌（Halococcushamelinensis），众所周知这些嗜盐古细菌抑制暴露在极端的盐度，干旱和UV辐射的条件
2、下。现代叠石层被认为是地球上早期生命的同源物，并且也因此乘务了现代叠石层的存在位置，并且Halococcushamelinensis是用来检测古细菌对高强度UV辐射的最特别，以及最合适的候选对象。把这种有机体暴露于高剂量（上限500J/m2）的标准杀菌UVC（254nm）辐射下，并且评估了包括存活、TT环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）的形成、以及DNA修复在内的所有效应。结果显示，Hcc.Hamelinensis能够在高强度的UVC辐射下生存，并且完整的细胞表现出增加的DNA保护水平（通过春化DNA），有机体会部分屏蔽来进行类似细菌的核酸切除修复(NER)基因：uvrA,uvrB,uvrC，也包括
3、光聚酶phr2基因。这4种基因已经全部发现了，并且我们还调查研究了光照或者黑暗条件下，这些基因再修复过程中的表达水平的变化，通过实时定量PCR（Real-Time(qRT)PCR）的方式链检测这种水平的变化。在两种修复条件下，在本研究中我们获得的和呈现的数据显示uvrA,uvrB,和uvrC基因会受到正调节。在暗修复过程中光聚酶phr2基因会被诱导，而在光照条件下的修复过程中光聚酶phr2基因呈20倍的增长。本研究中呈现出来的数据是对Halococcus（盐球菌属）在暴露在高强度UVC水平后的不同修复机制的进行的第一次分子生物学研究。关键词：嗜盐古细菌；DNA损伤；修复机制；UVC辐射；太空生
4、物学1引言保护和修复它们的DNA过程，对有机体维持它们的基因组是非常关键的。UVR是最普遍的环境诱变剂，在地球生命进化的过程中是一种重要的环境控制控制因子，并且它们对现代日常生活有着深远的影响1。然而，除了它的有害效应之外，UVR在生命进化的过程中起着着非常重要的作用，他是一种有效的天然存在的诱变因素，能够是有机体产生遗传多态现象，是生命进化的基础1,2。生命蓬勃发展的远古时代(3.82.5Gaago),有机体不得不应对UV辐射的(220nm)的影响，UV辐射带来的生物学影响要比先前(290nm)高1000倍，由于缺乏平流层的臭氧层，臭氧层是在2Ga之前形成的，它充当着一种有效的UV屏障3,4
5、。在远古时代也存在嗜盐古细菌，因此成为我们用于高UVC辐射对微生物影响的最佳研究对象。现如今，嗜盐古细菌正在剧烈的太阳辐射造成的蒸发态高盐极端环境下生长5。我们已经广泛研究了古生菌中盐杆菌科的一些典型代表，它们对于高UVR辐射的反应(例如.,嗜盐杆菌属sp.69和沃氏富盐菌10)。这个家族的成员是通过优化它们自身的基因组和蛋白质组的结构来降低UVR引起的损伤11。例如，嗜盐菌NRC-1不仅能够在高剂量的UVC辐射的情况下生长，并且还具有有效的机制来检测和修复UVR辐射引起的DNA损伤9,12。对盐杆菌科的其他成员也做了类似的研究，对盐球菌属的研究还比较少。虽然盐球菌属实非常好的有机体来研究环境
6、耐受性，尤其是它们独特的细胞壁组成使它们能够与很好的应对环境应激因素13,14。大体上而言，远古的没有细胞壁的细菌，几乎所有分类群体的细菌中（除了少数几个除外），它们的肽聚糖中含有很多的化学变化形成坚硬的细胞壁14。盐球菌属的细胞壁的脂类的组成是无极性的氨基糖、糖醛酸、和一种特殊的甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸的混合物14。我们认为它们有能力生存与不理的环境条件下，例如低盐（NaCl）环境15，地下盐矿床16以及模拟火星大气17,18。此外，目前的研究比较感兴趣的物种，我们从现代叠石层中分离到了嗜盐菌，它们能够在高强度的UVR环境下很好的生长19。生存与高的UVR水平下需要依赖于3种因子：回避，防护以
7、及修复能力20,21。有机体会使用沙，蒸发岩以及其他形式的屏蔽无来保护自己免受太阳辐射的损伤22。例如，当有1mm后的岩石的覆盖有机体就可以生存与高剂量的UVC辐射下23,24。对于有机体来说，保护作用是一种刺激重要的关键因子，例如一些蓝细菌，它们能够产生类胞素类氨基酸（MAAs）以及色素scytonemin来保护他们免受310nm-370nm长度的UVR射线的影响25,26。修复UV诱导的损伤时第三种关键因子，它可以使有机体重建遗传信息成为可能。UV诱导的DNA损伤包括，DNA链的断裂，由于UVB或者UVC辐射直接影响产生的光产物，或者通过活性氧簇的光化学产物产生间接的损伤，它们的修复机制还
8、要依赖于他们的损伤类型。在自然条件下，UVB诱导的两种主要的光产物是环丁烷嘧啶二聚体（CPD）其中最常见的是胸腺嘧啶二聚体，和(64)光产物9。以下介绍了几种细胞检测和修复DNA损伤的机制。在细菌和真核生物中以核酸切除修复（NER）为主，并且很多学者也对这方面做了大量的研究27,28。简单的说，细菌的NER包括4种关键蛋白：UvrA和UvrB(用于是被DNA损伤),UvrC(作为外切核酸酶在损伤的任何一端形成切口)和UvrD(一种DNA解旋酶II)9。之前已经表明了UvrA,UvrB,和UvrC蛋白对UVR诱导的Hbt.sp.NRC-1损伤的修复是至关重要的29。一种替代复杂的核酸切除修复多步
9、路径的修复方式是，光复活作用，这是一种耗能低的，更直接的，因此这也是一种不容易产生错误的逆转嘧啶二聚体变成它们的单体形式的修复机制30,31。光聚酶是分类学上广泛存在的，包括脊椎动物（例如：鱼），爬行类动物和有袋类动物31。此外，我们知道的一些其他的修复路径是：碱基切除修复(BER)和DNA选择切除修复(AER)，这两种修复方式在其他的一些文献中都已经有了详细的描述28,32。就我们已知的各种修复路径，我们使用嗜盐细菌作为模式生物来研究，远古光能自养型细菌时如何修复UVC诱导的DNA损伤的。为了无别光复活修复作用和光独立的修复机制，我们对比了有光和无光情况下它们的修复机制。细菌类的核酸切除修复
10、基因的调节，我们已经检测了光聚酶基因，以及我们将会讨论这些基因在模式有机体中存在光照时的相关调节。2材料与方法2.1生长条件把嗜盐细菌培养在20ml的改良的DSM97培养基中，该培养基中包括2.6MNaCl，并且加入7.23gMgCl26H2O和2.70gCaCl22H2O（1L的条件）19，是在通气的条件下培养的。培养物置于37的条件下，振荡培养，并且有光照培养至指数增长期(5108cells/ml)。样品首先暴露于光照下，然后用2.6MTNbuffer(2.6MNaCl和100mMTris;pH7.5)清洗样品3次来去除菌种生长的培养基。通过分光光度计的测量证实纯的TN-buffer在25
11、4nm的波长下没有光吸收能力(数据为显示出来)。2.2暴露在UVC辐射下将10mL的洗过的样品置于培养皿（直径为90mm）中，用GE杀菌灯等UVC来照射该培养皿。所有的实验都在生物学层面上重复了3次。UVC光线的强度是42W/cm2，波长为254nm,用高分辨率的光谱仪(HR4000,OceanOptics)进行测量。UVC辐射的量是根据1mW/m2/s=1mJ/m2公式计算出来的。把样品先暴露在（往往要达到30min才能达到高的通量）含有白光照射的房间里面，然后再用UV照射，分别为：0,25,50,75,100,150,200,300,400,和500J/m2，室温条件下。在暴露在UV辐射之
12、后，立即将样品置于冰上，用铝箔覆盖在上面来阻止光酶性的修复，然后再立即进行处理，使修复反应的发生铝达到最低。为了确定辐射后的存活率，我们把样品进行了几个不同梯度的稀释，再把这些稀释了的样品置于改良的DSM97的琼脂平板上，37条件下培养2周。2周后，通过数菌落形成单位(cfu)来确定它们的存活率。2.3DNA的分离使用先前描述的XS-buffer的方法来分离DNA33。简单的说，将细胞沉淀重悬于500LXS-buffer(1%乙基磺酸钾,100mMTrisHClpH7.4,20mMEDTApH8,1%SDS和800mM乙酸铵)。样品进行强烈的涡旋振荡，并且在65条件下培养120min，然后用酚
13、氯仿（25:24:1）提取DNA，乙基用异丙醇法纯化DNA34。纯化的DNA重悬于100LdH2O，保存于-30下待用。2.4胸腺嘧啶环丁烷嘧啶二聚体的鉴别根据Sinha等实验记录中的一些试验方法来检测嘧啶二聚体35。使用SpectraMaxPlus384(MolecularDevices)分光光度计(OD260nmof1.0equals50ngofDNA)对纯化的DNA进行定量检测。用1/10体积1MNaOH的样品使样品变性，在80条件下培养30min。将等量的样品（200ng）涂到浸湿的AmershamHybondTM-LFP膜上，将膜置于80条件下烘干30min。室温下，将膜置于PBS-
14、Tbuffer+5%ECL（先进的TM阻塞反应物GEHealthcare）中1h，使非特异性的结合位点被阻塞。然后把膜再置于37下2h使它含有初级抗体(小鼠抗胸腺嘧啶二聚体,KamiyaBiomedical;用PBS-T1:3000进行稀释)。然后用PBS-T将膜清洗3次，并且在二级抗体中培养1h(羊抗小鼠IgG含有Cy3,KamiyaBiomedical;用PBS-T+5%ECLadvancedTMblockingreagent进行1:1000)。再次对膜进行清洗，并且在TyphoonTrioScanner(AmershamBioscience)直接观察嘧啶二聚体。2.5修复机制为了确定细菌
15、类的NER途径以及目前在有机体中发现的光聚酶基因phr2，我们分别设计了简要的引物来保护细菌类的核酸切除修复的基因uvrA,uvrB,和uvrC，也设计了光聚酶基因phr2的引物。我们从NCBI数据库中获得的一些一些抑制蛋白质的序列，我们使用了ClustalW来鉴别它们中的高度保守的区域并且进行排列。把这些排列好的区域提交到网络引物设计的程序CODEHOP，依据保守区域产生了一些简并的引物36(Table1)。我们根据梯度PCR的条件扩增了不同的基因：最初94变形3min；94：20s，6555（退火梯度温度）30s，72：1.5min（循环34次）；最后72延伸10min。扩增的查无进行1%
16、的琼脂糖凝胶电泳来进行观察（染色使用的是：GelStarNucleicAcidGelStain）。后来的PCR扩增，将其产物进行TOPOTA克隆（试剂盒），根据说明书进行操作。筛选阳性克隆，用说明书中提供的T7和T3引物进行序列分析。为了对序列的统一性进行鉴定，把得到数据与NCBI数据库中的序列进行核对37。序列中与uvrA,uvrB,uvrC和phr2有高度相似性的，把它用于设计的实时定量PCR(qRT-PCR)的引物(Table1)。为了阐明存在和不存在光时的修复作用的区别，把复制的10mL的样品置于全部剂量（75J/m2）的辐射下，使用的是先前提到的紫外杀菌灯。样品进行离心：10,000
17、g，5min，把沉淀转化到20mL预热的改良的DSM97培养基中，37下分别在荧光灯或者黑暗条件下培养。在6,10,12,16,20,24,36,和48h后分别取样，用上面提到的方法提取DNA，仍然存在的嘧啶二聚体可以通过上面提到的dot-blot系统进行定量。表1本研究中计划和使用的引物a密码子:N:A,T,C或T;Y:C或T;R:A或G;M:A或C;W:A或T;D:A,T或G.b最佳的退火温度以的形式表示出来了2.6RNA的提取和qRT-PCR为了进一步研究uvrA,uvrB,uvrC和phr2基因参与的UV诱导的DNA损伤修复，将样品（10mL）置于75J/m2的UVC辐射下。在紫外辐射
18、暴露之后，将3份样品进行离心（5000g，10min），将沉淀转移到20mL预热的改良的DSM97培养基中，37下分别在荧光灯或者黑暗条件下培养。在0,10,30,后60min分别取样(1.5ml)，用Pinto等的方法提取总RNA38。RNA提取之后，把每一个时间点取出的3份样品混合，用20UDnase(2U/ll)(Ambion)对总RNA37处理1h。任何残留的DNA都要进行RNA检测，通过用1L的样品作为模板进行PCR，也包括从嗜盐细菌中纯化的20ng的DNA已经失效的RNA，进行PCR的条件是：最初95变形2min；94：15s，60：30s（循环40次）。结果通过2%的琼脂糖凝胶电
19、泳进行观察（加入1%EB的燃料）。RNA样品中不包括任何残留的DNA，并且使用分光光度计(SpectraMaxPlus384,MolecularDevices)对RNA样品进行定量测定。总的RNA用于cDNA的合成（使用的是SuperScriptTMPlatinum两步法qRT-PCR试剂盒，带有SYBRGreen），根据说明说进行操作。uvrA,uvrB,uvrC和phr2基因(Table1)进行qRT-PCR所使用的引物是通过网络设计程序PRIMER339设计出来的。在进行qRT-PCR之前，先用引物浓度为100,200,300,400,和500nM进行检测，从而得出最有效引物的浓度。PC
20、R的产物进行测序，将测序结果与NCBI数据库中的数据进行比对，从而确定我们所需要的目的基因已经得到了扩增。此外，从有效引物检测所得到的产物进行分光光度计的定量测定，从而我们可以确定用于每一种目的基因的标准曲线绘制所需要的引物的量。每一种目的基因至少要进行3次实时PCR（RTPCR）扩增。每一次的反应体系中包含：2L模板，200nM最是引物，12.5LPlatinumSYBRGreenqPCRSuper-Mix-UDG，以及10LDEPC-H2O，终体积为25L。每一种基因的对照模板都进行了不同程度的稀释，用于检测的目的基因的标准曲线的绘制。同过阈值循环（CT）的自然对数与分子数的而自然对数的比
21、值来获得标准曲线40。CT值的确定是根据扩增产物出现明显增加的循环数。用解链曲线分析来对样品进行分析，并且用2%的溴化乙锭进行染色的琼脂糖凝胶进行分离。3结果3.1暴露在UV下的存活率以及DNA损伤我们估测了在辐射强度高达500J/m2下，嗜盐细菌的存活率，我们也对比了完整细胞和裸露DNA的嘧啶二聚体的形成概率(Fig.1)。测得的数据显示，当UV辐射的剂量增加到300J/m2时，细菌的存活率会发生稳定的降低；当UV辐射的剂量从300J/m2到增加500J/m2时，cfu的数量基本保持常量，没有显著的变化。我们也观察到，嘧啶二聚体的形成也伴随着UV辐射的增加而增加，与完整细胞的DNA细胞裸露的
22、DNA会受到更多的损伤。这表明，与裸露的DNA相比，完整细胞的DNA好像会受到某种保护来抵御UVC射线的损伤。裸露细胞的光产物的诱导产生率比细胞内的DNA高，这可能是在后来的条件下启动DNA修复程序的结果。图1暴露在UVC辐射后，嗜盐细菌的存活率和嘧啶二聚体的形成。裸露DNA和完整细胞产生的嘧啶二聚体以的每一个巨碱基中的嘧啶二聚体（TT/Mb）的形式显示出来。所有的值都是三个分析样品的平均值，并且平均误差是以百分比的形式来体现标准方差的。3.2修复机制在图2（Fig.2）中分别展示了光修复条件下和暗修复条件下，UVC诱导产生的环丁烷嘧啶二聚体的修复率，图中展示的是随着时间的推移二聚体的降低。结
23、果显示，当暴露于可见光下嗜盐细菌能够在16h内修复UVC诱导的损伤(75J/m2)；如果没有光存在，嗜盐细菌也可以在24h内修复UVC诱导的损伤(75J/m2)。经过36h的修复之后，我们没有检测到嘧啶二聚体的存在（数据未显示）。图上的数据表明，存在光复活修复的有机体（也包括对光的存在没有依赖性的修复系统），需要更长的时间来清除嘧啶二聚体。3.3uvrA,uvrB,uvrC,和phr2基因的筛选我们设计的细菌类的NER基因uvrA,uvrB,uvrC,和光聚酶基因phr2(Table1)的简并引物对应的蛋白质的氨基酸顺序与我们从NCBI数据库中获得的数据相比会有所调整。通过这种方法，我们可以鉴
24、定出嗜盐细菌中这四种基因的部分序列。我们把所有序列的数据全部提交到NCBI数据库，得到了一下的登录号：uvrAHM063473,uvrBHM063474,uvrCHM063475和phr2HM063472.3.4光修复和暗修复下的基因表达我们检测了在75J/m2UV-C辐射下，我们所假定的修复基因的表达水平，修复的时间达到60min。我们分别对在UVC辐射0,10,30和60min的样品（3份），使用qRT-PCR来检测uvrA,uvrB,uvrC,和phr2基因的表达水平。我们把培养0min的样品所获得的值设定为1(样品的起始分子数)，并且所有的值都会与正调节(1)或者负调节(1)的值进行比
25、较。图2嗜盐细菌光修复和暗修复的差别，三个分子样品的平均值和标准方差是以我们所观察到的修复百分比的形式给出的。在黑暗条件下，uvrA,uvrB和uvrC基因在修复过程发生的前10min会发生适度的正调节，这与我们所观察到到比例大体上近似(Fig.3)。进行30min的培养，这种趋势会加强，但是，三种基因的正调节比例会发生改变。uvrA和uvrB的正调节的比例分别为1.78-fold和2.41-fold，而我们发现uvrC基因的正调节是3.7-fold。在接下来培养的60min，我们没有观察到这些基因的正调节有进一步明显的的改变。经过10min的培养，光聚酶基因phr2会有外部的正调节，然而，再
26、经过30min的培养，这些基因的表达会回到起始的比例。在光照条件下，我们调查研究的四种基因经过60min的培养会有正调节，phr2基因(19.66-fold)的正调节比例最高(Fig.4)。与我们在黑暗条件下所观察到的结果相比，uvrA(5.44-fold)和uvrB(4.98-fold)基因的正调节水平相似，而uvrC基因的正调节水平达到7.22-fold。在30min和60min之间，phr2和uvrC基因的表达水平的都会有最高的增长率。4讨论本研究是第一个研究基质溶解的微生物对UV损伤的反应的，所以因此对于理解早期生命的进化和适应有着深刻的涵义。据我们所知，本研究是第一个从分子生物学的额
27、角度研究盐球菌属的任何成员的，我们调查研究了暴露在高强度的UVC辐射下的不同的修复机制。实验中所呈现的数据清除的显示了，嗜盐菌能够在高剂量的UVC辐射(可以高达500J/m2)下生存，它们有细菌类的uvrA,uvrB,和uvrC基因，可以进行NER机制，也含有光聚酶基因phr2。结果也显示在DNA损伤修复的过程中都会发生正调节。在这些物种中，细胞的存活和嘧啶二聚体形成的结果都闲是在图1中。这些数据表明嗜盐菌暴露在300,400和500J/m2的辐射下，它们的存活率保持着相对稳定状态，然而这种结果的出现很可能是由于我们的所涉及的实验方案所造成的，上层的细胞会遮住位于下层的细胞，因此可以保护下层的
28、细胞免受UVC辐射的影响。我们目前的研究中的这些结果也表明了，细胞内的DNA与裸露的DNA就形成嘧啶二聚体方面的差别(Fig.1)。我们可以清楚的看见，与裸露的DNA相比，细胞内的DNA受到的损伤明显要少。这种效应可能是由于细胞内的DNA受到类胡萝卜素类的物质（也称作菌红素）的保护。菌红素的最大吸收峰(kmax)是在388,468,495和530nm处（在丙酮内）41，因此并不是菌红素（类胡萝卜素）以阻止损伤发生的方式来直接保护DNA，然而，这些色素可能有助于UV损伤的恢复，通过提供能量来间接影响光复活过程中嘧啶二聚体的还原的酶41,42。图3暴露在75J/m2的UV-C辐射下，uvrA,uv
29、rB,uvrC,和phr2基因的表达，以及在黑暗环境中1h的恢复作用。在0min是取的样作为初始表达值，并且设定为1。后来的样品以-fold调节的形式与这个值进行比较。图4暴露在75J/m2的UV-C辐射下，uvrA,uvrB,uvrC,和phr2基因的表达，以及在白光下照射1h进行恢复。在0min是取的样作为初始表达值，并且设定为1。后来的样品以-fold调节的形式与这个值进行比较。我们在本研究中观察到的数据显示，将嗜盐菌暴露于荧光灯下，用75J/m2的UVC照射16h，再在黑暗环境中培养24h，嗜盐菌能够完全修复损伤(Fig.2)。再进行分子筛选，筛选出phr2光聚酶基因，也包括uvrA,
30、uvrB,和uvrC基因，结果子显示，嗜盐菌中存在着4种基因。在光修复以及暗修复的过程中，使用qRT-PCR对这些基因进行表达水平的研究，结果如图3和图4。在暗修复过程中，uvrA,uvrB,和uvrC基因会发生适度的正向调节，并且30min后uvrC基因会表现出最高的表达率。先前的研究中也报道了Hbt.NRC-1的UV损伤修复过程中的一些类似的发现，在报道中支出，修复过程中仅仅只有部分修复基因会发生正向调节12。这是由于活性氧簇所造成的氧化损伤的存在，使复制叉的复制停止，并且会出现双链DNA的断裂，自然状况下是由于一般的新陈代谢产物所造成的，因此，构成了DNA修复蛋白的存在可能是修复这些损伤
31、所必须的12,43。这项结果表明，与uvrA和uvrB基因相比，uvrC有更高的表达率，这可能归因于，有可能uvrA和uvrB基因除了有助于DNA的修复之外，还有其他重要的功能。这在先前的大肠杆菌的研究中已经有显示了，在大肠杆菌中UvrA和UvrB基因（不包含UvrC），对于选择复制系统是至关重要的；在选择复制系统中UvrA,UvrB和UvrD与另外的一些未鉴定出来的蛋白质联合起来起作用，例如多聚酶和核酸外切酶，它们能够与取代PolI酶在DNA复制中的功能27,44。目前尚且不清楚在这个阶段，在嗜盐古细菌中这种情况是否也是真实存在的，并且要阐释这些基因的额外的一些功能，进一步的研究还是非常必要
32、的，即便是这些微生物中的uvrABC系统的进一步研究也是非常必要的。这些结果出现的另一个原因可能是由于另外一种机制的存在，而这种机制在这里的细胞中是不存在的（例如：真核生物的NER）。在光修复过程中，我们观察到与uvrABC系统类似的修复模式，并且与暗修复相比的区别是，在光修复过程中修复基因的表达水平更高(Fig.4)。不足为奇，经过60min的培养，phr2基因会发生强烈的正调节效应，并且这可能是的我们观察到光照条件下修复效率更高的理由(Fig.2)。本研究提供了，初步从分子生物学的角度去了解在UVC射线照射下，嗜盐细菌的反应，并且也为进一步的研究奠定了基础，例如：可能存在的真核生物类的核酸切除修复机制以及我们在不同的修复条件下观察到代谢所用的变化。此外，使用的从叠石层分离到的有机体19，这个生态位是早期生态系统的现代模型45,46，有助于我们进一步了解在早期地球环境中有机体生存和生长的必要条件。结合先前对盐球菌的其他成员耐受性和存活率的研究17，出自按了一个很有趣的画面，可能盐球菌就是早期地球生命在现代的典型代表。-