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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。WesternBlot试剂的准备-WesternBlot试剂的准备1.30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g混匀后ddH2O，37溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。2.4分离胶缓冲液（1mol/LTris-HClPH8.8）Tris18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH8.8，定容至100ml。3.4浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HClPH6.8）Tris12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH6.8，定容至100ml。4.10%SDS：电泳级
2、SDS10.0g加ddH2O，68助溶，浓盐酸调PH7.2，定容至100ml。5.5电泳缓冲液（PH8.3）：Tris15.2g甘氨酸94gddH2O定容到1000mlSDS5g先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。6.10%过硫酸铵（AP）：0.1gAP加ddH2O至1.0ml，4保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。7.2加样缓冲液：2SDS加样缓冲液0.5mol/LTris-HCl(PH6.8)2ml10%SDS4ml-巯基乙醇1ml甘油2ml1%溴芬蓝1ml置4避光保存8.TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9.转膜缓冲液
3、(TowbintransferBuffer)：即1SDS-PAGE10.0.01mol/LPBS(PH7.4)：NaCl8.5g(12H2O)Na2HPO42.9011g(2H2O)NH2PO40.24g加ddH2O定容至1000ml11.封闭液:1PBS中加入30ml5%（V/V）脱脂奶粉1.5g0.02%叠氮钠0.006g0.05%Tween-200.015g12.漂洗液（PBST）：含0.05%Tween-20的PBS溶液每1000mlPBS溶液中加0.5mlTween-2013.水饱和正丁醇：正丁醇50mlddH2O5ml加入瓶中震荡，使结合，存于室温。用时取上面一相加在凝胶上面。14
4、.考马斯亮蓝染色法试剂：一般用G250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）染色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。（染色液多次回收利用）脱色液：90ml甲醇：水（1：1，V/V）和10ml冰乙酸的混合液15.丽春红S染色色法试剂：2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液脱色液：TBS16.Aprotinin:为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。17.PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PM
5、SF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。18.显色液：联苯胺显色液（DAB）DAB2ml10%H2O260lPBS(0.1mol/LPH6.4)10ml19.三去污裂解缓冲液0.5mol/LTris-HCl(PH8.0)0.785g/100ml0.15mol/LNaCl0.8775g/100ml0.02%叠氮钠0.02g/100ml0.1%SDS0.1g/100ml超级详细配方：SDS-PAGE、蛋白转印、WesternBlot试剂配制(*整理，2004.9.6)1.5mol
6、/LTris(PH8.8)1称量181.7gTris置于1L烧杯中。2加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解。3用浓盐酸调节pH值至8.8。4定容至1L.5高压灭菌后，室温保存。注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。（参照kara公司Catalog-N1）1mol/LTris(PH6.8)1称量121.1gTris置于1L烧杯中。2加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解。3按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。pH值浓HCl6.87.4约70ml7.6约60ml8.0约42ml4定容至1L.5高
7、压灭菌后，室温保存。注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2.如1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。30丙稀酰胺（100ml）1称量下列试剂置于烧杯中。丙烯酰胺（Acrylamide）29g双丙烯酰胺(BIS)1g2加入约60ml去离子水，充分搅拌溶解。3定容至100ml,用0.45µm滤膜滤去杂质。5于棕色瓶中4oC保存。注意：1.丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能
8、含有少量的未聚合成分。（参照kara公司Catalog-N1和分子克隆二版P924）10SDS1称量10g高纯度（电泳级）的SDS置于100200ml烧杯中。2加入约70ml去离子水，68oC加热溶解。3滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。4定容至100ml，室温保存。（参照kara公司Catalog-N1和分子克隆二版P924）10过硫酸铵1称量1g过硫酸铵。2加入约10ml去离子水后搅拌溶解。3储存于4oC。注意：10过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右，超过期限会失去催化作用。（参照Takara公司Catalog-N1和分子克隆二版P924）1SDS凝胶加样缓冲液50mmol/LTri
9、sCl(pH6.8)100mmol/LDTT2%SDS（电泳级）0.1%溴酚蓝10%甘油不含DTT的1SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前必须从1mol/LDTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。（参照分子克隆二版P884）本人将参照此配方，配成5或6，各成分浓度均扩大5倍。另:Takara公司Catalog-N5上的5SDSPAGELoadingBuffer配方：组分浓度：250mmol/LTrisCl(pH6.8)10%(W/V)SDS（电泳级）0.5%(W/V)溴酚蓝（BPB）50%(V/V)甘油5%(W/V)-巯基乙醇（2-ME）配制量5ml配制方法1称量下列试剂置于10ml塑料离心
10、管中。1MTrisCl(pH6.8)1.25mlSDS（电泳级）0.5g溴酚蓝（BPB）25mg甘油2.5ml2加去离子水溶解后定容至5ml。3小份（500ul/份）分装后于室温保存。4使用前将25ul的2-ME加到每小份中。5加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。1mol/LDTT(20ml)1称取3.09gDTT，加入到50ml塑料离心管中。2加20ml的0.01MNaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22m滤器过滤除菌。3分装后20oC保存。（参照分子克隆二版P884）3M醋酸钠（NaOAc）（100ml）1称取40.8gNaOAc3H2O置于100200m
11、l烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。2加冰醋酸调节pH值至5.2。3定容至100ml，高压灭菌后室温保存。（参照分子克隆二版P884）0.01MNaOAc(pH5.2)参照此配方配制。5Tris-GlycineBuffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）组分浓度：0.125MTris,1.25MGlycine,0.5%(W/V)SDS1称量下列试剂置于烧杯中。Tris15.1gGlycine94g10%(W/V)SDS（电泳级）50ml2加入约900ml去离子水搅拌溶解。3定容至1L，室温保存。（参照分子克隆二版P884）TransferBuffer:自配TransferBuffer:
12、500ml25mMTrisbase,0.2Mglycine（甘氨酸）,20%methanol(甲醇PH8.5)先配制1MTrisbase(MW:121.1)100ml:12.1gTrisbase+ddH2O至100ml,PH约111M12.5mlTrisbase+7.5gglycine(MW:75.05)+100mlmethanol+ddH2O至400ml,调好PH值，再加ddH2O至500ml.先置于4oC保存备用。（参照吴兴军给Protoco,据说优于分子克隆配方）丽春红S储存液（10）丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml。用1份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使
13、用液，使用后应予废弃。10XTBS(Tris-bufferedsaline):Toprepare1literof10XTBS:24.2gTrisbase,80gNaCl;adjustpHto7.6withHCl(useat1X).（参照CellsignalTechnologyProtoco）WashBufferTBS/T:1XTBS,0.1%Tween-20自配WashBufferTBS/T:1000ml1TBS,0.1%Tween-20,100ml10TBS+1mlTween-20+900mlddH2O（参照CellsignalTechnologyProtoco）BlockingBuffer
14、:1XTBS,0.1%Tween-20with5%w/vnonfatdrymilk。自配Blockingbuffer:150mlfor150ml,add15ml10TBSto135mlwater,mix.Add7.5gnonfatmilkandmixwell.Whilestrirring,add0.15mlTween-20(100%).(现用现配，4oC储存备用)（参照CellsignalTechnologyProtoco）PrimaryAntibodyDilutionBuffer:1XTBS,0.1%Tween-20with5%blockingagent;for20ml,add2ml10XTBSto18mlwater,mix.Add1.0gBSAandmixwell.Whilestirring,add20µlTween-20(100%).-