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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤-CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜（约16小时）；2取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；54下3000g冷冻离心5分钟；6弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶
2、液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；74下3000g冷冻离心5分钟；8弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%-20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜；2取2ml过夜培养物转接于200mlLB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4吸取1.5ml培
3、养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；54下3000g冷冻离心5分钟；6弃去上清，加入1500l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；74下3000g冷冻离心5分钟8弃去上清，加入750l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；94下3000g冷冻离心5分钟10加入20l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11立即使用或迅速置于-70超低温保存。附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控
4、制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5107/ml）；2所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7一定范围内，转化效率与外源DNA
5、的浓度呈正比；感受态细胞转化效率的检验为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/gDNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率.计算公式：转化效率产生菌落的总数/铺板DNA的总量。例如，取1l（0.1ng/l）完整的质粒转化100l的感受态细胞.向转化反应液中加入900l培养液，让细菌恢复一小段时间，取100l铺板.培养过夜，产生1000个菌落。转化0.1ngDNA，用SOC稀释到1000l后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01ngDNA质粒，所以转化率1000克隆/0.01ngDNA=105cfu/ng=
6、108cfu/g.转化效率1106cfu/gDNA可满足普通的亚克隆实验；1107cfu/gDNA用于作更复杂的亚克隆，有限量的DNA的转化，T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为1108cfu/gDNA高效感受态细胞制备方法一：效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。实验试剂：A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液称取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放
7、入灭菌锅121高压灭菌备用。取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3mlA液，混匀冰浴即可使用。实验步骤：1、划线得到单菌落,37培养箱培养约17小时。2、挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100mlSOB培养基的三角瓶,37剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时。3、将培养温度调至18剧烈振荡（3280rpms）培养，其余与普通感受态差不多。4、每管加入4mlTB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮。5、加入280mlDMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5mlEP管，冰上静置15分钟。6、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好
8、后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。7、取出感受态放入-70超低温冰箱备用。注意事项：1、洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。2、离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。3、涂板不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。4、涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。5、预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要。大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表
9、达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%
10、的无菌甘油或-70保存（有效期6个月）。2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形
11、，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca2处理的感受态细胞，其转化率一般能达到51062107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2、Co2）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高1001000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70保存，因此被广泛用于外源基因的转
12、化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到1091010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。3、感受态细胞制备及转化中的影响因素、细胞的生长状态和密度最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为05时，细胞密度在5107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随
13、菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也
14、密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。重组DNA转化目的：在体外连接组装而成的重组DNA分子只能转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。通过实验学会重组DNA转化的最基本的操作以及如何提高转化效率的基本思路。原理：带有外源DNA片段的重组体分子在体外构
15、建成后，需要导入适当的宿主细胞内进行繁殖或表达出具有一定生物活性的蛋白。能够作为重组体转化的受体，主要有动物细胞、植物细胞、微生物细胞等。导入受体细胞的途径重要有转化（转染），显微注射和电穿孔等多种不同的方式。可以根据不同的受体选择不同的导入方式。一般情况下，细菌一类的原核生物和酵母这样的低等真核细胞可用转化方式导入，而高等动植物细胞则需采用显微注射或电穿孔来进行。细菌表面通过CaCl2处理后，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，DNA分子能够通过质膜进入细胞。其进入细胞的方式是完整的双链DNA分子首先吸附到细胞表面，双链DNA分子解链变成单链，单链DNA分子一条进入受体细胞内，另一条被降解。进入细胞
16、内的单链DNA则复制成双链环状DNA，随同复制子同时复制，并被转录翻译。仪器与主要试剂：（一）仪器1隔水式电热恒温培养箱2超净工作台3高速冷冻离心机4水浴锅（二）主要试剂1LB液体培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，用5mol/LnaOH调节PH值至7.4，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。2LB固体培养基：在配制的液体培养基三角烧瓶中加入2克琼脂，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。3抗菌素：（1）氨苄青霉素(Amp)用前在无菌试管中,用灭菌水配制,母液浓度为100mg/ml。（2）链霉素（Str）用前在无菌试管中,用灭菌水配制,母液浓度为50mg/ml。
17、4100mmol/LCaCl2溶液：称取无水CaCl25.6克，加重蒸水至500毫升，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。550%的PEG6000溶液：称取50克聚乙二醇6000加重蒸水溶解，定容至100毫升，103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。实验方法（用CaCl2制备新鲜的感受态细胞转化法）：感受态细菌制备（1）挑取在平板上活化的菌落接种于2毫升LB培养液中，在370C培养过夜。（2）按1%挑取过夜培养菌接种于50mlLB培养液中，370C振荡培养22个半期小时（OD600约在0.20.4）。（3）培养物放冰浴中冷却10分钟。（4）分装离心管中，40C5000rpm离心5mi
18、n，收集菌体，培养液尽量倒干净。（5）把菌体悬浮于10ml的100mmol/LCaCl2溶液，置冰浴中20min，40C5000rpm离心5min，收集菌体。（6）再将菌体悬浮于1-2ml的100mmol/LCaCl2溶液中，40C保存，12-24小时后即可作为感受态细胞进行转化。转化实验（7）取200ml感受态菌，加入待转化的重组DNA（体积应小于10ml，DNA50ng）混匀后置冰浴中30min（一般同时要做阳性对照和阴性对照。阳性对照为加入已知量的未重组质粒DNA的感受态菌，用于检测转化效率。阴性对照为完全不加质粒DNA的的感受态菌，用于检测感受态细菌有无污染及检测抗生素的活性）。（8）
19、放入冰浴中30min，转入420C水浴90s，再冰浴1-2min，加入培养液800ml，放370C振荡培养45min。（9）将适当体积已转化的感受态细胞均匀铺于平皿上。（10）待平皿中液体吸收后，倒置平皿，于370C培养12-16小时可出现菌落。双酶切连接反应之全攻略双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如
20、BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单
21、位酶的定义如下：在50l反应液中，30温度下反应1小时，将1g的DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15g的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3g，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3g，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为g单位的DNA：（Xpmoles
22、长度bp650）/1,000,000（注：长度bp650是该双链DNA的分子量）所得数值即为g,也可以直接用这个公式套.1pmol1000bpDNA=0.66g,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.035.380.66=0.106524g。测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20l的连接反应体系中，6g的DNA-HindIII的分解物在16下反应30分钟时，有90%以上的
23、DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350U/l，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。3、转化：a、全量（10l）加入至100lJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。b、42加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。c、加入890lAMP阴性培养基，37振荡培养60分钟。取100l铺板。也可离心后余100l几个非常重要的问题1做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.2对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株
24、无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干3对照的设立：为验证双酶切是否成功,可做如下对照:A酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时,也要进行对照.设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都正常的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明
25、是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序一种挑取重组子克隆的简易方法-菌落PCR凡经过体外DNA重组以后,都要通过挑取重组子克隆的方法将改变以后的DNA序列固定下来。通常挑取克隆是一项十分繁琐费时的工作,特别对于连结效率较低、自连机率高的情况,通过碱裂解法或煮沸法提取质粒常常是事倍功半;
26、另外一种情况是重组质粒向农杆菌转化后的检测过程中,由于提取农杆菌的质粒通常获得的质粒量很少,且背景不干净,因此难以对酶切结果作出判断。针对上述情况,我们在实践中使用了PCR方法挑取重组子克隆,简化了操作程序,取得了较满意效果。1材料与方法1.1菌种与质粒DH5A大肠杆菌受体菌及植物表达载体pBin438(含有卡那霉素筛选标记基因)均由中国科学院微生物所田颖川提供。B21,32葡聚糖酶基因片段为作者从烟草中分离得到。pBLG为B21,32葡聚糖酶基因插入pBin438中所得到的植物表达载体。1.2酶与试剂限制性内切酶BamHI,SalI,Hind,EcoRI及T4DNA连接酶均购自Boehrin
27、germannhein等公司。TaqDNA聚合酶及PCR反应缓冲液为中科院微生物所田颖川先生实验室自制。1.3PCR引物检测B21,32葡聚糖酶基因的两个引物为:5端引物:52GCGGATCCGACCATGGCTGCTATCACACTCC23;3端引物:52CGGTCGACCTCACATCTCACTTACGAGA23。此引物由上海生物工程有限公司合成。1.4转化菌落的备份及菌落PCR反应物的制备将B21,32葡聚糖酶基因与植物表达载体pBin438的连接产物转化大肠杆菌DH5A感受态细胞,并涂布于含卡那霉素(50Lgml-1)的LB培养基上,37培养过夜,待菌落长至12mm时,用灭菌的牙签沾取
28、全部菌落先在预先分格并标记数字的另一块平皿上轻沾一下,然后在PCR反应混合液(PCR反应缓冲液、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、dH2O)中同样轻洗一下,依次将需挑取的克隆全部在另一块平皿上备份,并将剩余菌洗入对应的PCR小管,加封石蜡油后进行反应。PCR的反应条件为:94预变性2min;94变性lmin,55复性1min,72延伸1min,共30个循环,将备份平皿放入37培养至菌落出现,置4保存。2.1菌落PCR挑取重组子克隆的优势倒置的平皿及底部的编号通常挑克隆中较繁琐的步骤是质粒提取。每一种基因在导入植物或微生物之前都需要进行体外重组构建,然后通过挑取转化单菌落得到重组子克隆。常规的
29、碱裂解和煮沸法(Sambrook,1989)均需要经过菌体过夜培养、菌体裂解及乙醇沉淀过程。一般情况下,在挑取的若干克隆中只有少部分为重组子,因此提取质粒过程消耗的时间很多,而利用菌落PCR挑取重组子克隆的过程则避开了提取质粒的繁琐过程,只需将挑取的菌落在另一平皿备份(图1),再将剩余的菌洗入PCR反应混合液小管中,即可进行PCR反应。由于检测重组子对Taq酶的要求不是很严格,因此,自行提取及配制的Taq酶与缓冲液完全可以满足需求,这使得实验成本大大降低。一般PCR反应所需时间为34h,在这期间,可以进行其它的实验,只需在PCR反应完成后进行电泳检查即可。根据PCR反应得到的重组子克隆,从备份
30、中挑出35个菌落进行质粒提取及酶切鉴定,并对正确插入外源片段的重组子克隆及时保存菌种。这大大地减轻了工作量。在农杆菌转化的质粒检测中,此方法更显出其优越性。由于农杆菌的质粒提取在目前还没有一种较好的方法(贾盘兴,1992),通常采用大肠杆菌质粒提取的方法进行,只能得到很少的质粒,且背景很杂(图2),难以正确判断重组质粒是否已导入农杆菌中,而采用菌落PCR却能得到非常好的结果(图3)。2.2菌落PCR过程中的假阳性问题通常在PCR反应过程中,无论是质粒PCR还是菌落PCR都会遇到假阳性问题。为减少或避免假阳性,每次进行PCR反应所用的0.5ml离心管和移液枪头必须是新的、无菌的,无菌双蒸水分成5
31、00Ll每一小管,每次都用新的,不反复使用;设正、负对照,以保证在没有模板条件下不产生任何条带;平时培养良好的、正确的实验操作,使自己的实验用具不要被污染,这样就可在一定的程度上避免假阳性机率。如果产生了假阳性,通常可采取一些识别方式加以判断。一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽,形状较规则,而假阳性的PCR条带,多数不太亮或若隐若现,条带细而不规则,若与重组子克隆的PCR条带在一起时,较容易识别出来。目前在重组子克隆挑取及鉴定方面已有不少方法,如酚、氯仿一步抽提法(魏征宇,1993)、快速裂解法、过柱法等。笔者认为菌落PCR的方法是一种简易而实用的方法,因为从它得到的结果就可以直观地看出
32、是否有外源片段插入,而其它的方法必须经过提质粒酶切后方可知是否真有外源片段插入,因此,此法对于解除繁重的实验工作将会有很大的帮助。Wazard大量DNA纯化系统碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。该系统中含有的试剂和柱
33、子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括:150ml细胞悬浮液，150ml细胞裂解液，150ml中和液，100mlWizard大量DNA纯化树脂，125mlWizard柱子洗脱溶液和10支Wizard带有存储离心管的柱子。1、100-500ml细胞培养液置离心管中,22-25下5000g离心10分钟,所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。2、加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,溶液会变清,这一步需要20分钟。3、加15ml中和溶液,立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。4、14000g,22-25离心15分钟。5、小心地将
34、上清液吸出并移至一个新离心管中。6、加0.5倍体积的异丙醇,混合均匀,14000g22-25下离心15分钟。7、弃上清,悬浮DNA沉淀于2mlTE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。8、加10mlWizard大量DNA纯化树脂溶液,并涡旋混合。9、每一个样品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega产品,与此配套)。10、将树脂/DNA混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA混合液。11、将树脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脱溶液至离心管中,对管底部的树脂/DNA进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。12、真空抽干所加入的洗脱。13、再加12
35、ml柱子洗脱液进柱子并抽干。14、加入5ml80乙醇漂洗柱中的树脂,柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5分钟。15、取出柱子，真空抽干5分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5分钟。16、在柱子中加入1.5ml65-70预热过的灭菌重蒸水或TE,1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子/离心管5分钟。17、取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在4或-20备用。注意1.在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml95乙醇。2.纯化树脂必须混匀后再用.质粒的大量
36、提取之细菌的培养及收集在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pl或olEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物mg质粒，而且重复性也很好。1、将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（OD600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。2、将含相应抗生素的500ml或Terrific肉汤培养基（预加温至37）加入25ml对数晚期的培养物，于37剧烈振摇
37、培养2.5h（摇床转速300转/分），所得培养物的OD600值约为0.4。3、可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170g/ml。有些质粒只要生长达到，新一代的质粒（如pUC质粒）可复制到很高的拷贝数，因此无需扩增。但像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝复制质粒，有必要扩增。用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。4、于37剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。5、用orvall3转头（或相当的
38、转头）于4以4000rpm离心15min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的中。【STE：0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)5%TritonX-100】按照前面所述收集细菌细胞。质粒小量提取之碱裂解法试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，
39、释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。试验准备：1、溶液:pH8.0GET缓冲液（50mmo
40、l葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTrisHCl）；溶液可成批配制，在10lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2和Mg2等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。2、溶液：0.2mol/LNaOH(内含1的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。N
41、aOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4NNaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。3、溶液：pH4.8乙酸钾溶液（60ml5mol/LKAc，11.5ml冰醋酸，2
42、8.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L.pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。4、异丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子
43、所需PEG的浓度只需1左右，小分子所需PEG浓度高达20。5、无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。加入的乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。也可改用95乙醇来替代无水乙醇。但是加95的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性
44、沉淀DNA。一般在室温下放置1530min即可。但因为使用异丙醇时常把盐沉淀下来，所以较多的还是使用乙醇。6、pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTrisHCl，1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20ug/ml。在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa7.2）和硼酸系统（pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用
45、Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH57），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。7、70乙醇试验步骤:1、无菌操作台上,取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上以10000
46、rpm离心1min，或者以4000rpm离心510min，弃上清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。2、沉淀中加100l用冰预冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要剧烈振荡）。室温下放置10min。3、加入200l溶液II(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5min。4、加入150l预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴15min。5、微量离心机上以4，12000rpm离心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。6、上清夜中加入等体积酚/氯仿（1：1）混匀，微量离心机上以4，12000rpm,离心5min。经验之谈：如果选
47、用宿主合适的话（如DH5a、XL1-red等，HB101和BL21则不行），可以不用酚氯仿抽提这一步。用1倍体积的乙醇沉淀，沉淀中所含的盐和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解质粒，后续的限制性酶切、转化完全没有问题。仅供参考7、小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下层的有机相。8、小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2/3倍体积异丙醇,混匀,4离心12000g5min。9、上清夜中加入2倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置5min10min，以12000rpm,离心5min-15min。10、1.0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀12次,沉淀在室温下晾干。11、小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。再将附着在管壁上的液滴除去。在除去管壁上的液滴时，可以用一次