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1、关于蛋白质工程第一页，讲稿共五十一页哦n蛋白质的功能与结构蛋白质的功能与结构n蛋白质工程的诞生蛋白质工程的诞生n蛋白质工程的基本步骤和改造方法蛋白质工程的基本步骤和改造方法n食物蛋白质改性技术食物蛋白质改性技术n蛋白质工程在食品产业中的应用蛋白质工程在食品产业中的应用第二页，讲稿共五十一页哦一、蛋白质的功能与结构一、蛋白质的功能与结构n1.1蛋白质的功能蛋白质的功能n1.2蛋白质的结构蛋白质的结构第三页，讲稿共五十一页哦1.1蛋白质的功能蛋白质的功能(1)1)蛋白质是构成生命的重要物质之一蛋白质是构成生命的重要物质之一n蛋白质是一类重要而复杂的生物大分子，它广泛地存在于所有生物界的蛋白质是一类
2、重要而复杂的生物大分子，它广泛地存在于所有生物界的机体之中，具有许多重要的作用；机体之中，具有许多重要的作用；n生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在活性蛋白质活性蛋白质-酶酶的催化下的催化下进行；进行；n高等动物高等动物免疫免疫反应，主要是通过反应，主要是通过蛋白质蛋白质，即，即抗原抗原和和抗体抗体完成；完成；n运动时的肌肉收缩靠的是某些运动时的肌肉收缩靠的是某些蛋白质的相互作用蛋白质的相互作用来完成的；来完成的；n运输氧和二氧化碳的是运输氧和二氧化碳的是血红蛋白血红蛋白；n具有具有代谢和调节代谢和调节功能的是多种蛋白质功能的是多种蛋白质激素激素。第
3、四页，讲稿共五十一页哦(2)(2)蛋白质的应用蛋白质的应用n蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之一。蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之一。n用用蛋白质诊断和治疗蛋白质诊断和治疗某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮助消化，治疗消化不良性疾病；助消化，治疗消化不良性疾病；胰岛素胰岛素用于治疗严重的糖尿病；用于治疗严重的糖尿病；转氨酶转氨酶作为作为肝病变的指标肝病变的指标等。等。n食品工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质的性质制造各种产品。食品工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质的性质制造各种产品。例如，酿造业要用蛋白酶来增加酱油的鲜味等（例如，酿造业要用蛋
4、白酶来增加酱油的鲜味等（texturetexture）。）。第五页，讲稿共五十一页哦1.2蛋白质的结构n氨基酸是蛋白质的基本结构单位，各种氨基酸之间通过肽键彼氨基酸是蛋白质的基本结构单位，各种氨基酸之间通过肽键彼此按直线形头尾相连，构成不同长短的肽链。此按直线形头尾相连，构成不同长短的肽链。肽键的形成肽键的形成第六页，讲稿共五十一页哦n肽链又以一定方式折叠盘绕成肽链又以一定方式折叠盘绕成独特的空间结构独特的空间结构，这时才产生具有生，这时才产生具有生物活性的天然蛋白质。物活性的天然蛋白质。n多肽链的折叠可分为四种不同层次的结构。一级结构：仅指肽链中多肽链的折叠可分为四种不同层次的结构。一级结构
5、：仅指肽链中的氨基酸线型排列顺序，不考虑空间的排列。的氨基酸线型排列顺序，不考虑空间的排列。牛胰岛素的氨基酸序列第七页，讲稿共五十一页哦n二级结构：主链原子的局部空间排列，不二级结构：主链原子的局部空间排列，不包括侧链构象和与其他链段的相互关系，包括侧链构象和与其他链段的相互关系，如如-螺旋、螺旋、-折叠等主链构象单元就是二折叠等主链构象单元就是二级结构。级结构。-螺旋螺旋-折叠折叠第八页，讲稿共五十一页哦三级结构：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步三级结构：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构
6、。碳酸酐酶的多肽骨架示意图碳酸酐酶的多肽骨架示意图第九页，讲稿共五十一页哦n四级结构：具有四级结构：具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基亚基。四级结。四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。如构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。如血红蛋白分子中四个亚基之间的空间关系。血红蛋白分子中四个亚基之间的空间关系。血红蛋白的结
7、构第十页，讲稿共五十一页哦二、蛋白质工程的诞生二、蛋白质工程的诞生n蛋白质工程是指基于蛋白质结构功能的研究结果，通过蛋白质工程是指基于蛋白质结构功能的研究结果，通过基因工程技术，改造现有蛋白质和设计制造基因工程技术，改造现有蛋白质和设计制造新蛋白质，因新蛋白质，因而也称为第二代基因工程。而也称为第二代基因工程。n蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来动力学、蛋白质化学和计算机
8、辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。的新兴研究领域。第十一页，讲稿共五十一页哦n内容主要有两个方面：内容主要有两个方面：n 根据需要合成特定氨基酸根据需要合成特定氨基酸序列序列和和空间结构空间结构的蛋白质；的蛋白质；n 确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间关系；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间关系；n在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。白质工程最根本的目标之一。第十
9、二页，讲稿共五十一页哦n生物理论和技术在下列九方面的发展促进了蛋白质工生物理论和技术在下列九方面的发展促进了蛋白质工程的诞生：程的诞生：新的克隆技术，特别是完整新的克隆技术，特别是完整cDNAcDNA的克隆技术；的克隆技术；快速测定快速测定DNADNA序列的方法；序列的方法；从从DNADNA序列推算蛋白质序列的计算机程序系统；序列推算蛋白质序列的计算机程序系统；蛋白质序列数据库的建立，使一级结构相似的蛋白质能蛋白质序列数据库的建立，使一级结构相似的蛋白质能被很快地鉴定出来，由此研究其功能上的相似性；被很快地鉴定出来，由此研究其功能上的相似性；第十三页，讲稿共五十一页哦对原核生物和真核生物对原核
10、生物和真核生物基因表达调控基因表达调控进一步深入了解；进一步深入了解；用于基因体外诱变的化学、酶学和用于基因体外诱变的化学、酶学和合成技术合成技术的进展；的进展；第十四页，讲稿共五十一页哦三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n3.1 蛋白质工程研究的基本步骤蛋白质工程研究的基本步骤n3.2 蛋白质改造方法蛋白质改造方法第十五页，讲稿共五十一页哦3.1 蛋白质工程研究的基本步骤蛋白质工程研究的基本步骤n分离纯化目的蛋白，使之结晶，并作分离纯化目的蛋白，使之结晶，并作X X晶体衍射分析，结合核晶体衍射分析，结合核磁共振等其他方法的分析结果，得到其磁共振等其他方法的分
11、析结果，得到其空间结构空间结构的尽可能多的的尽可能多的信息；信息；n对目的蛋白的对目的蛋白的功能功能作详尽的研究，确定它的作详尽的研究，确定它的功能域功能域；n通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系的分通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系的分析，找出析，找出关键的基团和结构关键的基团和结构；n借助于计算机图像显示和分子辅助设计，提出对目的蛋白分借助于计算机图像显示和分子辅助设计，提出对目的蛋白分子的改建或构建方案，并用子的改建或构建方案，并用基因工程基因工程的方法去实施；的方法去实施；第十六页，讲稿共五十一页哦3.2.2 合成全新蛋白质合成全新蛋白质n基于天然蛋白
12、质结构改造的蛋白质工程可以基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优化优化蛋白质的活性蛋白质的活性，而全新蛋白质设计是合成具有，而全新蛋白质设计是合成具有新奇新奇的结构与功能的结构与功能的新蛋白质。的新蛋白质。第十七页，讲稿共五十一页哦从头设计一个蛋白质的基本步骤从头设计一个蛋白质的基本步骤：构建一个多肽链骨架构建一个多肽链骨架模型模型从已知三维结构的数据库中挑选从已知三维结构的数据库中挑选出一个合适的出一个合适的片段片段，进行，进行修改修改和和组合组合依据氨基酸残基的统计学数据和依据氨基酸残基的统计学数据和排列的优先顺序，确定每个残基排列的优先顺序，确定每个残基位置上的位置上的氨基酸氨基酸优化
13、目标蛋白的三维模型优化目标蛋白的三维模型检验和考核所给定的目标蛋白质结检验和考核所给定的目标蛋白质结构是否合理，对所设计的模型做进构是否合理，对所设计的模型做进一步修正一步修正几轮的设计、检验和再设计，获几轮的设计、检验和再设计，获得一个正确折叠和带有人们预期得一个正确折叠和带有人们预期功能的目标蛋白质功能的目标蛋白质第十八页，讲稿共五十一页哦四四 食物蛋白质改性技术食物蛋白质改性技术随着食品工业飞速发展，迫切需要大量具有随着食品工业飞速发展，迫切需要大量具有功能特性功能特性和和营养营养特性特性蛋白质，作为食品原料成分或添加基料；蛋白质，作为食品原料成分或添加基料；大力开发具有大力开发具有优良
14、特性蛋白质资源优良特性蛋白质资源；对对现有蛋白质进行改性现有蛋白质进行改性，以满足人们特殊需求；，以满足人们特殊需求；人类食用蛋白质主要有两大类，植物蛋白和动物蛋白人类食用蛋白质主要有两大类，植物蛋白和动物蛋白植物蛋白周期短，资源丰富，产量大等优点，在食用蛋白中占植物蛋白周期短，资源丰富，产量大等优点，在食用蛋白中占70%以上，而动物蛋白则不足以上，而动物蛋白则不足30%。第十九页，讲稿共五十一页哦n蛋白质是由各种氨基酸相互联结而构成的具有空间结构生物大分子。蛋白质是由各种氨基酸相互联结而构成的具有空间结构生物大分子。n其理化性质其理化性质(尤其尤其分子量分子量、氨基酸组成氨基酸组成、静电荷静
15、电荷和和表面疏水性表面疏水性)与与功能特性直接相关。功能特性直接相关。n蛋白质改性蛋白质改性就是用生化因素就是用生化因素(如化学试剂、酶制剂等如化学试剂、酶制剂等)或物理因素或物理因素(如热、射线、机械振荡等如热、射线、机械振荡等)使其氨基酸残基和多肽链发生某种变使其氨基酸残基和多肽链发生某种变化，化，引起蛋白大分子空间结构和理化性质改变，从而获得较好功能引起蛋白大分子空间结构和理化性质改变，从而获得较好功能特性和营养特性蛋白质特性和营养特性蛋白质。第二十页，讲稿共五十一页哦序号教学内容（按章填写）学时课堂讲授实验课习题课讨论课其他1第一章绪论42第二章基因工程原理及其在食品工业中的应用103
16、第三章发酵工程原理及其在食品工业中的应用84第四章酶工程原理及其在食品工业中的应用8小计30比例100%合计30第二十一页，讲稿共五十一页哦磷酸化作用磷酸化作用n磷酸化磷酸化改性后蛋白中，由于引进大量磷酸根基团，从而增加蛋白改性后蛋白中，由于引进大量磷酸根基团，从而增加蛋白质体系质体系电负性电负性，提高蛋白质分子之间，提高蛋白质分子之间静电斥力静电斥力，使之在食品体系中，使之在食品体系中更更易分散易分散，相互排斥，因而，相互排斥，因而提高溶解度提高溶解度，聚集稳定性聚集稳定性，降低等电点降低等电点，而且其净电荷只有在相当低环境中才会被中和，故可有效拓宽而且其净电荷只有在相当低环境中才会被中和，
17、故可有效拓宽在食品中应用范围。在食品中应用范围。n磷酸化改性蛋白由于负电荷引入，大大降低乳状液表面张力，使磷酸化改性蛋白由于负电荷引入，大大降低乳状液表面张力，使之更之更易形成乳状液滴易形成乳状液滴，同时也增加液滴之间斥力，从而更易分散，同时也增加液滴之间斥力，从而更易分散，因此改性因此改性蛋白乳化能力及乳化稳定性蛋白乳化能力及乳化稳定性都有较大改善。都有较大改善。第二十二页，讲稿共五十一页哦糖基化作用糖基化作用n将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上氨基或羧基相结合化学反应将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上氨基或羧基相结合化学反应(包括美拉德反应包括美拉德反应)，为蛋白质糖基化作用；，为蛋白质糖
18、基化作用；n提高蛋白质功能特性。一般来说，合成糖基化蛋白在较低离提高蛋白质功能特性。一般来说，合成糖基化蛋白在较低离子强度或天然蛋白等电点处仍表现出较高子强度或天然蛋白等电点处仍表现出较高溶解性溶解性；n糖基化提高蛋白质热稳定性糖基化提高蛋白质热稳定性，且随着糖基化程度提高，糖基化，且随着糖基化程度提高，糖基化蛋白质功能特性也随之提高。蛋白质功能特性也随之提高。第二十三页，讲稿共五十一页哦蛋白水解作用蛋白水解作用n采用蛋白酶对蛋白质进行轻微水解，可显著提高蛋白质溶解性能，改采用蛋白酶对蛋白质进行轻微水解，可显著提高蛋白质溶解性能，改善表面善表面/界面性质，水解使蛋白质界面性质，水解使蛋白质柔性
19、增大柔性增大，易于在，易于在表面吸附表面吸附，增强乳化增强乳化性及起泡能力性及起泡能力。n蛋白质水解可能产生蛋白质水解可能产生免疫调节肽免疫调节肽、血管紧张素血管紧张素I转化酶抑制肽转化酶抑制肽、丝氨酸磷丝氨酸磷酸肽酸肽，它们存在于食品蛋白质氨基酸序列中，为非活性状态，但在消化，它们存在于食品蛋白质氨基酸序列中，为非活性状态，但在消化道被释放出来，成为生理调节因子，为食品蛋白质营养价值增添新的内道被释放出来，成为生理调节因子，为食品蛋白质营养价值增添新的内涵。涵。第二十四页，讲稿共五十一页哦物理改性物理改性n物理改性是利用物理改性是利用热能热能、机械能机械能、声波能声波能等进行蛋白质改性等进行
20、蛋白质改性方法；方法；n目前较为集中在目前较为集中在热变性热变性和和挤压蒸煮挤压蒸煮过程研究；过程研究；n温度升高对蛋白质中许多化学键都有所影响，故热处理温度升高对蛋白质中许多化学键都有所影响，故热处理要提高疏水性，同时蛋白质不会发生聚集沉淀。要提高疏水性，同时蛋白质不会发生聚集沉淀。n挤压组织化挤压组织化就是在高温、高压及高剪切作用条件下，蛋白就是在高温、高压及高剪切作用条件下，蛋白质结构展开，分子重新排列。质结构展开，分子重新排列。n挤压引起蛋白质生物价降低要比其它形式热处理为大挤压引起蛋白质生物价降低要比其它形式热处理为大第二十五页，讲稿共五十一页哦五、蛋白质工程在食品产业中的应用五、蛋
21、白质工程在食品产业中的应用n在实际生产中，可以应用蛋白质工程对生产中重要酶或蛋白在实际生产中，可以应用蛋白质工程对生产中重要酶或蛋白质性质加以改造，提高现有酶或蛋白质工业实用性：质性质加以改造，提高现有酶或蛋白质工业实用性：n提高酶的热稳定性（引入二硫键，改善酶热稳定性）。提高酶的热稳定性（引入二硫键，改善酶热稳定性）。n改变酶的最适改变酶的最适pHpH值条件；值条件；n提高酶的催化活性；提高酶的催化活性；第二十六页，讲稿共五十一页哦n溶菌酶是一种广泛应用于食品工业的酶制剂，其催化速率随温度升高而升溶菌酶是一种广泛应用于食品工业的酶制剂，其催化速率随温度升高而升高，因此，它的高，因此，它的热稳
22、定性热稳定性是提高其应用潜力的重要标准。是提高其应用潜力的重要标准。n蛋白质晶体结构研究表明，蛋白质晶体结构研究表明，T T4 4溶菌酶分子的一个重要特性是在第溶菌酶分子的一个重要特性是在第9797位位和和5454位残基上是位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸两个未形成二硫键的半胱氨酸，所以，设想通过在分子，所以，设想通过在分子中中增加一对或数对二硫键增加一对或数对二硫键，来提高酶热稳定性。，来提高酶热稳定性。n采用采用定位突变技术定位突变技术使该菌肽链第使该菌肽链第9 9位和第位和第164164位氨基酸残基转变为半胱位氨基酸残基转变为半胱氨酸，并形成一对二硫键，获得的突变体的酶活性高于天然酶
23、氨酸，并形成一对二硫键，获得的突变体的酶活性高于天然酶6%6%，熔，熔点温度提高点温度提高6.46.4度；度；n新引入的新引入的“工程二硫键工程二硫键”能够稳定两个结构域之间的相对位置，进而能够稳定两个结构域之间的相对位置，进而稳定了由两个结构域所形成的活性中心稳定了由两个结构域所形成的活性中心。第二十七页，讲稿共五十一页哦n纤维素酶是一类水解纤维素中纤维素酶是一类水解纤维素中-1,4-葡萄糖苷键的糖苷水解酶。葡萄糖苷键的糖苷水解酶。n根据氨基酸的序列相关性，糖苷水解酶可分为根据氨基酸的序列相关性，糖苷水解酶可分为82个家族，其中纤维素酶占其中个家族，其中纤维素酶占其中的的13个家族。纤维素酶
24、根据其催化功能的不同，又可分为个家族。纤维素酶根据其催化功能的不同，又可分为内切葡萄糖苷酶内切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶外切葡萄糖苷酶和和纤维二糖酶纤维二糖酶。n自自1904年在蜗牛消化液中发现纤维素酶至今已有年在蜗牛消化液中发现纤维素酶至今已有100多年。对纤维素酶的多年。对纤维素酶的研究分三个阶段：研究分三个阶段：n第一个阶段是第一个阶段是1980年以前，主要的工作是利用生物化学的方法对纤维素酶进年以前，主要的工作是利用生物化学的方法对纤维素酶进行分离纯化；行分离纯化；n第二个阶段是从第二个阶段是从1980年到年到1988年，主要的工作是利用基因工程的方法年，主要的工作是利用基因工程的方法
25、对纤维素酶的基因进行克隆和一级结构的测定；对纤维素酶的基因进行克隆和一级结构的测定；n第三阶段是从第三阶段是从1988年至今，主要的工作是利用蛋白质工程的方法对纤维素年至今，主要的工作是利用蛋白质工程的方法对纤维素酶结构域的拆分、解析、功能氨基酸的确定、水解的双置换机制的确定、分酶结构域的拆分、解析、功能氨基酸的确定、水解的双置换机制的确定、分子折叠和催化机制关系的探讨。子折叠和催化机制关系的探讨。第二十八页，讲稿共五十一页哦n蛋白质工程的工作：蛋白质工程的工作：n对潜在活性中心氨基酸残基进行基因定点突变；对潜在活性中心氨基酸残基进行基因定点突变；n体外分子定向进化；体外分子定向进化；n对定点
26、突变酶进行动力学的分析；对定点突变酶进行动力学的分析；n通常是用基因定点突变技术对典型纤维素酶家族序列不变残基的确认和三维构象的通常是用基因定点突变技术对典型纤维素酶家族序列不变残基的确认和三维构象的确认，并通过设计新的三维复合体来对酶进行修整和探索。确认，并通过设计新的三维复合体来对酶进行修整和探索。n迄今为止，纤维素酶已经有迄今为止，纤维素酶已经有10个家族（第个家族（第5、6、7、8、9、12、26、44、45、48家族）被家族）被克隆出来，其中第克隆出来，其中第5、6、7、8、9、45家族已经用蛋白质工程技术进行了研究。家族已经用蛋白质工程技术进行了研究。第二十九页，讲稿共五十一页哦n
27、微生物脂肪酶微生物脂肪酶是一类能催化水解、酯化、酯交换、转酯、醇解、酸解以及氨是一类能催化水解、酯化、酯交换、转酯、醇解、酸解以及氨解反应等多种化学反应的工业生物催化剂。解反应等多种化学反应的工业生物催化剂。n脂肪酶催化的化学反应具有脂肪酶催化的化学反应具有化学选择化学选择、立体选择性立体选择性、位点选择性位点选择性、催化活性高催化活性高而而副反应少副反应少、催化反应又不需要辅助因子催化反应又不需要辅助因子等特点等特点n广泛应用于广泛应用于食品加工食品加工、油脂加工油脂加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学、化妆品、新型生物材料、生物传感器、生物医学、化妆品、杀虫剂、生物柴油、去污剂、皮革加
28、工、造纸、生物修复、医药、精细化工、去污剂杀虫剂、生物柴油、去污剂、皮革加工、造纸、生物修复、医药、精细化工、去污剂的添加剂、造纸、皮革等诸多工业领域；的添加剂、造纸、皮革等诸多工业领域；第三十页，讲稿共五十一页哦n市场需求量大市场需求量大(仅洗涤剂添加剂一项，每年市场需求量就高达仅洗涤剂添加剂一项，每年市场需求量就高达1 000吨吨)，是大宗工，是大宗工业用酶制剂之一；业用酶制剂之一；n脂肪酶催化的化学反应工艺条件，通常是在各种脂肪酶催化的化学反应工艺条件，通常是在各种有机溶剂介质有机溶剂介质(如生物柴油生产如生物柴油生产中使用的短链醇中使用的短链醇)、极端酸碱极端酸碱(如废纸脱墨工业中的强
29、碱性如废纸脱墨工业中的强碱性)等条件下，容易导致天然脂等条件下，容易导致天然脂肪酶的失活，生产成本的升高，从而限制了脂肪酶的大规模应用。肪酶的失活，生产成本的升高，从而限制了脂肪酶的大规模应用。第三十一页，讲稿共五十一页哦n目前主要有目前主要有两条途径两条途径提高脂肪酶对各种极端工艺条件的耐受性提高脂肪酶对各种极端工艺条件的耐受性:n 从极端环境微生物中筛选新型的能耐受极端工艺条件的脂肪酶从极端环境微生物中筛选新型的能耐受极端工艺条件的脂肪酶n 利用蛋白质工程技术改造和优化现有脂肪酶分子的性能。利用蛋白质工程技术改造和优化现有脂肪酶分子的性能。n极端微生物培养条件苛刻，极端微生物产生极端脂肪酶
30、更具有不确定性极端微生物培养条件苛刻，极端微生物产生极端脂肪酶更具有不确定性(许多极许多极端微生物产生的脂肪酶并不属于极端脂肪酶端微生物产生的脂肪酶并不属于极端脂肪酶)，而且开发这类极端脂肪酶的周期长，而且开发这类极端脂肪酶的周期长，花费昂贵。花费昂贵。n越来越多脂肪酶越来越多脂肪酶3D结构的阐明，结合生物信息学，利用蛋白质工程技术，快速设计和结构的阐明，结合生物信息学，利用蛋白质工程技术，快速设计和改造现有脂肪酶分子，获得新型的高活性和高稳定性的脂肪酶分子，已有许多成功的报道。改造现有脂肪酶分子，获得新型的高活性和高稳定性的脂肪酶分子，已有许多成功的报道。n脂肪酶蛋白质工程技术包括脂肪酶蛋白
31、质工程技术包括脂肪酶的化学修饰脂肪酶的化学修饰和和脂肪酶的分子进化脂肪酶的分子进化两种方式。两种方式。第三十二页，讲稿共五十一页哦脂肪酶化学修饰双功能聚合物的化学修饰双功能聚合物的化学修饰n 双功能聚合物的化学修饰是指利用双功能聚合物如戊二醛等将酶蛋白分双功能聚合物的化学修饰是指利用双功能聚合物如戊二醛等将酶蛋白分子之间、亚基之间或在分子内不同肽链之间，子之间、亚基之间或在分子内不同肽链之间，共价交联形成交联酶共价交联形成交联酶晶体，从而晶体，从而提高酶的稳定性。提高酶的稳定性。n 用戊二醛制备的用戊二醛制备的洋葱假单胞菌洋葱假单胞菌脂肪酶交联酶晶体，其转酯活性提高了脂肪酶交联酶晶体，其转酯活
32、性提高了12倍。倍。单功能聚合物的化学修饰单功能聚合物的化学修饰n单功能聚合物的化学修饰是将多糖或多聚物如单功能聚合物的化学修饰是将多糖或多聚物如PEG及其衍生物等活化后，与脂及其衍生物等活化后，与脂肪酶的侧链氨基相互作用，从而将其偶联到酶分子上。肪酶的侧链氨基相互作用，从而将其偶联到酶分子上。用多糖偶联用多糖偶联C.antarctica（南极洲念珠菌）脂肪酶（南极洲念珠菌）脂肪酶B后，后，70的半衰期由的半衰期由18min提高到提高到168min。第三十三页，讲稿共五十一页哦n小分子修饰法小分子修饰法小分子修饰法是利用小分子化合物如醛、酮、羧酸、小分子修饰法是利用小分子化合物如醛、酮、羧酸、
33、脂肪酸等与脂肪酶表面暴露的游离羟基、酚羟基、巯基、脂肪酸等与脂肪酶表面暴露的游离羟基、酚羟基、巯基、羧基、氨基等基团反应，从而改变脂肪酶的酶学性质。羧基、氨基等基团反应，从而改变脂肪酶的酶学性质。利用脂肪酸修饰利用脂肪酸修饰C.viscosum（染色粘性菌染色粘性菌）脂肪酶，）脂肪酶，该酶的酯交换活性从该酶的酯交换活性从0 mmol/(hg)提高到提高到270mmol/(hg)。第三十四页，讲稿共五十一页哦第三十五页，讲稿共五十一页哦脂肪酶的分子进化脂肪酶的分子进化n分子进化是在分子水平上应用基因工程手段对脂肪酶进行有针对的设分子进化是在分子水平上应用基因工程手段对脂肪酶进行有针对的设计或定向
34、加工，以提高脂肪酶的计或定向加工，以提高脂肪酶的活性活性和和稳定性稳定性，或者创造出具有，或者创造出具有新新功能功能的脂肪酶。的脂肪酶。n分子进化方法主要有分子进化方法主要有理性设计理性设计、定向进化定向进化及及多种突变技术多种突变技术的结合。的结合。利用分子进化技术，提高微生物脂肪酶的稳定性，优化脂肪酶的催化利用分子进化技术，提高微生物脂肪酶的稳定性，优化脂肪酶的催化活性，取得了巨大的成功。活性，取得了巨大的成功。第三十六页，讲稿共五十一页哦理性设计n理性设计是根据已知脂肪酶的三维结构，利用生物信息学理性设计是根据已知脂肪酶的三维结构，利用生物信息学(如动力学如动力学模拟模拟)分析脂肪酶蛋白
35、分子结构和功能的关系，确定可以替换或分析脂肪酶蛋白分子结构和功能的关系，确定可以替换或修饰的氨基酸残基、替换氨基酸残基的类型、侧链修饰对脂肪修饰的氨基酸残基、替换氨基酸残基的类型、侧链修饰对脂肪酶催化性能的影响，然后运用定点突变技术完成氨基酸残基的酶催化性能的影响，然后运用定点突变技术完成氨基酸残基的替换。替换。n利用分子动力学模拟技术结合定点突变技术，利用分子动力学模拟技术结合定点突变技术，C.antarctica脂脂肪酶肪酶B活性中心的色氨酸残基突变为丙氨酸残基，有效地扩大了脂活性中心的色氨酸残基突变为丙氨酸残基，有效地扩大了脂肪酶活性中心的空间，对仲醇的催化活性提高了肪酶活性中心的空间，
36、对仲醇的催化活性提高了270倍。倍。第三十七页，讲稿共五十一页哦定向进化（自然选择）定向进化（自然选择）n常用的定向进化方法包括两大类：常用的定向进化方法包括两大类：随机突变随机突变和和基因重组基因重组n随机突变技术随机突变技术包括致错包括致错PCR、单分子、单分子PCR、化学诱变剂介导的、化学诱变剂介导的随机诱变、致突变菌株产生随机突变等；随机诱变、致突变菌株产生随机突变等；n基因重组技术基因重组技术包括包括DNA改组，随机引物体外重组，交错延伸改组，随机引物体外重组，交错延伸重组等。重组等。第三十八页，讲稿共五十一页哦随机突变致错致错PCR技术技术n 致错技术是根据致错技术是根据Taq D
37、NA聚合酶缺乏校正功能，在聚合酶缺乏校正功能，在PCR扩增过程中存在一定频扩增过程中存在一定频率的碱基错配特点而开发出来的随机突变技术。率的碱基错配特点而开发出来的随机突变技术。n 利用致错利用致错PCR技术对技术对R.niveus（红泡刺藤）脂肪酶分子定向进化，筛选到一个脂（红泡刺藤）脂肪酶分子定向进化，筛选到一个脂肪酶突变体的最适温度比野生脂肪酶的最适温度提高了肪酶突变体的最适温度比野生脂肪酶的最适温度提高了15。n 致错致错PCR技术虽然操作简便快速，但只能产生点突变的突变体，而且有益突变频率低。技术虽然操作简便快速，但只能产生点突变的突变体，而且有益突变频率低。第三十九页，讲稿共五十一
38、页哦单分子单分子PCR技术技术n单分子单分子PCR技术是一种在极端条件下具有高度错配倾向的技术是一种在极端条件下具有高度错配倾向的PCR技术，其碱基技术，其碱基错配频率为普通错配频率为普通Taq酶的三倍，达酶的三倍，达2.510-5/碱基碱基/循环。循环。n Kato应用单分子应用单分子PCR技术体外进化技术体外进化B.cepacia（洋葱伯克霍尔德菌）（洋葱伯克霍尔德菌）脂肪酶的对映体拆分活性，筛选到的脂肪酶突变体对映体拆分活性提高脂肪酶的对映体拆分活性，筛选到的脂肪酶突变体对映体拆分活性提高了了42倍。倍。第四十页，讲稿共五十一页哦基因重组基因重组nDNA改组技术改组技术：以经过多代诱变的
39、碱性脂肪酶产生菌扩展青霉以经过多代诱变的碱性脂肪酶产生菌扩展青霉FS8486菌菌株和分离自新疆火焰山口土样的溜曲霉株和分离自新疆火焰山口土样的溜曲霉FS-132菌株作为原始出发菌株，经过两轮基菌株作为原始出发菌株，经过两轮基因组改组，得到脂肪酶产量提高了因组改组，得到脂肪酶产量提高了3.2倍的突变体倍的突变体。第四十一页，讲稿共五十一页哦n多种突变技术的混合体系多种突变技术的混合体系：每种体外进化技术，均有其自：每种体外进化技术，均有其自身的缺点和局限性，通过多种体外进化方法的组合，可身的缺点和局限性，通过多种体外进化方法的组合，可以有效克服技术上的局限性，提高阳性突变频率。以有效克服技术上的
40、局限性，提高阳性突变频率。n 利用致错利用致错PCR技术和技术和DNA改组技术快速筛选到一个改组技术快速筛选到一个R.arrhizus（少根根霉（少根根霉）脂肪酶突变体，其温度稳定性较天）脂肪酶突变体，其温度稳定性较天然脂肪酶提高了然脂肪酶提高了12倍。倍。第四十二页，讲稿共五十一页哦第四十三页，讲稿共五十一页哦植酸酶可将植物性饲料中植酸酶可将植物性饲料中植酸及其盐植酸及其盐分解为分解为肌醇肌醇和和磷酸磷酸，增加可利用磷的含量，增加可利用磷的含量，降低植酸对矿物质和蛋白质的亲和力，解除植酸的抗营养作用，从而增加动降低植酸对矿物质和蛋白质的亲和力，解除植酸的抗营养作用，从而增加动物对蛋白质和某些
41、金属离子的吸收能力。物对蛋白质和某些金属离子的吸收能力。植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限，主要原因：植酸酶在饲料中的推广和应用还相当有限，主要原因：(l)植酸酶在天然材料中的含量太低，难以大量生产；植酸酶在天然材料中的含量太低，难以大量生产；(2)植酸酶的热不稳定性不能完全满足饲料加工、贮藏、使用的要求。植酸酶的热不稳定性不能完全满足饲料加工、贮藏、使用的要求。目前，用蛋白质工程手段在提高饲用植酸酶的表达量，改善热稳定性和改良目前，用蛋白质工程手段在提高饲用植酸酶的表达量，改善热稳定性和改良植酸酶催化性质等方面已取得较大进展。植酸酶催化性质等方面已取得较大进展。第四十四页，讲稿共五十一页哦
42、植酸酶改性的策略植酸酶改性的策略要获得具有新的功能和特性酶的方法有两种：要获得具有新的功能和特性酶的方法有两种：n从大量自然存在的微生物中筛选能够产生期望性质的酶，通过基因工程从大量自然存在的微生物中筛选能够产生期望性质的酶，通过基因工程技术，在适合宿主中表达。技术，在适合宿主中表达。n运用蛋白质工程对已存在酶的运用蛋白质工程对已存在酶的DNA或氨基酸序列进行修饰改造。或氨基酸序列进行修饰改造。第四十五页，讲稿共五十一页哦定点突变提高植酸酶的表达量定点突变提高植酸酶的表达量植酸酶的生产菌株表达量低，难以获得大量产品，使生产成本太高，植酸酶的生产菌株表达量低，难以获得大量产品，使生产成本太高，利
43、用高效表达系统作为生物反应器，大规模低成本地大量生产植酸利用高效表达系统作为生物反应器，大规模低成本地大量生产植酸酶，无疑是解决这一问题行之有效的方法之一。酶，无疑是解决这一问题行之有效的方法之一。利用毕赤酵母表达植酸酶可以获得大量产品，表达量由原始菌株的每毫升几微利用毕赤酵母表达植酸酶可以获得大量产品，表达量由原始菌株的每毫升几微克提高到克提高到1-10毫克，并能在酵母中进行糖基化修饰等蛋白质翻译后加工，提毫克，并能在酵母中进行糖基化修饰等蛋白质翻译后加工，提高酶的生物活性。高酶的生物活性。第四十六页，讲稿共五十一页哦为了提高植酸酶在酵母中的表达率，可通过定点突变将部分在毕赤酵母为了提高植酸
44、酶在酵母中的表达率，可通过定点突变将部分在毕赤酵母中中低偏爱性低偏爱性的密码子替换为高偏爱性的密码子。的密码子替换为高偏爱性的密码子。姚斌等对在毕赤酵母中表达的植酸酶基因姚斌等对在毕赤酵母中表达的植酸酶基因phyA2进行了进行了Arg密码子的密码子的优化突变，将优化突变，将4个个Arg密码子密码子(有有3个编码个编码Arg密码子是密码子是CGG，1个是个是CGA)突变成高频使用的突变成高频使用的AGA，Arg密码子优化后其表达量可达每毫升培养液密码子优化后其表达量可达每毫升培养液15000u，比，比Arg秘密子没有优化的表达量提高了近秘密子没有优化的表达量提高了近37倍。倍。第四十七页，讲稿共
45、五十一页哦改善植酸酶的热稳定性改善植酸酶的热稳定性n植酸酶熔点在植酸酶熔点在56-63之间，加工饲料都需经过一个制粒工艺，在制粒过之间，加工饲料都需经过一个制粒工艺，在制粒过程中有一个短暂的高温过程，温度一般在程中有一个短暂的高温过程，温度一般在75-93，而一般植酸酶的活性在此，而一般植酸酶的活性在此高温下将大幅度的不可逆地丧失；高温下将大幅度的不可逆地丧失；n饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性，因为饲料用酶最终的作用场所是动物正饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性，因为饲料用酶最终的作用场所是动物正常体温常体温(37左右左右)的肠胃道中；的肠胃道中；n获得热稳定性改善的饲用酶，往往引
46、起：获得热稳定性改善的饲用酶，往往引起：(l)邻近氨基酸残基间氢键、盐键和邻近氨基酸残基间氢键、盐键和二硫键的形成；二硫键的形成；(2)增加疏水相互作用及离子间相互作用，或增加疏水相互作用及离子间相互作用，或-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角的稳定性等。转角的稳定性等。第四十八页，讲稿共五十一页哦改良饲用植酸酶的最适PHn要使植酸酶能在畜禽体内产生有效的催化作用，就必须使酶与畜禽的生理条件要使植酸酶能在畜禽体内产生有效的催化作用，就必须使酶与畜禽的生理条件(体温及消化道的体温及消化道的pH值值)相适应。相适应。n不同的动物消化道的不同的动物消化道的pH值不同，即使是一种动物在消化道的不同部位值
47、不同，即使是一种动物在消化道的不同部位pH值也不同，一般的值也不同，一般的pH值胃为值胃为1.5-3.5，小肠为，小肠为5-7、大肠为、大肠为7左右。因此左右。因此要求饲用酶对要求饲用酶对pH值有较大的适应范围。值有较大的适应范围。npH值主要影响酶活性部位上关键残基的侧链基团或底物的解离，使酶与底物不值主要影响酶活性部位上关键残基的侧链基团或底物的解离，使酶与底物不能结合，或结合后不能进一步反应生成产物。能结合，或结合后不能进一步反应生成产物。第四十九页，讲稿共五十一页哦n 可通过对氨基酸残基的置换，改变活性中心的氢键网，或改变氨基酸残基的电子可通过对氨基酸残基的置换，改变活性中心的氢键网，
48、或改变氨基酸残基的电子环境。从而改变催化基团的环境。从而改变催化基团的pKa值。值。通过定点突变改变真菌和同序植酸酶的通过定点突变改变真菌和同序植酸酶的pH活性范围，用活性范围，用Lys、His替换野生的替换野生的A.fumigatus(烟曲霉菌烟曲霉菌)植酸酶植酸酶Gly277、Tyr282，将产生第，将产生第2个最适个最适pH在在2.8-3.4。在同序植酸酶和在同序植酸酶和A.fumigatus中中K68A单点突变，以及在植酸酶进行单点突变，以及在植酸酶进行S140Y，D14lG双突变，以植酸为底物将降低最适声值双突变，以植酸为底物将降低最适声值0.5-1.0单位，而酶的比活力没有单位，而酶的比活力没有明显变化。明显变化。第五十页，讲稿共五十一页哦感感谢谢大大家家观观看看第五十一页，讲稿共五十一页哦