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1、梅花鹿微卫星DNA富集文库的构建与鉴定牛伟萍 张丽颖 杨润军 张嘉保 赵志辉* 张明军收稿日期：2010-09-17基金项目：长春市科技支撑计划项目资助（08KJ36）作者简介：牛伟萍(1987-)，女，硕士研究生，主要从事生物化学与分子生物学方向的研究。*通讯作者：E-mail：mjz1967 Email：zhzhao（吉林大学畜 牧兽医学院，吉林 长春 ）中图分类号：S603.7 文献标识码：A摘要：梅花鹿基因组DNA经限制性内切酶MboI酶切，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳回收4001 000 bp的DNA片段，与MboI连接接头相连接，连接产物与生物素标记的（AC）15微卫星探针变性及退火
2、，再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉，经吸附，洗涤及洗脱，然后以洗脱产物为模版，以其中一个接头为引物进行 PCR扩增，将扩增产物回收纯化并与pMD18-T载体相连接，转化大肠杆菌DH5a，构建梅花鹿 (AC)n 微卫星DNA富集文库，经测序分析表明该文库含重组克隆约为1 380个，其中计算得到阳性克隆率为82.9%。梅花鹿微卫星文库的建立将为一步进行梅花鹿基因组结构的分析、梅花鹿遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究、标记辅助选择以及经济性状的QTL定位提供大量的微卫星标记。关键词：梅花鹿；微卫星；遗传标记Construction and identification of DNA libra
3、ries enriched for microsatellite repeat sequences in sika deer（NIU Wei-ping, ZHANG Li-ying, YANG Runjun, ZHANG Jia-bao, ZHAO Zhihui*，ZHANG Ming-jun*）（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun ,China）Abstract: Genomic DNAs from sika deer were cleaved with restrict
4、ion enzymesMboI. The fragments in size from 400 bp to 1 000 bp were recovered by 1.5% agarose gel electrophoresis and ligated with adaptor, and then denatured and hybridized biotinylated (AC)n oligonucleotide. The biotinylated hybrids were retained on the magnetic particles according to the strong a
5、ffinity between biotin and strep tavidin. The eluate was amplified by PCR and cloned into pMD18-T plasmid vector, and then transformed into Escherichia Ecoli DH5to construct DNA libraries enriched for microsatellite repeat sequences of sika deer. Sequence analysis shows that the library contains 1 3
6、80 clones and 82.9% of the clones with positive. Microsatellite library of deer will step to the analysis of genome structure deer, sika deer genetic linkage mapping, molecular evolution and phylogenetic studies, marker-assisted selection and QTL localization economic traits to provide a large numbe
7、r of microsatellite markers.Key Words: sika deer; microsatellite; genetic markers梅花鹿为东亚特有的珍贵动物，历史上我国梅花鹿资源非常丰富，分布范围也极为广泛，但由于自然因素及人为因素的影响，中国梅花鹿6个亚种中仅存3个亚种：四川亚种， 华南亚种和东北亚种，其分布范围也大为缩减，种群数量急剧减少，已处于濒危的状态1-2。微卫星（Microsatellite）又称简单序列重复（SSR），一般以16个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，且成随即均匀分布，它们不仅大量分布
8、于基因的间隔区和内含子中，而且还分布于基因的外显子和调控区（如：启动子和增强子等）3。真核生物的基因组中以二核苷酸重复如CA,GT最为丰富。由于微卫星遗传标记具有数量大，分布广且均匀，多态信息含量高，检测快速方便以及适合自动化分析等优点，因而已被广泛应用于动植物基因图谱的构建、QTL定位、标记辅助选择、亲缘关系鉴定、遗传多样性评估及系统进化树的构建等4-6。本研究是利用链亲和素偶联磁珠亲和捕捉法构建了梅花鹿的（CA）n微卫星DNA富集文库，为进一步筛选大量的梅花鹿微卫星遗传标记奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品来源 本试验所需样品来源于吉林省长双鹿业特产开发集团有限公司种鹿
9、场。采取梅花鹿新鲜肾脏组织，置于液氮中备用。1.1.2主要试剂 蛋白酶K、Taq DNA聚合酶及DNA限制性内切酶购自TaKaRa公司;链亲和素磁珠及磁力架购自Promega公司;微卫星探针(5Biotin (AC) 153) 、L inkerA(5pGATCGCAGAATTCGCACGAGTACTAC 3)LinkerB( 5GTAGTACTCGTGCGAATTCTGC 3)均由上海生工生物工程服务公司合成。1.2 方法1.2.1 基因组DNA的酶切与连接 采用蛋白酶 K 和苯酚抽提法，从梅花鹿软骨组织中提取DNA，将2 g DNA用MboI完全酶切,1.5%低熔点琼脂糖凝胶回收4001 0
10、00 bp的DNA片段。1.2.2 接头制备 将 LinkerA和LinkerB等量混合，94变性4 min ,70保温10 min ，然后缓慢冷却至室温。将制备的接头与酶切回收片段按1：1比例混合,T4 DNA 连接酶16连接过夜。1.2.3 链亲和素捕捉 65保温15 min使连接酶失活，以该连接产物为模板，以 LinkerB 为引物进行PCR扩增，将25 L的PCR产物95变性5 min，并迅速的加入预热的杂交体系中，该杂交体系为1.5 L微卫星探针，15 L的20SSC ，LinkerB的5.0 L ,10%SDS的0.5 L定容50 L ，68杂交1个小时。在2.5 mL的硅化离心管
11、中加入500 L的链亲和素磁珠，用200 L洗液 B&W10 mmol.L-1 Tris-cl ,1 mmol.L-1 EDTA ,2 mol.L-1 NaCl 洗涤2次，将离心管放在磁力架上使链亲和素磁珠吸附在管壁上，用移液器吸弃上清液，用150 L的洗液I6SSC,0.1%SDS 重悬磁珠，直至磁珠变得顺滑易洗脱。将杂交完毕的杂交液加入已平衡好的磁珠中，25温育20 min ，并轻轻摇动时生物素和链亲和素结合，温育结束后，将离心管放置到磁力架上，去除溶液。用200 l的洗液I室温洗涤2次，每次10 min ，200 L洗液II3SSC,0.1%SDS 在68的条件下洗涤2次，每次15 mi
12、n ，200 l的洗液1SSC ,0.1%SDS 室温下快速洗涤2次。用200 L的0.1TE在室温下快速洗涤2次，加入35 l 0.10TE ，95变性10 min ，释放出含有微卫星序列的单链DNA ，然后迅速地将硅化管放置到磁力架上吸出备用7-8。1.2.4 文库构建与鉴定 以链亲和素捕捉的洗脱液为模版，LinkerB为引物进行PCR扩增，PCR反应体系为25 L，PCR 扩增条件为94预变性 3 min ，94变性 1 min ，58退火1 min ，72延伸 1 min ，扩增30个循环，最后72延伸 7 min ，将PCR产物回收纯化后与 pMD18-T 载体相连接，转化 DH5a
13、感受态细胞，涂布于含有 IPTG ,X-gal 和氨苄青霉素的LB平板，37培养过夜，随机挑取白色克隆进行PCR鉴定，挑取部分克隆送上海生工生物工程服务公司进行测序，对测序结果进行分析以鉴定文库中微卫星DNA的富集效率。2 结果2.1 梅花鹿基因组酶切结果 梅花鹿基因组DNA经酶切，回收4001 000 bp的片段（图1），之所以回收这一区间的片段主要是考虑到实际测序过程中，当片段大于1 000 bp时，可能不能一次测通，同时若酶切片段过长会使该片段在亲和捕捉的过程中不易被吸附而丢失，另外长片段的PCR扩增也不易进行，另外之所以选择用MboI内切酶是由于酶切位点（GTAC）在哺乳动物基因组中分
14、布广泛，可以均匀的将基因组切成大小不同的DNA片段，从而保证了筛选出的微卫星位点的随机性和真实性。2.2 连接有接头的酶切片段的PCR结果 将酶切片段连接及亲和捕捉，最后经过洗液，洗脱，PCR 扩增片段大小均在4001 000之间（图2），从连有接头的酶切回收片段的PCR电泳图来看（图2），可以发现总有1条较亮的区域集中在500400 bp 的范围内，从理论上可以推测，在梅花鹿的基因组中有较大一部分区域均与分布着MboI酶切位点，即散在重复序列。2.3 阳性克隆的鉴定 将PCR产物回收纯化，与pMD18-T载体连接，获得重组克隆约1 380个，以LinkerB为引物进行PCR菌液鉴（图3）其中
15、阳性克隆数有1 144个，空载数为236个，阳性克隆率为82.9%。2.4 文库插入片段大小的鉴定及序列的重复类型 将随机挑取的62个克隆进行序列测定，对文库的插入片段大小进行鉴定，同时对微卫星序列的核心序列和重复次数进行初步分析。测序结果表明其中50个克隆中含有微卫星序列，即含有微卫星序列的比率为80.64%。插入片段大小介于310bp1 067bp，其中(CA)n 类型的微卫星序列有28个，其它双碱基重复（如（CT）n，（AT）n（GA）n 等）的微卫星序列有9个，单碱基重复（如（A）n，（T）n,(C)n,(G)n）的微卫星序列有5个，三碱基以上重复(如（GTG）n,(ATT)n,(GT
16、T)n,(GGT)n等)的微卫星序列有8个（附表一）。其他类型的微卫星序列有3个。图 1 基因组DNA经MboI内切酶的酶切结果(M:Marker.DL2000;1-3.酶切结果)Fig.1.The result of enzyme cutting by MboI of genome DNA(M: Marker DL2000; 1-3: The result of enzyme cutting) 图 2 接连有接头的酶切DNA回收片段的PCR结果(M:Marker.DL2000;1-2.PCR结果)Fig.2.The amplification of PCR of recover fragme
17、nts of enzyme cutting with Linker (M: Marker DL2000; 1-2: The amplification of PCR) 图3 文库插入片段大小的PCR鉴定(M: Marker DL2000;1-4.PCR结果)Fig.3.The assessment of insertion elements in library(M: Marker DL2000; 1-4: The fragments of PCR amplification)3 讨论微卫星DNA是由侧翼序列和串联重复核心序列组成，微卫星遗传标记的基本原理是根据微卫星序列两端互补序列设计引物，
18、通过PCR反映扩增微卫星片段，由于核心序列串联微卫星重复数目不同，因而能扩增出不同长度的PCR产物，根据不同个体扩增片段的大小决定基因型并计算等位基因频率9。作为遗传学中最重要的分子遗传标记之一，微卫星标记可以用于动物基因图谱的构建，生物体基因功能的表达及调控是受基因组本身的结构即基因组中 DNA碱基顺序和组成的指导，而构建基因图谱是了解基因组的组织，结构以及性状控制的分子基础的最基本的方法。对于动物育种来说，构建基因图谱的意义在于可以详细了解控制那些有价值的数量性状或抗病性状的位点的组成和表达调控机制，以便于操作这些基因，由于微卫星具有多态性高，杂合子比例高，信息含量大，以及由于其保守性共显
19、性等特点，使其引物可在不同实验室间交流，并适用于自动化和半自动化操作等，已经成为目前遗传连锁图谱制作的主要标记。微卫星富集文库法包括 2 种方法，一种是Ostrander等 10,建立的标记选择法，另一种是KandpalRP等11,建立的亲和素捕捉法。链亲和素捕捉法是利用链亲和素与生物素的亲和性，通过生物素标记的寡核苷酸与含有微卫星的DNA片段杂交，洗去非特异性片段，然后将富集后的DNA片段进行PCR扩增，纯化，克隆和测序，以获得新的微卫星位点12。梅花鹿是重要的经济动物，也是倍受关注的濒危物种。微卫星对于梅花鹿的保护遗传学，QTL定位，种群遗传管理等都非常重要。而目前对梅花鹿的微卫星分离的研
20、究很少。本研究是以梅花鹿基因组DNA样品为材料，经限制性内切酶MboI酶切并1.5%的低熔点凝胶电泳回收4001 000 bp的DNA片段，酶切回收片段经与MboI酶的连接接头相连接与生物素标记的（CA）15 探针相杂交，再用链亲和素磁珠富集和PCR扩增后建立了微卫星富集文库。文库中含有重组克隆1 380个，经菌液PCR分析计算阳性克隆占 82.9%，将检测得到的阳性克隆进行测序，计算得到含有微卫星重复的序列占阳性克隆的80.64%。这为进一步筛选大量的梅花鹿的微卫星遗传标记，构建梅花鹿的遗传连锁图谱并且也为鹿属动物的系统进化研究奠定了基础。参考文献：1 田丽.中国梅花鹿的发展状况及保护对策J
21、.湛江师范学院学报，2007，28（6）：91-95.2 郭延蜀，郑慧珍.中国梅花鹿地史分布，种和亚种的划分及演化历史J.兽类学报，2000，20（3）：168-179.3 Weber J L, May P E. Abundant class of human DNA polymor2 phisms which can be typed using the polymerase chain reactionJ. Am J Hum Genet, 1989, 44 (3) : 388 - 396.4 Barendse W, Armitage S M, Kossarek L M, et al. A
22、genetic linkage map of the bovine genomeJ. Nat Genet, 1994 (6) : 227 - 235.5 Crawford A M, Montgomery G W, Pierson C A, et al. Sheep link2 age mapp ing: nineteen linkage group s derived from the analysis of paternal half - sib familiesJ. Genetics, 1994, 137: 573 - 579.6 Archibald A L, Haley C S, Bro
23、wn J F, et al. The PiGMaP consorti2 um linkagemap of the pig (Sus scrofa) J. Mamm Genome, 1995,6 (3) : 157 - 175. 7 汤波.鸵鸟微卫星DNA的克隆、筛选与特性分析学位论文.北京：中国农业大学，2002.8 黄银花.鸭遗传图谱的构建及重要经济性状基因座的初步定位.学位论文.北京：中国农业大学，2004.9 高焕，孔杰.串联重复序列的物种差异及其生物功能J.动物学研究.2005，26（5）：555-564.10 Ostrander E A, Jong P M, Rine J, et a
24、l. Construction of small - in2 sert genomic DNA libraries highly enriched for microsatellite repeat sequencesJ. Proc NatlAcad SciU S A, 1992, 89 (8) : 3419 - 3423.11 Kandpal R P, Kandpal G, Weissman S M. Construction of librar2 ies enriched for sequence repeats and jump ing clones, and hybrid2 izati
25、on selection for region - specific markersJ. Proc Natl AcadSci U S A, 1994, 91 (1) : 88 - 92.12 BoTang,YinHuaHuang,LiLin.Isolation and characterization of 70 novelmicrosatellite markers from ostrich (Struthio camelus) genomeJ Genome Vol NRC Canada ，2003，46（1）：833-840.附表一：表一：微卫星序列的重复类型与重复次数分析Tab。1. Analyzed the repeats types and the repeats frequencies of microsatellites核心序列（CA）n（CA）n其它二碱基重复单碱基重复三碱基重复重复次数112123103636插入片段大小（bp）310bp1032bp352bp1031bp400bp656bp313bp1067bp464bp985bp序列数（个）523958