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1、组织和细胞培养技术第1页，此课件共48页哦消毒和灭菌消毒和灭菌物理消毒化学消毒抗生素消毒第2页，此课件共48页哦 1.紫外线消毒 紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。物理消毒物理消毒第3页，此课件共48页哦 2.高温湿热灭菌 压力蒸汽灭菌是最常用
2、的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70 烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。物理消毒物理消毒第4页，此课件共48页哦 3.高温干热灭菌干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160160以上，并保持90-120 90-120 分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属
3、器皿金属器皿。干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。烧灼烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。物理消毒物理消毒第5页，此课件共48页哦 4.过滤除菌 是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。物理消毒物理消毒第6页，此课件共48页哦 新洁而灭，其0.1水溶液可对器械、皮肤
4、、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。化学消毒化学消毒第7页，此课件共48页哦抗生素消毒抗生素消毒 抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。第8页，此课件共48页哦第三章第三章 细胞培养液细胞培养液 细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基培养基，即指所有用于各种目的的体外培
5、养、保存细胞用的物质，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。第9页，此课件共48页哦水与平衡盐溶液水与平衡盐溶液 1.水水 体外培养的细胞对水的纯度要求较高。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。存放时间一般不应超过2 2 周周。2.缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液。第10页，此课件共48页哦细胞培养基的基本要求细胞培养基的基本要求 1.1.营养成分营养成分氨基酸氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12 种必须氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、
6、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。体外培养的各种培养基内都含有必需氨基酸。第11页，此课件共48页哦 2 2 单糖单糖：培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。第12页，此课件共48页哦 3 3 维生素维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄
7、素、硫胺素、维生素B12 都是培养基常有的成分。4 4 无机离子与微量元素无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。第13页，此课件共48页哦细胞培养基的基本要求细胞培养基的基本要求 2.2.促生长因子及激素促生长因子及激素 各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。胰岛素:它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。氢化可的松:可促进表皮细胞的生长；泌乳素:有促进乳腺上皮细胞生长作用等。生长因子:bFGF、VEGF、EGF等。第14页，此课件共48页哦细胞培养基的基本要求细胞培养基的基
8、本要求 3.3.渗透压渗透压 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg,可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg 左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260-320mOsm/kg 的范围都适宜。每公斤水中所含的毫渗透粒子数(mOsm/kg H2O)第15页，此课件共48页哦细胞培养基的基本要求细胞培养基的基本要求 4.pH 4.pH值值 pH 值约在7.2-7.4 5.5.气体气体 主要是O2和CO2 6.6.无毒、无污染无毒、无污染 造成pH 波动主要是代谢产生的CO2，在封闭式培养过程中CO2 与水结合产生碳
9、酸，培养基pH 很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2 缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2 及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2 浓度（5），与培养基中的NaHCO3 处于平衡状态。NaHCO3+H2O-Na+OH-+H2O+CO2第16页，此课件共48页哦天然细胞培养基天然细胞培养基 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提
10、取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。第17页，此课件共48页哦血血 清清血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物血清种类:主要是牛血清、人血清、马血清等。牛血清分为小牛、新生牛和胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24 小时之内的新生牛；小牛血清取自出生1030 天的小牛。第18页，此课件共48页哦血清主要作用血清主要作用提供基本营养物质：氨基酸、维生素、核酸衍生物等。提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素等。生长因子如bFGF、EGF等。提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及
11、激素等。提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。第19页，此课件共48页哦细胞培养中使用血清的缺点细胞培养中使用血清的缺点血清含一些对细胞产生毒性的物质，如补体、抗体素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响。血清的使用使得实验和生产的标准化困难大规模生产中，血清来源困难，价格昂贵。
12、第20页，此课件共48页哦血清质量的鉴定血清质量的鉴定理化性质理化性质：如渗透压、pH 值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（应小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。微生物检测微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。促生长效果促生长效果：这是血清重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测。有三种方法：克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。第21页，此课件共48页哦血清判断血清判断好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠；发现血清浑浊、不透明
13、、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性；血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象；摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。要进一步了解血清的质量，则应连续培养某些细胞，观察细胞生长状况。第22页，此课件共48页哦血清的使用和储存血清的使用和储存使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即5630 分钟。灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。储存条件：血清一般储存于-20，同时应避免反复冻融。使用浓度：自从有了合成培养基，血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为520，最常用是10。采购血清时，最好先从供应商处
14、索取样品进行试验，选定一批后就要保留足够使用6 个月至1 年的量。第23页，此课件共48页哦合成细胞培养基合成细胞培养基一、基本组分 无机盐 CaCl2 MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4 氨基酸 维生素 脂溶性维生素(A、D、E、K)水溶性维生素包括牛物素、叶酸、B12等。碳水化合物 主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。酚红 pH 小于6.8 呈黄色；pH 大于8.4 呈红色第24页，此课件共48页哦葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用体外培养条件下，葡萄糖主要经糖酵解降解，产生过量的乳酸，降低培养基pH 值，增加渗透压，减少乳酸生产最常用的方法是限制培
15、养基中葡萄糖的含量。乳酸和氨是两种主要代谢废物，其积累可影响细胞生长以及产品质量。氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺产生的。限制培养基中谷氨酰胺的含量亦是减少氨生成的常用方法。第25页，此课件共48页哦常用细胞培养基常用细胞培养基MEM 细胞培养基系列DMEM 细胞培养基系列RPMI-1640 细胞培养基系列199 细胞培养基系列水解乳蛋白细胞培养基F-10,F-12 细胞培养基系列其它类型细胞培养基第26页，此课件共48页哦第27页，此课件共48页哦第28页，此课件共48页哦第29页，此课件共48页哦干粉培养基的配制干粉培养基的配制认真阅读说明书认真阅读说明书。注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO
16、3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES 等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。配制所用的水应是三蒸水。所用器皿应严格消毒。配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4 度。第30页，此课件共48页哦干粉培养基的配制方法干粉培养基的配制方法在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少5的双蒸水。在室温（20到30）的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，不要加热。水洗包装袋的内部，转移全部的痕量干粉到容器内。加NaHCO3 到培养基中。用双蒸水稀释到想要的体积，搅拌溶解。注意不要过
17、分搅拌。通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL 调节pH 值，培养基在过滤前要保持密封。第31页，此课件共48页哦无血清技术及其培养基无血清技术及其培养基观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物；激素类药物的研发。第32页，此课件共48页哦无血清培养基的基本配方无血清培养基的基本配方基础培养基添加组分促贴壁物质促贴壁物质促生长因子及激素促生长因子及激素酶抑制剂酶抑制剂结合蛋白和转运蛋白结合蛋白和转运蛋白微量元素微量元素第
18、33页，此课件共48页哦使用方法使用方法细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子要留有种子细胞细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。第34页，此课件共48页哦使用方法使用方法为了使细胞适应无血清培养，关键的是：处于对数生长中期90%活细胞率适应时以较高的起始细胞接种第35页，此课件共48页哦使细胞适应无血清培养基的方法使细胞适应无血清培养基的方法1.1.直接适应
19、直接适应细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。对于直接适应，接种密度该:2.53.5102.53.5105 5个个/ml/ml。当细胞密度达到13106 个/ml 时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4-7天后达到24106 细胞/ml 时，细胞完全适应了无血清培养基。可以传代培养。第36页，此课件共48页哦使细胞适应无血清培养基的方法使细胞适应无血清培养基的方法2.2.连续适应连续适应以2 倍正常接种密度接种生长活跃的细胞到75%血清培养基中传代培养。当细胞密度5105 细胞/ml 时，以2-3105 细胞/ml 细胞密度，在血清培养基：SFM 为1:1的混合培养基中传代培养。
20、以2-3106 细胞/ml 细胞密度，25有血清培养基中传代培养。当细胞密度达到1-3106 细胞/ml，在100SFM 培养基中传代培养。每隔3-5 天，当细胞密度达到1-3106 细胞/ml，细胞活率在90时，再次传代培养。第37页，此课件共48页哦使用无血清培养基的优点使用无血清培养基的优点增加确定性性能更加一致容易进行纯化和下游加工细胞功能的精确评估增强生长和/或产量生理反应性的较好对照增强细胞内中介物的检测第38页，此课件共48页哦无蛋白培养基无蛋白培养基 无蛋白培养基即不含有动物蛋白的培养基。无血清培养基仍含有较多的动物蛋白。从生物技术发展的趋势来看，不含动物蛋白的培养基又广泛的应
21、用前景，许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如果再生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂，最终要达到一定的质量标准也有一定的难度。无蛋白培养基就是为了适应这发展趋势而出现的，许多无蛋白培养基添加了植物水解物以替代动物激素、生长因子的作用。市场上已有适合多种细胞生长的无蛋白培养基。第39页，此课件共48页哦限定化学成分培养基限定化学成分培养基 限定化学成分培养基(chemical defined medium,CDM)是指培养基中的素有成分都是明确的，它同样不含有动物蛋白，同样也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等
22、。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物。目前已经有适合于293 细胞、CHO 细胞、杂交瘤细胞生长的CDM 问世。第40页，此课件共48页哦其他细胞培养用液其他细胞培养用液平衡盐溶液消化液pH 调整液抗生素溶液谷氨酰胺补充液第41页，此课件共48页哦平衡盐溶液平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成维持细胞渗透压平衡，保持pH 稳定及提供营养。用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。D-Hanks 与Hanks 的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hanks 常用于配制胰酶溶液。Hanks 平衡液仅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2 的环境，若放入C
23、O2 培养相，溶液将迅速变酸，使用时应注意。配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，应当首先溶解这些成分。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。第42页，此课件共48页哦平衡盐溶液配制图平衡盐溶液配制图第43页，此课件共48页哦消化液消化液1.1.胰酶溶液胰酶溶液：胰消化酪蛋白的能力常见有1：125 和1：250。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%浓度，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液。胰酶作用及溶解的最佳pH 是8-9，配制胰酶溶液应将液体调至pH8 左右，充分溶解，过滤除菌，分装4 度保存。第44页，此课件共48页哦消化液消化液 2
24、.EDTA 2.EDTA 溶液：溶液：EDTA 溶液也常用来解离细胞，它的作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可以用EDTA 和胰酶的混合液进行消化。EDTA 溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。第45页，此课件共48页哦消化液消化液 3.3.胶原酶溶液：胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L 或200000U/L,作用的最佳pH为6.5。胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS。第46页，此课件共48页
25、哦pHpH调整液调整液 1.NaHCO 1.NaHCO3 3 溶液：溶液：NaHCO3 是培养基中必须添加的成分，一般情况下按说明书的要求准确添加，以保证培养基在5%CO2 的环境下pH 达到设计标准。如果是封闭式培养，即不与5%CO2 的环境发生交换达到平衡，所使用的培养基就不能按照说明书所要求加入NaHCO3。此时常用5.6%或7.4%的NaHCO3 溶液调节培养基，使之达到所要求的pH 环境。第47页，此课件共48页哦pHpH调整液调整液 2.HEPES 2.HEPES 溶液溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性，主要作用是防止培养基pH 迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2 的环境，CO2 气体迅速逸出，pH 迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0 左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。第48页，此课件共48页哦