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1、毛细管电泳激光诱导荧光分离检测脑肠肽2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一1 1研究意义生物活性肽是一类具有重要生物学功能的多肽，生物活性肽的研究是生命科学，神经生理学、药理学和临床医学领域的前沿课题，开展生物活性肽的分离分析研究，寻求灵敏，高效，快速和简便的分析方法具有重要意义。2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一2 2生物活性多肽在内源性物质中占有非常重要的地位。作为激素、神经递质、免疫调节器、辅酶或酶阻剂、药物、毒素和生物抗体，它们参与控制和调节生物体中的许多重要的生理过程。当它们在体内分泌失常或代谢失调，就导致严重的病变。2021/7/19 2021/7/
2、19 星期一星期一3 3 脑肠肽主要分布在中枢神经系统例如下丘脑及肠消化道内。脑肠肽能调节胃肠的蠕动，调节胃肠的分泌作用和吸收作用，在调节胃肠道系统的生理活性过程中起重要作用。神经紧张肽等具有降低血压，止痛，能控制肠道收缩，增加血管的通透性等重要生理作用。2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一4 4已有的测定方法RIA CCK-4Gel Chromatography-RIACE-MS2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一5 5NT or NT8-13 CZE-UVTLCHPLC-UVELISACE-MS2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一6 6CE-
3、LIF的优点 CE由于具有高的分离效率,样品用量少,快速,简便,环保等特点,因而是分离生物活性物质如蛋白质,多肽和核酸的强有力的工具.由于紫外检测受毛细管短光程的限制,CE-UV的检测灵敏度为10-510-6mol/L,CE-LIF检测是CE最灵敏的检测方法之一.Ar+激光器(激发波长488nm,发射波长520nm)是最常用的一种商品化的VIS区的激光源.2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一7 7 利用自身的荧光进行检测,仅局限与那些具有芳香环氨基酸残基(色氨酸和酪氨酸)的多肽分子.对于大部分的肽来说,事先要经过衍生化处理使其转化为具有荧光基团的化合物.2021/7/19 20
4、21/7/19 星期一星期一8 8FITC（荧光素异硫氰酸盐）2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一9 91,NT8-13:5.0 x10-9 M;2,NT:1.0 x10-8M,NKB:5.0 x10-9 M,CCK:5.0 x10-9 MPH 9.5 110mM borate,20%methanol 0.5psi-10s2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一1010Peptide Linear Regression equationCorrelationcoefficientLinear RangeDetectionlimitNT 8-13Y=1160.1+26
5、62.5 0.9953120nM0.5nMNTY=688.24+375.81 0.9963240nM1.0nMNKBY=455.6+464.14 0.9983220nM1.0nMCCKY=754.87+1645.80.9970120nM0.8nM2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一1111提高毛细管检测灵敏度的方法1.通过设计特殊类型的检测池,扩展在毛细管内的检测光程.2.发展高灵敏度的检测器,如激光诱导荧光检测,化学发光检测,电化学检测等等3.采用样品浓缩富集技术,包括电堆积、场放大、等速电泳、pH梯度、不连续缓冲液富集、固相萃取、膜富集等。2021/7/19 2021/7/
6、19 星期一星期一1212TransientTransient pseudo-isotachophoresis for samplepseudo-isotachophoresis for sampleconcentration in capillary electrophoresisconcentration in capillary electrophoresisMany water miscible organic solvents such as acetonitrile,acetone and small alcohols can function as a terminating i
7、on in transient isotachophoresis,which leads to sample concentration on the capillary.It is suggested that this method could be termed transient“pseudo-sotachophoresis”(pseudo-ITP).2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一1313Because of their low conductivity,these water miscible organic solvents provide the high
8、field strength necessary for band sharpening similar to that provided by the terminating ion.Salts,when present in such samples act briefly as leading ions,migrating rapidly in the organic solvent until they are slowed at the interface of the separation buffer.2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一14141,NT8-13:
9、5.0 x10-9 M;2,NT:1.0 x10-8M,NKB:5.0 x10-9 M,CCK:5.0 x10-9 M The concentration of NaCl inthe aqueous phase was held constant at 1%(w/v)Running buffer:PH 9.5 110mM borate,20%methanol 5psi-25s2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一15151,NT8-13:5.0 x10-9 M;2,NT:1.0 x10-8M,NKB:5.0 x10-9 M,CCK:5.0 x10-9 MThe percentag
10、e of methanol in the sample was kept constant at 70%(v/v)Running buffer:PH 9.5 110mM borate,20%methanol 5psi-25s2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一16161,NT8-13:1.0 x10-9 M;2,NT:2.0 x10-9M,NKB:1.0 x10-9 M,CCK:1.0 x10-9 MThe percentage of methanol in the sample was kept constant at 70%(v/v);the concentration o
11、f NaCl inthe aqueous phase was held constant at 1%(w/v)Running buffer:PH 9.5 110mmM borate,20%methanol 5psi-25s2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一1717Peptide Linear Regression equationCorrelationcoefficientLinear RangeDetectionlimitNT 8-13Y=238855-48646 0.99450.2510nM0.04nMNTY=67587-13525 0.99720.2510nM0.1nMNKBY=63808-18370 0.99980.310nM0.2nMCCKY=85934-319310.99740.410nM0.08nM富集后的线性及检出限富集后的线性及检出限Y:H X:nM2021/7/19 2021/7/19 星期一星期一18182021/7/19 2021/7/19 星期一星期一19192021/7/19 2021/7/19 星期一星期一2020