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1、第第7次课天然产物生次课天然产物生物转化物转化1现在学习的是第1页，共30页一、引言一、引言 生生物物转转化化是是一一种种以以生生物物工工程程方方法法，以以微微生生物物或或酶酶进进行行的的有有机化学反应。机化学反应。例如，在非活性碳原子上引入羟基：例如，在非活性碳原子上引入羟基：醋酸化合物醋酸化合物 氢化可的松前体氢化可的松前体 现在学习的是第2页，共30页再例：再例：喜树碱喜树碱 10-羟基喜树碱羟基喜树碱在温和及中性条件下进行水解：在温和及中性条件下进行水解：青霉素青霉素 青霉胺青霉胺 青霉胺的左旋体具有治疗风湿的功能，而其右旋体有致特变青霉胺的左旋体具有治疗风湿的功能，而其右旋体有致特变
2、的作用。的作用。现在学习的是第3页，共30页又如：又如：现在学习的是第4页，共30页 再如生物转化在脱氢方面的应用，抗炎药物乙酸强的松可由乙再如生物转化在脱氢方面的应用，抗炎药物乙酸强的松可由乙酸可的松酸可的松C-1,2位去氢制得，它的抗炎作用比乙酸可的松强位去氢制得，它的抗炎作用比乙酸可的松强34倍倍，副作用也小。以前用二氧化硒法脱氢，收率低，而采用简，副作用也小。以前用二氧化硒法脱氢，收率低，而采用简单节杆菌脱氢，收率高达单节杆菌脱氢，收率高达85%左右。左右。应用酶法，反应可以在温和条件下进行，且收率高。应用酶法，反应可以在温和条件下进行，且收率高。由于由于生物转化在温和条件下进行，选择
3、性高，立体专一性强，生物转化在温和条件下进行，选择性高，立体专一性强，方法简便，故越来越受到方法简便，故越来越受到有机化学家、微生物学家和药物化学家的有机化学家、微生物学家和药物化学家的重视。重视。下面结合天然产物研究的一些实例作些阐述。下面结合天然产物研究的一些实例作些阐述。现在学习的是第5页，共30页二、二、生物转化应用于甾体药物合成生物转化应用于甾体药物合成 1.1.甾体药物与甾醇生物转化甾体药物与甾醇生物转化(1)(1)甾体药物甾体药物 甾体药物是制药工业中极为重要的甾体药物是制药工业中极为重要的产品，它产品，它包括性激素、避孕药、肾上包括性激素、避孕药、肾上腺皮质激素、同化激素腺皮质
4、激素、同化激素等。例雄激素等。例雄激素睾丸酮睾丸酮，雌激素，雌激素炔雌醇甲醚炔雌醇甲醚，孕激素，孕激素双双酯炔诺酮酯炔诺酮，避孕药，避孕药甲基炔诺酮甲基炔诺酮，皮质，皮质激素激素氟烃氢化泼尼松氟烃氢化泼尼松，同化激素，同化激素去氢去氢甲睾酮甲睾酮等。等。现在学习的是第6页，共30页 1968年，全世界约年，全世界约70%的甾体药物是从墨西哥产的薯蓣皂素作的甾体药物是从墨西哥产的薯蓣皂素作起始原料进行生产。下图表示由薯蓣皂素及中间体起始原料进行生产。下图表示由薯蓣皂素及中间体ADD出发生产出发生产的甾体激素。的甾体激素。现在学习的是第7页，共30页现在学习的是第8页，共30页现在学习的是第9页，
5、共30页 近年来随着新甾体药物的发现，生产的发展，近年来随着新甾体药物的发现，生产的发展，生产规模的生产规模的扩大扩大，原料需要量也逐年增加；另一方面由于不合理的采掘，造，原料需要量也逐年增加；另一方面由于不合理的采掘，造成资源逐年短缺，植物中皂苷含量下降，使在国际市场上供需间成资源逐年短缺，植物中皂苷含量下降，使在国际市场上供需间出现矛盾，出现矛盾，薯蓣皂素的成本飞涨薯蓣皂素的成本飞涨。日本及美国的一些学者着手。日本及美国的一些学者着手进行扩大资源的研究。进行扩大资源的研究。(2)(2)甾醇生物转化甾醇生物转化 自自然然界界存存在在着着极极为为丰丰富富的的甾甾族族化化合合物物，如如胆胆固固醇
6、醇、-谷谷甾甾醇醇等等，其其结结构构与与甾甾体体药药物物相相近近，利利用用这这些些甾甾体体资资源源的的关关键键是是使使C-17位位侧侧链链降降解解，并并进进行行羟羟化化、脱脱氢氢、芳芳构构化化等等一一些些反反应应。大大家家都都知知道道，以以CrO3氧氧化化，使使侧侧链链降降解解获获得得17-酮酮基基化化合合物物的的方方法法，收收率率9%，无无实实用用价价值值。国国外外一一些些学学者者用用生生物物转转化化的的方方法法，达达到到了了C-17位位侧侧链链降降解解这这一一目目的的，并并可可在在甾甾核核结结构构上上一一些些非非活活性性部部位位发生羟化、脱氢、环氧化等反应，从而获得所需的甾体药物。发生羟化
7、、脱氢、环氧化等反应，从而获得所需的甾体药物。现在学习的是第10页，共30页例一些常见甾体资源：例一些常见甾体资源：一般认为胆固醇经过体内生物转化，即在酶的作用下，使一般认为胆固醇经过体内生物转化，即在酶的作用下，使其侧链降解，并经过其它的一些转化而产生各种化合物，具其侧链降解，并经过其它的一些转化而产生各种化合物，具体过程见下图所示。因此，人们预料也许微生物也具有各种体过程见下图所示。因此，人们预料也许微生物也具有各种酶能使侧链切断。酶能使侧链切断。现在学习的是第11页，共30页现在学习的是第12页，共30页ADD的进一步分解：的进一步分解：现在学习的是第13页，共30页2.2.甾体侧链的选
8、择性降解甾体侧链的选择性降解 甾甾醇醇代代谢谢过过程程中中，希希望望某某中中间间体体累累积积，一一般般可可采采用用诱诱变变，使使微微生生物物失失去去进进一一步步分分解解该该中中间间体体的的能能力力；或或加加入入酶酶抑抑制制剂剂，使使参与该反应的酶失活。参与该反应的酶失活。(1)(1)通过诱变技术选择性降解甾体侧链通过诱变技术选择性降解甾体侧链 通通过过诱诱变变技技术术得得到到选选择择性性降降解解甾甾体体侧侧链链而而不不导导致致甾甾体体母母核核破破坏坏的的生生化化阻阻断断突突变变株株。诱诱变变一一般般是是采采用用物物理理方方法法如如紫紫外外线线照照射射，化化学诱变剂学诱变剂如如N-甲基甲基-N-
9、亚硝基胍等。亚硝基胍等。由由诱诱变变产产生生生生化化阻阻断断的的突突变变株株中中，由由于于酶酶的的缺缺损损，导导致致甾甾体体降降解解不不完完全全，使使发发酵酵液液中中能能产产生生大大量量积积累累所所需需产产物物的的中中间间体体，如如4AD、ADD等。等。现在学习的是第14页，共30页(2)(2)酶抑制剂存在下甾体侧链的选择性降解酶抑制剂存在下甾体侧链的选择性降解 甾甾体体化化合合物物如如胆胆固固醇醇等等的的微微生生物物降降解解历历程程是是侧侧链链端端甲甲基基的的羟羟基基化化，羟羟基基被被氧氧化化形形成成羧羧基基，羧羧酸酸的的-氧氧化化而而导导致致碳碳链链的的缩缩短短。当当侧侧链链断断裂裂以以后
10、后，发发生生9位位羟羟基基化化，接接着着B环环的的开开裂裂，再再进进一一步步分分解解而而产产生生二二氧氧化化碳碳和和水水。所所以以9位位羟羟基基化化是是甾甾体体母母核核分分解解的的开开始始，若若能能抑抑制制9位位羟羟化化酶酶，有有可可能能使使ADD积积累累，供供进进一一步步合合成成其其它它药药物用。物用。已知已知9位羟化酶是单一氧化酶，具有几个蛋白质并形成一位羟化酶是单一氧化酶，具有几个蛋白质并形成一个电子转移链，其中有的蛋白质是以个电子转移链，其中有的蛋白质是以Fe2+作为必需金属离子的作为必需金属离子的蛋白质，除去或取代了这一金属离子就使酶完全丧失活力。因此常蛋白质，除去或取代了这一金属离
11、子就使酶完全丧失活力。因此常用金属螯合剂来除去用金属螯合剂来除去Fe2+，或用性质相似而无活性的离子来取代，或用性质相似而无活性的离子来取代Fe2+。现在学习的是第15页，共30页 金金属属螯螯合合剂剂中中必必须须具具备备Fe2+螯螯合合能能力力及及亲亲脂脂性性，例例如如，,-联联吡吡啶啶、邻邻二二氮氮杂杂菲菲及及8-羟羟基基喹喹啉啉的的效效果果较较好好。乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸(EDTA)螯螯合合能能力力很很强强，但但是是在在脂脂肪肪族族分分子子中中又又带带有有负负电电荷荷，亲亲脂脂性性差差，不不能能抑抑制制9-羟羟基基化化酶酶，使使ADD积积累累。但但是是使使用用时时同同时时加加入入表表面
12、面活活性性剂剂，如如月月桂桂基硫酸钠或十六烷基三甲基铵溴化物，同样也能使基硫酸钠或十六烷基三甲基铵溴化物，同样也能使ADD积累。积累。另发现另发现Ni2+、Co2+等能抑制等能抑制9位羟基化，位羟基化，Fe2+、Ni2+及及Co2+离子离子半径分别为半径分别为0.83A、0.78A、0.82A，十分接近，所以，十分接近，所以Ni2+、Co2+在在9-羟基化反应中，与羟基化反应中，与Fe2+交换而交换而抑制抑制9-羟化酶的活力而导致羟化酶的活力而导致ADD的的积累。积累。现在学习的是第16页，共30页(3)(3)侧链降解实例侧链降解实例 周周维维善善等等曾曾从从胆胆固固醇醇乙乙酸酸酯酯和和-谷谷
13、甾甾醇醇乙乙酸酸酯酯经经三三步步化化学学反反应应制制得得19-羟羟基基胆胆固固醇醇乙乙酸酸酯酯和和19-羟羟基基-谷谷甾甾醇醇乙乙酸酸酯酯，将将这这两两个个化化合合物物分分别别用用分分支支杆杆菌菌-209-20转转化化，结结果果19-羟羟基基胆胆固固醇醇乙乙酸酸酯酯和和19-羟羟基基-谷谷甾甾醇醇乙乙酸酸酯酯的的侧侧链链被被降降解解，得得到到产产物物19-羟羟基基-4-雄雄甾甾烯烯-3,17-二二酮酮，产产率率分分别别为为67%和和57%。19-羟羟基基-4-雄雄甾甾烯烯-3,17-二二酮酮可可以以作作为为合合成成19-去去甲甲甾甾体体药药物物的的原原料料，而而且且这这一一步步微微生生物物转转
14、化化可可以在较高的底物浓度下进行。以在较高的底物浓度下进行。现在学习的是第17页，共30页现在学习的是第18页，共30页3.3.甾体生物转化的反应类型甾体生物转化的反应类型 除除了了上上述述甾甾体体侧侧链链的的降降外外，甾甾体体生生物物转转化化的的反反应应类类型型主主要要还还有有以下三类。以下三类。(1)(1)羟化反应羟化反应 羟羟化化反反应应是是最最重重要要的的微微生生物物转转化化，专专一一性性较较强强，其其中中以以C-9、C-11、C-11、C-16、C-16、C-17、C-19角角甲甲基基和和侧侧链链C-27位上的羟基较为重要。位上的羟基较为重要。羟基形成的机理羟基形成的机理可能为：转化
15、到甾体上的羟基是直接取代甾体可能为：转化到甾体上的羟基是直接取代甾体碳架上的氢的位置，且取代过程中没有产生立体构型的变化，也碳架上的氢的位置，且取代过程中没有产生立体构型的变化，也不是通过形成烯的中间体来完成的，即羟基取代的立体构型不是通过形成烯的中间体来完成的，即羟基取代的立体构型(或或型型)是由氢原子原来所占的空间位置决定的。是由氢原子原来所占的空间位置决定的。现在学习的是第19页，共30页 C-11、C-11羟化的生物转化在抗炎药物的制备中经常用到羟化的生物转化在抗炎药物的制备中经常用到，例由薯蓣皂素经开环、氧化、环氧化等生成中间产物例由薯蓣皂素经开环、氧化、环氧化等生成中间产物16,1
16、7-环环氧黄体酮，用黑根霉在氧黄体酮，用黑根霉在C-11位上引入羟基，再经溴化氢开环脱溴，位上引入羟基，再经溴化氢开环脱溴，进行进行C-21碘置换，得抗炎药物乙酸可的松，见下图。此法工艺简便，碘置换，得抗炎药物乙酸可的松，见下图。此法工艺简便，总收率约总收率约34%左右。左右。现在学习的是第20页，共30页(2)(2)脱氢反应脱氢反应 微微生生物物对对甾甾体体脱脱氢氢经经常常发发生生在在A环环的的C-1,2和和C-3,4位位之之间间。抗抗炎炎甾甾体体药药物物的的母母核核在在C-1,2位位导导入入双双键键后后，能能成成倍倍增增加加抗抗炎炎作作用用。例例如如乙乙酸酸可可的的松松C-1,2位位导导入
17、入双双键键生生成成1,2-脱脱氢氢乙乙酸酸可可的的松松后后，抗抗炎炎作作用用增增加加34倍倍。化化学学方方法法脱脱氢氢一一般般用用二二氧氧化化硒硒法法，收收率率较低，且产品中硒不易除尽，所以生物转化脱氢较化学方法好。较低，且产品中硒不易除尽，所以生物转化脱氢较化学方法好。脱氢反应机理如下图所示，脱氢反应机理如下图所示，甾体甾体C-1,2-脱氢是在酶与辅酶催化下脱氢是在酶与辅酶催化下先进行了酮的烯醇化，然后形成的烯醇化氢与酶结合而直接脱去先进行了酮的烯醇化，然后形成的烯醇化氢与酶结合而直接脱去氢。氢。现在学习的是第21页，共30页现在学习的是第22页，共30页 下图为氢化可的松在简单节杆菌作用下
18、，下图为氢化可的松在简单节杆菌作用下，C-1,2位脱氢得位脱氢得氢化泼氢化泼尼松（氢化强的松）尼松（氢化强的松）的例子。氢化可的松浓度低时转化率可达的例子。氢化可的松浓度低时转化率可达95%，得到的氢化泼尼松再经乙酰化得乙酸氢化泼尼松，它，得到的氢化泼尼松再经乙酰化得乙酸氢化泼尼松，它的抗炎作用效率高、副作用小。的抗炎作用效率高、副作用小。现在学习的是第23页，共30页(3)(3)芳构化反应芳构化反应 生物转化甾体时，芳构化主要发生在生物转化甾体时，芳构化主要发生在A环上，芳构化反应是合成环上，芳构化反应是合成雌激素的一类重要反应。雌激素的一类重要反应。芳构化酶芳构化酶是属于细胞色素是属于细胞
19、色素P450的一种复合酶，的一种复合酶，可氧化脱去可氧化脱去C19类固醇的类固醇的19-甲基，使甲基，使A环芳构化，从而转变成环芳构化，从而转变成C18雌激雌激素如雌酮、雌二醇等，过程如下所示。素如雌酮、雌二醇等，过程如下所示。现在学习的是第24页，共30页 另外由于另外由于A环芳构化以后，甾核对微生物较稳定，设想可进行环芳构化以后，甾核对微生物较稳定，设想可进行甾醇侧链的降解直接合成雌激素等药物。有人利用甾醇侧链的降解直接合成雌激素等药物。有人利用Nocardia sp.(ATCC 19170)，成功地直接从，成功地直接从19-羟基羟基-4-胆甾烯胆甾烯-3-酮及酮及19-羟基羟基-4-谷甾
20、烯谷甾烯-3-酮来制备雌甾酮：酮来制备雌甾酮：现在学习的是第25页，共30页 60年年代代有有人人利利用用1414C C标标记记的的三三种种甾甾体体化化合合物物4-4-1414C-4-C-4-雄雄甾甾烯烯-3,17-3,17-二二酮酮、雌雌甾甾酮酮及及雌雌二二醇醇与与微微生生物物一一起起培培养养(见见下下图图)，发发现现雌甾酮及雌二醇没有被分解，雌甾酮及雌二醇没有被分解，A环的芳香化使甾体环系稳定。环的芳香化使甾体环系稳定。现在学习的是第26页，共30页4.4.实例实例 胆固醇用胆固醇用Arthrobocter simplex的发酵过程大致可分三步进行：的发酵过程大致可分三步进行：(1)细胞生
21、长；细胞生长；(2)加入胆固醇诱发分解胆固醇的酶；加入胆固醇诱发分解胆固醇的酶；(3)加入螯合剂抑制加入螯合剂抑制9-羟基酶，使羟基酶，使ADD积累。积累。由由于于胆胆固固醇醇、植植物物甾甾醇醇不不溶溶于于水水，实实际际工工作作中中，常常将将甾甾体体化化合合物物磨磨成成细细粉粉，并并加加入入适适量量植植物物油油及及种种子子蛋蛋白白，使使ADD的的转转化化率率大大大提高。大提高。现在学习的是第27页，共30页可由可由ADD以各种化学方法生产以下产品：以各种化学方法生产以下产品：雌激素：雌激素：炔雌醇甲醚，雌二醇，雌三醇等。炔雌醇甲醚，雌二醇，雌三醇等。现在学习的是第28页，共30页雄激素：雄激素：睾丸酮等睾丸酮等 利尿剂利尿剂：螺甾内酯等：螺甾内酯等皮质激素皮质激素：氟烃氢化泼尼松：氟烃氢化泼尼松等等 抗肿瘤药：抗肿瘤药：1-dehydro-testololacton等等 现在学习的是第29页，共30页孕激素孕激素：炔诺酮，异炔诺酮，双酯炔诺酮等：炔诺酮，异炔诺酮，双酯炔诺酮等.炔诺酮炔诺酮 异炔诺酮异炔诺酮 双酯炔诺酮双酯炔诺酮 现在学习的是第30页，共30页