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1、第3章基因组学物理图绘制2现在学习的是第1页，共37页遗传图的缺点n n遗传图的分辨率有限遗传图的分辨率有限 基因组测序和组装所要求的标记密度是基因组测序和组装所要求的标记密度是基因组测序和组装所要求的标记密度是基因组测序和组装所要求的标记密度是100kb100kb。n n遗传图的覆盖面较低遗传图的覆盖面较低 重组热点，倒位区段重组热点，倒位区段重组热点，倒位区段重组热点，倒位区段n n遗传图分子标记的排列有时会出现差错遗传图分子标记的排列有时会出现差错 环境因素，取样误差环境因素，取样误差环境因素，取样误差环境因素，取样误差现在学习的是第2页，共37页物理作图的方法物理作图的方法 o 限制酶
2、作图限制酶作图(Restriction Mapping)(Restriction Mapping)o 依靠克隆的基因组作图依靠克隆的基因组作图(clone-based mapping)(clone-based mapping)o 荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ (Fish,Fluorescent in situ hybridization)hybridization)o 序列标签位点作图序列标签位点作图 (STS(STS，Sequence taged site)Sequence taged site)现在学习的是第3页，共37页1.1.1.1.限制性
3、作图限制性作图 它是将限制性酶切位点标定在DNADNA分子的相对位置分子的相对位置.其只能应用于较小的其只能应用于较小的DNADNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率.通常采用的通常采用的6 6碱基对识别顺序的限制酶仅适合碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb50Kb以以下下DNADNA分子的精确作图分子的精确作图.现在学习的是第4页，共37页1.1 限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)基本原理基本原理1Kb EcoR I待检的待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBH H EH H H H E+BEB6KbEH 4KbEB 5KbBH
4、现在学习的是第5页，共37页琼脂糖电泳琼脂糖电泳现在学习的是第6页，共37页用于小片段用于小片段DNADNA的分析，精的分析，精度非常高度非常高聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳现在学习的是第7页，共37页1.2 限制酶作图的改进限制酶作图的改进n n脉冲凝胶电泳脉冲凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)n n稀有切点限制图绘制稀有切点限制图绘制垂直交变电场,两个电场方向成为直角 一般的凝胶电泳30Kb 以下，脉冲凝胶是提高了2个数量级，达到 10Mb DNA 片段 50Kb 现在学习的是第8页，共37页稀有切点限制图绘制注意事项稀有切点限制图绘制注意事项:
5、识别序列越长产生的片段越大;识别位点碱基数识别位点碱基数识别位点碱基数识别位点碱基数预计预计预计预计DNADNA片段平均长度片段平均长度片段平均长度片段平均长度/Kb/Kb41648641010004的n次方，n是限制酶识别的碱基数现在学习的是第9页，共37页 识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小;如人类基因组如人类基因组A/TA/T比例接近比例接近60/%,60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生的片段多于高比例产生的片段多于高比例G/C识别位点酶识别位点酶特异序列含量高，否则效果不好现在学习的是第10页，共37页 有些限制酶识别位点较长 如酵母的-SceI识别顺序为18bp,TAGGG
6、ATAA/CAGGGTAAT 如果高等真核生物基因组中无此序列如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入待测基因组中体转导的方法将其引入待测基因组中.现在学习的是第11页，共37页基因组基因组DNADNA的甲基化状态的甲基化状态 如人类活细胞基因组中大量5 5-CG-3 顺序的胞嘧啶被甲基化,形成形成5 5-T TG-3G-3，使许多含有5 5-CG-3-CG-3顺序的内切酶很少找到可切位点顺序的内切酶很少找到可切位点.SmaI CCSmaI CCC/GGG 78kbGG 78kbNotI GC/GCGCGC/GCGCGC 1MbC 1M
7、b现在学习的是第12页，共37页凝胶浓度、电场强度、缓冲液凝胶浓度、电场强度、缓冲液现在学习的是第13页，共37页n n采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续改变后持续1s1s到到到到5min5min左右，然后再改变电流方向，反左右，然后再改变电流方向，反左右，然后再改变电流方向，反左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。复循环，所以称之为脉冲式交变电场。复循环，所以称之为脉冲式交变电场。复循环，所以称之为脉冲式交变电场。脉冲凝胶电泳脉冲凝胶电泳(PFGE)(pulsed-fieldgelelectrophore
8、sis)分离范围：分子量分子量 20kb5000kb现在学习的是第14页，共37页n n分辨力：分辨力：10MB10MBn n垂直交变电场垂直交变电场,两个电场方向成为直角两个电场方向成为直角 30Kb10Mb30Kb10Mbn nDNADNA片段片段50Kb50Kbn n19841984年，年，SchwartzSchwartz和和CentorCentor发明了交变脉冲场凝胶电泳发明了交变脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgel(pulsed-fieldgelelectrophoresiselectrophoresis，PFGE)PFGE)技术，与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术
9、采用定时改变技术，与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1s1s到到5min5min左右，然后再改变电流方向，反复左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。循环，所以称之为脉冲式交变电场。一、一、PFGEPFGE的基本原理的基本原理脉冲电泳分离脉冲电泳分离DNADNA大分子的介质是琼脂糖，大于大分子的介质是琼脂糖，大于20kb20kb的线性的线性DNADNA双链片段，在琼脂双链片段，在琼脂糖凝胶的网孔中的泳动，就像蛇行似的寻找弯曲蜿蜒的孔隙。普通的单方向恒定电场给糖凝胶的网孔
10、中的泳动，就像蛇行似的寻找弯曲蜿蜒的孔隙。普通的单方向恒定电场给DNADNA分子的泳动动力方向确定且不发生变化，所以严重影响凝胶电泳分离大分子量分子的泳动动力方向确定且不发生变化，所以严重影响凝胶电泳分离大分子量DNADNA片段的效果。片段的效果。PFGEPFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得施加在凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNADNA分子能分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的孔隙变化，达到分离大分子线性DNADNA的目的，最大分辨率为的目的，最大分辨
11、率为5000kb5000kb大小的线性大小的线性DNADNA分子。在交变脉冲电场中，大分子量线性分子。在交变脉冲电场中，大分子量线性DNADNA改变泳动方向所需时间比小分子线性改变泳动方向所需时间比小分子线性DNADNA要长，因为前者变形能力低于后者。当要长，因为前者变形能力低于后者。当某一线性某一线性DNADNA在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需的时间大于脉冲场脉冲维持时间时，在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需的时间大于脉冲场脉冲维持时间时，该该DNADNA的迁移速度将减为最低。线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其分子量大的迁移速度将减为最低。线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其
12、分子量大致成正比，致成正比，PFGEPFGE也是基于不同也是基于不同DNADNA分子量的差异作为分离不同分子量的差异作为分离不同DNADNA分子的依据。当分子的依据。当DNADNA分分子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时，迁移率与DNADNA分子量成反比。根据被分分子量成反比。根据被分离离DNADNA分子的范围选择适当的脉冲时间，经过较长时间不断变形转向泳动，不同大小的分子的范围选择适当的脉冲时间，经过较长时间不断变形转向泳动，不同大小的DNADNA就被分离。就被分离。DNADNA分子的净迁移方向与普通电泳一样，垂直于样品孔。分子的净迁移方向与普通
13、电泳一样，垂直于样品孔。影响影响PFGEPFGE分辨率的因素包括几方面：两个脉冲场的均一性；两个脉冲场的脉冲时间以及它分辨率的因素包括几方面：两个脉冲场的均一性；两个脉冲场的脉冲时间以及它们之间的比率；两个脉冲场的强度和方向。为了增强们之间的比率；两个脉冲场的强度和方向。为了增强PFGEPFGE对大小差异较大的对大小差异较大的DNADNA样品的分样品的分辨率，可采用交变脉冲梯度电场，即在电泳过程中，先用较短的交变脉冲时间使较小辨率，可采用交变脉冲梯度电场，即在电泳过程中，先用较短的交变脉冲时间使较小的的DNADNA分子分离，然后用较长的交变脉冲时间分离较大的分子分离，然后用较长的交变脉冲时间分
14、离较大的DNADNA分子。分子。现在学习的是第15页，共37页端粒端粒自主复制起始点自主复制起始点标记基因标记基因标记基因标记基因着丝粒着丝粒大肠杆菌质粒复制起始点大肠杆菌质粒复制起始点质粒扩增筛选标记质粒扩增筛选标记2.1 大片段大片段DNA的克隆载体的克隆载体克隆位点克隆位点现在学习的是第16页，共37页n nYAC插入子稳定性问题,同一酵母细胞中多个YAC引起交换产生嵌合顺序n nPBR322人工改造而来n n色氨酸、鸟苷酸筛选，TRP和URAnium，基本培养基上筛选是否有这两个臂的基因。n nSUP确定是否有插入片段，插入时，红色克隆，无克隆时显示白色n n11.4kbn n着丝粒负
15、责细胞分裂时染色体均等分配n n端粒：保持人工染色体的稳定性。n n自主复制起点：细胞染色体复制的启动现在学习的是第17页，共37页缺点缺点v插入子不稳定插入子不稳定v交换效应交换效应vGC区克隆效率低区克隆效率低 标准的标准的YAC操作程序克隆的操作程序克隆的DNA平均为平均为600kb，改进的程序可，改进的程序可获得获得1400kb现在学习的是第18页，共37页n n230kb-1700kbn n标准操作为600kb，改进的1400kbn n插入子不稳定插入子不稳定n n交换效应交换效应 嵌合序列嵌合序列n nGC区克隆效率低区克隆效率低 人类基因组中人类基因组中现在学习的是第19页，共3
16、7页 BAC:BAC:细菌人工染色体细菌人工染色体 300Kb 1992300Kb 1992与一般质粒有与一般质粒有2点不同点不同:单拷贝复制单拷贝复制(不会发生重组不会发生重组嵌合嵌合)相对分子量大相对分子量大(具有较大容具有较大容量量)介导介导F因子因子单向复制单向复制维持低水平质维持低水平质粒拷贝数粒拷贝数现在学习的是第20页，共37页n nBAC来源于大肠杆菌中的天然F质粒,与一般质粒有2点不同:单拷贝复制(不会发生重组嵌合),相对分子量大(具有较大容量),类似于制备质粒方法提取质粒,方便快捷n nCm氯霉素n nLoxp 蛋白作用位点蛋白作用位点，可将环状，可将环状DNA转变转变为线
17、性为线性DNA，p1 Cre蛋白作用位点蛋白作用位点n nCosN伽马噬菌体末端酶专一性切割位点伽马噬菌体末端酶专一性切割位点现在学习的是第21页，共37页2.2 2.2 重叠群组建重叠群组建n n重叠群重叠群:相互重叠的相互重叠的DNADNA片段组成的物理图片段组成的物理图.n n重叠群的组建方法重叠群的组建方法 染色体步移法染色体步移法现在学习的是第22页，共37页 指纹指纹指纹指纹:系指确定系指确定DNADNA样品所具有的样品所具有的DNADNADNADNA片段片段;一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征一个克隆的指纹表示了该克隆
18、所具有的限定的顺序特征一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征.2.3 2.3 指纹作图法指纹作图法现在学习的是第23页，共37页常用的指纹分析方法常用的指纹分析方法常用的指纹分析方法常用的指纹分析方法:A A A A 限制性带型限制性带型(restriction patterns)(restriction patterns)(restriction patterns)(restriction patterns)指纹指纹 B B B B 重复序列重复序列重复序列重复序列DNADNA指纹指纹(repetitive DNA fingerprints)(repetitive DNA fing
19、erprints)(repetitive DNA fingerprints)(repetitive DNA fingerprints)现在学习的是第24页，共37页Southern印迹法印迹法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片段片段的凝胶的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液转用缓冲液转移移DNA吸附有吸附有DNA片片段的膜段的膜现在学习的是第25页，共37页常用的指纹分析方法常用的指纹分析方法常用的指纹分析方法常用的指纹分析方法:C C C
20、 C 重复重复重复重复DNA PCR(repetitive DNA PCR)DNA PCR(repetitive DNA PCR)DNA PCR(repetitive DNA PCR)DNA PCR(repetitive DNA PCR)或或或或分散重复序列分散重复序列PCR(interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)PCR(interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)PCR(interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)PCR(interspersed repeat element P
21、CR,IRE-PCR)指纹指纹D D D D STS STS STS STS作图作图作图作图(STS content mapping)(STS content mapping)(STS content mapping)(STS content mapping)现在学习的是第26页，共37页n nAluPCR方法特点在于利用人DNA中普遍存在的Alu重复序列，这种300bp序列的拷贝约900.000个，分布于整个人基因组。虽然Alu重复序列各拷贝间有很大差别，但已确定出了一个相同序列，且重复子中一些区域是极为保守的。我们认为，可设计合适的能识别这些保守区的PCR引物，进行有效的内-Alu扩增，从
22、复杂源中分离人DNA。平均密度4kb现在学习的是第27页，共37页现在学习的是第28页，共37页3.荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ hybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。现在学习的是第29页，共37页n n分辨率低,敏感性低n n精细作图n n对于特定探针,原位杂交所显示的中期染色体荧光信号所处的位置与染色体短臂末端的相对距离不变,经标记可将其标定在连锁图上.n
23、n分辨力达到25Kb,染色体无法确定外部形态现在学习的是第30页，共37页n n限制性作图快速，但是不适合大基因组n n克隆重叠群构建程序复杂，费时费力n n指纹作图对于大基因组有不少问题，会出现误排n n原位杂交操作困难，资料积累慢，一次实验定位的分子标记3-4个，现在学习的是第31页，共37页 4.序列标签位点作图序列标签位点作图(STS,Sequence Taged Site)长度长度:100-500 bp序列已知序列已知,可以设计可以设计PCR反应反应单拷贝单拷贝,在染色体上的位置是唯一的在染色体上的位置是唯一的EST(Expressed sequence tag)大部分可以作大部分可
24、以作STS现在学习的是第32页，共37页4.1 STS4.1 STS作图原理作图原理作图原理作图原理与遗传作图的相似，都是频率决定远近，是断裂频率与遗传作图的相似，都是频率决定远近，是断裂频率现在学习的是第33页，共37页4.2 4.2 4.2 4.2 寻找寻找STSSTSSTSSTS的方法的方法的方法的方法:n n表达顺序标签表达顺序标签(expressed sequence tag(expressed sequence tag(expressed sequence tag(expressed sequence tag，EST)EST)EST)EST)从从从从cDNAcDNAcDNAcDNA
25、中找到的小段顺序中找到的小段顺序中找到的小段顺序中找到的小段顺序,但基因家族成员间共有的序列不但基因家族成员间共有的序列不但基因家族成员间共有的序列不但基因家族成员间共有的序列不能用于能用于能用于能用于STSSTS。n nSSLPSSLP（simple sequence length polymorphisrnssimple sequence length polymorphisrns，SSLPsSSLPsSSLPsSSLPs）简单序列长度多态性简单序列长度多态性n n随机基因组顺序随机基因组顺序现在学习的是第34页，共37页n n随机挑选随机挑选cDNAcDNA克隆进行单向、一步大规模测序，
26、将所获得的克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分部分cDNAcDNA序列称为。序列称为。ESTEST是一个是一个cDNAcDNA克隆快速大规模测序后所获得的克隆快速大规模测序后所获得的 端和端和 端部分端部分cDNAcDNA随机片段，每个随机片段，每个ESTEST长度约长度约200200600bp,600bp,代表代表了一个单拷贝基因的部分了一个单拷贝基因的部分cDNAcDNA表达序列。由于大多数表达序列。由于大多数的长度不足的长度不足400bp,400bp,说明一个基因转录本的说明一个基因转录本的cDNAcDNA序列可能包序列可能包含多个序列重叠的含多个序列重叠的ESTEST，由于一个
27、基因，由于一个基因mRNAmRNA剪接点不同可以获得剪接点不同可以获得多个多个cDNAcDNA克隆，因此克隆，因此ESTEST既可能对应于一个既可能对应于一个cDNAcDNA的某一部分，的某一部分，又可能代表又可能代表mRNAmRNA的不同剪接方式的不同剪接方式。n n任何单一任何单一DNADNA顺序都可作为顺序都可作为STSSTS，特别是已在连锁分析中（遗传，特别是已在连锁分析中（遗传图中）定位的图中）定位的SSLPSSLP，其可建立物理图与遗传图之间的联系。，其可建立物理图与遗传图之间的联系。现在学习的是第35页，共37页ESTESTESTEST是一个是一个cDNAcDNA克隆快速大规模测
28、序后所获得的克隆快速大规模测序后所获得的33端和端和55端部分端部分cDNAcDNA随机片段，每个随机片段，每个ESTEST长度约长度约200200600bp,600bp,代代表了一个单拷贝基因的部分表了一个单拷贝基因的部分cDNAcDNA表达序列。表达序列。现在学习的是第36页，共37页n n网上克隆网上克隆n n19901990年，年，BrenneerBrenneer等首先提出人类基因组大规模等首先提出人类基因组大规模cDNAcDNA测序计划以来，测序计划以来，AdamsAdams等最先采纳并最早建立了表达序列标记技术，他们随机挑选等最先采纳并最早建立了表达序列标记技术，他们随机挑选cDN
29、AcDNA克克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNAcDNA序列称为序列称为ESTEST。n n由于大多数由于大多数ESTEST的长度不足的长度不足400bp,400bp,说明一个基因转录本的说明一个基因转录本的cDNAcDNA序列可能包序列可能包含多个序列重叠的含多个序列重叠的ESTEST，由于一个基因，由于一个基因mRNAmRNA剪接点不同可以获得多个剪接点不同可以获得多个cDNAcDNA克克隆，因此隆，因此ESTEST既可能对应于一个既可能对应于一个cDNAcDNA的某一部分，又可能代表的某一部分，又可能代表mRNAmRNA的不同剪的不同剪接方式接方式。现在学习的是第37页，共37页