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1、中国农学通报2012,28(35):15ChineseAgricultural Science Bulletin大肠杆菌病的噬菌体治疗进展马艳香，王元超，任慧英（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）摘 要：近年来，由于抗生素的滥用，致使耐药菌株越来越多，新的抗生素的研制又存在周期长、花费高、使用后细菌很快产生耐药性等问题，严重限制了抗生素在细菌病治疗中的应用。噬菌体作为天然抗菌剂，可抵制细菌感染，无论是裂解来自人类、动物体中的细菌，抑或消除食品及公共环境领域的污染，噬菌体均扮演着重要的角色。本研究以大肠杆菌感染的噬菌体治疗为例，介绍噬菌体临床治疗方面的研究进展。关键词：大肠杆菌；
2、噬菌体；治疗；研究进展中图分类号：Q939.48文献标志码：A论文编号：20122474ProgressMaof Phage Therapy of Colibacillosis(College of Animal Science andYanxiang,Technology,WangQingdaoYuanchao,AgriculturalRenUniversityHuiyingAbstract:researchesIn recent years,Qingdao Shandong 266109)resistanceseriouslyofonthenewbacteriaantibioticsthe
3、 resistantappearedfacedquicklymanybacteriaproblems,increased dramatically due to the abuse of antibiotics.Theafter antibioticssuch ascomingprolongedintodevelopmentmarkets andprocess,so on,whichhigh cost,haveenvironment.antiseptic,limitedphagestheplayapplicationan importantof antibioticsrole in thein
4、 thebacteriolysistreatment oftothethebacterialbacteriadiseases.from human,As aanimal,kind offoodnaturalorKey words:EscherichiaThis paper wascolireviewed;Phage;treatment;on the issueresearchof phageprogresstherapy of colibacillosis.0 引言断的扩大，药物的治疗效果显著下降。目前，由于普遍细菌性感染是感染性疾病中最常见的类型。据报出现耐药性的大肠杆菌，而疫苗尚处于早期的
5、研发阶道，全球每年有 500万儿童死于急性腹泻。在发展中段2，因而缺乏有效预防和治疗大肠杆菌性腹泻的措国家有 1/3的儿童期腹泻是由大肠杆菌引起的1。宠施。虽然提高饮用水质量可以减少大肠杆菌性腹泻的物和家畜的腹泻也多与大肠杆菌有关。大肠杆菌易于发生，但对于发展中国家来说，由于资金匮乏，要实施突变，具有广泛的致病范围，而大肠杆菌O157是食品中这项措施将面临巨大困难。与抗生素相比之下，特定的主要病原菌，并且大肠杆菌的一个亚种志贺氏杆菌噬菌体可以感染并裂解相应的细菌，噬菌体制剂具有能引起痢疾。人和动物随时都会受到大肠杆菌病的威不良反应小、不易产生抗药性、无残留且成本低等优胁。点，因而，噬菌体有望成
6、为抗生素的替代品应用于临抗生素自研发以来，一直被认为是治疗细菌病最床。有力的武器。但近年来，随着抗生素的大量使用，大肠噬菌体治疗的历史可以追溯到 100多年前。早在杆菌对药物的敏感性逐渐降低，并且其耐药谱也在不1919年，噬菌体的发现者之一Flix dHrelle就倡导用基金项目：山东省自然科学基金“大肠杆菌多价噬菌体尾丝蛋白结构与功能研究”(ZR2009DM009)。第一作者简介：马艳香，女，1987 年出生，山东诸城人，硕士生。通信地址：266109 山东省青岛市城阳区长城路700 号 青岛农业大学，Tel：053286080734，Email：。通讯作者：任慧英，女，1968年出生，山东
7、莱阳人，教授，博士，主要从事兽医微生物学与免疫学研究。通信地址：266109 山东省青岛市城阳区长城路700号 青岛农业大学，Tel：053286080734，Email：。收稿日期：20120712，修回日期：20121123。2 中国农学通报http:/噬菌体进行细菌性腹泻的治疗34。在20世纪30年代菌体编码的志贺氏样毒素基因是其主要的毒力因子。美国制药公司开始售卖以噬菌体为基本成分的治疗药对噬菌体和前噬菌体基因组的研究发现，长尾噬菌体物。第二次世界大战期间德国和苏联军队用噬菌体治中的大部分型噬菌体存在明确或潜在的毒力因疗腹泻，美国军队则进行噬菌体的分类研究。20世纪子13。很多其他种类
8、的噬菌体可导致大肠杆菌的溶源60年代Babalova等5噬菌体研究所在格鲁吉亚和第比性，但实际上仅有少数几种噬菌体含有已知的毒素基利斯进行了噬菌体的临床试验。到了 80年代，英国科因。为了稳妥起见，只能将烈性噬菌体用于噬菌体治学家就报道了大肠杆菌噬菌体在兽医临床的成功应疗。T4类噬菌体未携带已知的毒力因子基因14，因而用。目前噬菌体疗法日益受到重视6。相比而言，中这些噬菌体没有整合酶，它们只能降解宿主的 DNA，国关于噬菌体的研究比较滞后。著名医学微生物学家用于自身噬菌体DNA的合成。余贺曾在 1958年利用噬菌体成功地治愈了绿脓杆菌用噬菌体进行临床细菌病的治疗，首先需要证实对烧伤病人的感染，
9、开创了中国噬菌体治疗的先河，但噬菌体对人和动物体是安全的。T4类噬菌体中存在此后国内噬菌体治疗的研究再无进展；由陆承平等78大量的基因重组现象，然而在噬菌体或乳品噬菌体指导进行了大肠杆菌和链球菌噬菌体的分离、噬菌体中，没有发现与功能相关的基因群重组现象。自从证受体鉴定及噬菌体突变株构建及其感染特性的研究，实T4类噬菌体未携带毒素基因以后，人们就不再将为噬菌体的应用奠定了基础；张培东9分离了鸡致病T4类噬菌体的重组现象视为噬菌体治疗中的安全性性大肠杆菌及其噬菌体，并用噬菌体进行了雏鸡大肠问题了。杆菌病的防治试验，发现防治效果明显，但国内市场尚人们争论的另外一个问题是噬菌体基因在哺乳动无噬菌体治疗
10、制剂。目前，噬菌体治疗法仅限于烈性物细胞中的活性。有学者证明：半乳糖转移酶基因整噬菌体，而且有些噬菌体裂解谱很窄，因此，本研究对合进噬菌体基因组后，可在人成纤维细胞中转录出大肠杆菌病的噬菌体治疗的相关研究进行综述，旨在mRNA并表达蛋白质，然而，噬菌体与真核细胞的结为大肠杆菌噬菌体制剂的研究提供新的思路及方法。构及调控机制明显不同，并未表明可在真核细胞中实1 大肠杆菌噬菌体的来源现T4噬菌体增殖的一系列的复杂过程，特定噬菌体能噬菌体广泛存在于环境和生物体中，大肠杆菌噬感染的细菌宿主范围也受许多限制。菌体通常从污水、医疗废水、被污染河水以及人或动物另外，遗传学家曾报道，给小鼠口服微量的 M13排
11、泄物中分离得到。从健康人的粪样中主要分离到噬菌体 DNA，经肠道吸收后可整合到小鼠染色体上。型长尾噬菌体，而从腹泻病人粪样中则主要得到 T4类整合并不是噬菌体才有的性能，细菌的质粒DNA也具肌尾噬菌体（含能收缩尾巴的噬菌体）。有人从同一份有基因整合的能力。由于这一试验未能重复检验，因粪样中分离出了多种噬菌体。哺乳动物的肠道是T4而很难评论这些试验数据。肠道中存在各种噬菌体和类噬菌体的天然栖息地。细菌，如果整合这么容易发生，就应该能见到大量的类Mu噬菌体通过自身编码的重组酶来进行受体相似报道，而事实并非如此。1%4%的人粪样本中会有互作用基因的定位，调控与噬菌体吸附有关的蛋白基噬菌体或 M13噬
12、菌体，当用2株细菌做宿主菌时，可因表达的方式，通过倒位可产生4种(S、U、S、U)不同从约 1/3的腹泻患者粪样中分离到大肠杆菌噬菌体。的尾丝蛋白。Scholl等10报道了一种含有 2种不同尾如果选择10个指示菌株，那么70%的腹泻患者或 34%丝蛋白的大肠杆菌噬菌体，可以裂解任何单一尾丝蛋的健康者的粪样中可证实含有或M13噬菌体。白噬菌体的宿主，使其宿主范围得到了扩展。通过基由于大肠杆菌是人和动物肠道正常菌群的一部因工程的手段可以改变噬菌体的宿主谱。全世界分离分，人们担心用大肠杆菌噬菌体进行噬菌体治疗时会到的大多数肠致病性大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌，破坏机体的正常菌群，试验证明这种担心是多余
13、的。大约有30种不同的O血清型，这些菌株都可被噬菌体Chibani等15给小鼠饲喂了针对大肠杆菌的4种噬菌体裂解11，并且噬菌体的鸡尾酒制剂可扩展噬菌体的宿制剂，这些噬菌体对72株肠道正常大肠杆菌的总裂解主范围，降低细菌耐药性。率约为 46%，动物试验证明噬菌体对肠道正常菌群的2 噬菌体毒力因子及其安全问题影响是微乎其微的，但从粪便分离的 500株大肠杆菌人类许多病原细菌的毒力都由前噬菌体的基因整对这些噬菌体的敏感性可达40%100%。针对这一合进细菌基因组内导致的12，大肠杆菌噬菌体也存在点，笔者分析其原因，提出了三种假设，其一，在噬菌体这样的问题。在大肠杆菌O157菌株的基因组中，前噬的选
14、择压力下，本来对噬菌体敏感的菌株产生了对噬马艳香等：大肠杆菌病的噬菌体治疗进展 3 菌体的抵抗力；其二，噬菌体没有经抗酸剂处理或微胶发现当体内存在宿主菌时，噬菌体可以进入血液，穿过囊保护，无法在胃部内生存，导致在肠道中的噬菌体没血脑屏障，到达任何需要的位置进行增殖，脑部的噬菌有感染细菌的能力；其三，噬菌体存在于肠道中，但由体量甚至高于血液中的噬菌体量。给对照小鼠腹腔内于肠道内源性大肠杆菌细胞的生理性原因，而表现出注射105个噬菌体。大约 102的噬菌体可到达脑组织。抗噬菌体感染。研究者在噬菌体治疗期间从小鼠粪便对小鼠脑内注射志贺氏杆菌，8 h后脑中噬菌体可达到中分离到 100株大肠杆菌，体外检
15、测这些菌对噬菌株109个，说明噬菌体在屏障保护的脑内组织进行了增体是敏感的，所以第一个假设是不成立的。针对第二殖。给小鼠腹腔注射109个噬菌体时，血液中噬菌体的个假设，研究者给小鼠饮水中添加超过 104pfu/mL的滴度达107个，这个数据在感染后开始下降。噬菌体，发现整个试验期内几乎都可以从粪便中检测Merril等20证实血液中循环的噬菌体可被脾脏阻到噬菌体，证明没有经过抗酸剂保护的噬菌体通过肠留，且通过小鼠传代几次，很容易得到循环时间更长的道后仍具有感染性。研究者还发现动物个体差异对于突变噬菌体。在 1945年，Morton等21就证实当细菌和胃肠道噬菌体的影响不是很大，而且厌氧条件下和有
16、噬菌体的比例达 10:1时，仍然可以收到良好的治疗效氧条件下噬菌体均可感染其宿主菌，所以第三个假设果，在细菌感染 3 h后进行噬菌体治疗可产生效果，甚也是不成立的。小鼠的噬菌体口服试验证实噬菌体对至在细菌感染前 4天使用，仍然可以阻止感染动物死肠道正常菌群的影响不大。人类志愿者口服 T4噬菌亡。体也能保证他们肠道中正常大肠杆菌的数量16，说明关于治疗中噬菌体的临界用量问题，有人进行了针对致病性大肠杆菌的噬菌体对肠道正常菌群中的大体外 T4噬菌体的试验，发现当宿主菌低于 104个/mL肠杆菌是安全的。时，噬菌体的增殖将不会发生，但许多人对此产生了质噬菌体治疗大肠杆菌性腹泻能否成功取决于噬菌疑。体
17、在体内能否裂解致病性大肠杆菌。因为致病性大肠动物体内缺乏噬菌体敏感的靶细胞时，噬菌体在杆菌感染的靶位点是小肠，而且除腹泻急性期外不在体内的浓度快速下降，而如果存在靶细胞，那么噬菌体肠道定植，所以EPEC或ETEC菌株不可能定植在大肠则会快速扩增。过早给动物应用噬菌体且剂量过低常中对噬菌体具有抗性的正常大肠杆菌定居的位置。另会导致治疗失败。10%以上的口服用噬菌体可从粪便外，肠道正常菌群中的大肠杆菌生长在厌氧环境下，且中重新获得，这一点无论在人类志愿者，还是小鼠或大缺乏能分解多糖的酶，总是处于饥饿状态，这种状况下鼠身上，都得到了相似的结果。的大肠杆菌体内核糖体的数量较少，直接限制了噬菌4 噬菌体
18、的应用体增殖17。从这个意义上说，针对致病性大肠杆菌的4.1 食品卫生方面噬菌体对肠道正常菌群的破坏能力是极小的，因此对约有7%的牛粪样中存在大肠杆菌O157，这已成为人和动物体的副作用是很低的。屠宰过程中肉类污染的重要因素，已有将大肠杆菌人类并未意识到在食用自制的发酵食品（如酸乳、O157特异的噬菌体应用在食品卫生方面的报道22。当泡菜、蒜味腊肠）的同时，吃进去了噬菌体18。噬菌体肉中检测出含有大肠杆菌O157时，可用大剂量的噬菌临床治疗试验证实，噬菌体对人和动物体是安全的。体来减少这些细菌的数量。可对健康鸡体表进行高剂前苏联对几千名儿童和成年人进行的噬菌体临床试验量的噬菌体处理以防沙门氏菌
19、和弯曲杆菌污染鸡肉产没有发现不良影响。成年志愿者口服 108pfu T4噬菌品23。2006年8月美国食品和药物管理局批准了一种体后，没有发生不良反应，2项关于肝功能的酶指标均由噬菌体混合而成的产品，该产品主要用于杀灭肉制正常。品中的李氏杆菌，这是美国第一次批准将噬菌体作为3 口服噬菌体药物动力学的研究食品添加剂2425，也标志着噬菌体在食品加工领域得到当给成年小鼠口服剂量低至每毫升饮用水中含了正式承认。103pfu且不加抗酸剂保护的 T4噬菌体时，即可在粪便4.2 动物疾病的治疗方面中检测到噬菌体。增加口服噬菌体的浓度，粪便中可大肠杆菌可使肉仔鸡感染严重的呼吸道疾病。检测到的噬菌体也会增加。
20、当给予每毫升104pfu或Huff等26将噬菌体气雾施用后，给鸡胸腔气囊接种更高剂量的T4噬菌体时，噬菌体在粪便中出现或消失104cfu的大肠杆菌，发现同时使用噬菌体与大肠杆菌，可分别延后12天。107pfu的2种噬菌体可将死亡减半。当噬菌体的剂量Dubos等19进行了志贺氏菌噬菌体的体内试验，增加到 108pfu时，这种抗感染能力可一直持续到使用 4 中国农学通报http:/噬菌体后的 3天。张培东9用噬菌体进行了雏鸡大肠对这些儿童跟踪了 109天，结果发现，对照组的儿童中杆菌病的防治试验，发现在感染大肠杆菌前 12 h接种每1000个儿童有6.7个儿童发病，而在口服噬菌体组，噬菌体，雏鸡的
21、保护率最高，达90%，死亡率降低70%；每 1000 个有 1.8 个儿童发病，痢疾发生率下降了在感染大肠杆菌前 3 h接种噬菌体，雏鸡的保护率次3.8倍。细菌培养试验证实噬菌体口服后痢疾的发生之，使死亡率降低 30%；在感染同时以及感染后 3、9 h下降了2.6倍。另外这种噬菌体的使用还减少了其他接种噬菌体，死亡率分别升高10%、20%、10%。形式腹泻的发生，证实志贺氏菌噬菌体制剂也能抵抗Smith等27用一种对牛高致死率的肠致病性大肠其他血清型的大肠杆菌的感染。这种保护作用在 3杆菌感染牛，得到一系列的实验记录，可以获得噬菌体岁的儿童身上较为显著。然而该研究仅用俄语叙述了疗法的有效证据。
22、在感染 18 h后给予噬菌体可阻止75行字。腹泻的发生。当出现临床症状才进行噬菌体治疗时，对噬菌体疗法报道最详细的是来自波兰的关于败虽然不能有效抑制腹泻，但能降低动物死亡率。随着血症噬菌体治疗的案例（仅有一部分是由大肠杆菌引粪便中噬菌体数量的增多，肠道内病原的数量不断减起的）。包括那些用抗生素治疗无效的患者在内，噬菌少。这可通过胃肠道解剖结果证实。另一个试验中，体治疗成功的概率高于90%29。给刚出现腹泻症状的小牛接种了低剂量的噬菌体5 小结(105pfu)，并在一定时间后宰杀。12 h小肠后段可得到抗生素的滥用导致了细菌耐药性的产生。抗生素高达1010pfu的噬菌体，24 h噬菌体数量下降，
23、40 h不能研制的速度赶不上细菌产生耐药性的速度，许多细菌检测到噬菌体，同时也检测不到病原菌。如果给予低性感染得不到药物的有效治疗，尤其对于肿瘤患者、器级剂量的噬菌体(102pfu)，那么在细菌感染前10 min可官移植患者等，由于自身免疫力低下，比健康人更易感预防腹泻的发生，如果是感染前 6 h则没有预防效果。染多重耐药菌，临床治疗的难度非常大。通过本研究噬菌体在 5 h内可在动物体内增殖到 1011pfu，表明噬中对各个国家和地区针对大肠杆菌的噬菌体治疗方面菌体在体内能以惊人的速度增殖。在腹泻出现之初，的研究，发现用噬菌体治疗大肠杆菌性感染具有一定给予小剂量的噬菌体（低至 20 pfu），
24、仍可改善动物腹的疗效，随着细菌耐药性日益增强，噬菌体治疗会越来泻的症状。越体现出抗生素无法比拟的优越性。分子生物学技术在接受过噬菌体喷雾的牛舍，再饲养的小牛将不的日益成熟及应用，有望进一步扩展噬菌体的宿主谱，会再感染肠道病原体。对小牛的排泄物喷洒或高或低增强噬菌体的裂解性能，大肠杆菌的噬菌体治疗也将剂量的噬菌体（1010或106pfu）可预防小牛感染致病性会展现出更大的发展空间。大肠杆菌株。当在排泄物中检测到大量的病原体时，目前，噬菌体治疗在波兰、格鲁吉亚等东欧国家有噬菌体的数量将会是细菌数量的 10100倍。噬菌体近百年的历史，英、美等国家的一些高校及科研机构都可在牛舍存活 1 年，至少比致
25、病性大肠杆菌多存活开展了噬菌体治疗的研究与临床应用。2011年第一100天，且比肠致病性大肠杆菌更能抵抗酚类消毒剂届世界噬菌体大会在英国牛津大学举行，23个国家和的作用。噬菌体对牛皱胃的pH很敏感，可以通过在牛地区的研究者对噬菌体的应用进行了交流30，标志着奶中掺上噬菌体或在动物采食后立即给予噬菌体的方全球开始重视噬菌体治疗。中国有部分高校和科研院法来解决这个问题。所开展了噬菌体的相关研究，希望国家能加大对噬菌在 其 他 动 物 中 也 有 噬 菌 体 应 用 的 经 验。体治疗应用的科研资助，使噬菌体这样一种抗生素的Smithyman28报告了对赛马的个性化噬菌体治疗的经替代品能早日走上临床
26、，有效控制人及动物细菌病的验，可针对耐药性细菌感染进行噬菌体治疗。发生。4.3 医学领域的应用医学微生物学家余贺曾在 1958年利用噬菌体成参考文献功地治愈了烧伤病人的绿脓杆菌感染，开创了中国噬1Brussow H.Phage therapy:the Escherichia coli experienceJ.菌体治疗的先河。在 1963年，第比利斯和格鲁吉亚总Microbiology,2005,151(7):21332140.共有30769名儿童（年龄从 6个月到 7岁不等）接受了2Savarino S J,Hall E R,Bassily S,et al.Introductory evalu
27、ation of口服噬菌体的方法预防细菌性痢疾的试验。大约 1/2an oral,killed whole cell enterotoxigenic Escherichia coli pluscholera toxin B subunit vaccine in Egyptian infantsJ.Pediatr Infect的儿童居住在街道一边，每隔1周口服1次志贺氏菌噬Dis J,2002,21(4):322330.菌体药片，街道另一边的儿童口服空白对照剂。总共3Lise W.Flix dHrelle and the Origins of Molecular BiologyJ.马艳香等：大肠
28、杆菌病的噬菌体治疗进展 5 Med Hist,2001,45(2):294295.18ChibaniChennoufi S,Canchaya C,Bruttin A,et al.Comparative4Summers W C.Bacteriophage therapyJ.Annu Rev Microbiol,2001,genomics of the T4LikeEscherichiacoliphage JS98:implications55(1):437451.fortheevolutionofT4phagesJ.Bacteriol,2004,186(24):5Babalova E G,Kat
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