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1、大孔树脂分离纯化杜仲绿原酸的研究一、实验目的1.1 熟练掌握如何对大孔树脂进行预处理。1.2 了解大孔树脂对绿原酸的吸附效果。二、原理绿原酸(Chlorogenic acid)是由咖啡酸(Cafeic acid)与奎尼酸(Quinic acid)组成的缩酚酸，异名咖啡单宁酸，化学名：3一D-咖啡酰奎尼酸(3-0Cafeoylquinic acid)，分子式：C16H18O9，分子量：35430，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用I1 J。
2、它是许多中药材的有效成分之一，又是某些成药的质量指标。绿原酸应用非常广泛，主要为医药、日用化工和食品等行业。 绿原酸在各类植物中的存在相当普遍，但含量较高的植物并不多见。近年的研究表明，杜仲叶绿原酸含量丰富，可达1一5 。我国杜仲林种植广泛，每年可产杜仲叶几百万吨，这为提取绿原酸提供了充足的原料基础,因此,从杜仲叶中分离提取绿原酸具有重要的意义 大孔树脂具有选择性好、吸附量大、效率高、易洗脱、再生和成本低,特别适用于水溶性化合物的分离纯化等优点,在生物碱、皂甙、黄酮、多糖等的纯化中已有应用，并取得了显著的效果。大孔树脂种类较多,极性不同,吸附性能各异。本实验以以绿原酸为吸附质,分别采用静、动态
3、吸附和洗脱实验等方法考察了树脂对绿原酸的吸附性能,筛选出对绿原酸吸附、分离性能好的大孔树脂,并得出吸附洗脱的最佳工艺参数,为工业化分离提取绿原酸创造了条件。三、试剂与仪器3.1 材料与试剂： 绿原酸粗品；乙腈为色谱纯试剂，磷酸、甲醇、乙醇等试剂均为分析纯；NaOH固体，HCl溶液，聚酰胺树脂，大孔树脂，柠檬酸。3.2 主要仪器： 高效液相色谱仪，分析天平，10ml、25ml、50ml、100ml容量瓶，滴定管，1ml、2ml、5ml的移液管。，DZF-6050型真空干燥箱，恒温水浴振荡器，磨口三角瓶，培养皿，恒流泵，玻璃吸附柱6. 0 60 cm，铁架台，紫外分光光度仪，比色皿；擦镜纸；注射器
4、，烧杯，玻璃棒，洗耳球。漏斗，定性滤纸，标签纸。四、实验步骤4.1高效液相色谱所测的杜仲绿原酸粗品含量 准确称取绿原酸粗品1.153g置50 m L棕色容量瓶中,加60%甲醇适量,超声溶解并稀释至刻度,摇匀,准确移取0.5 m L置50m L棕色容量瓶中,用60%甲醇溶解并稀释至刻度,得绿原酸溶液备用。4.2树脂筛选 4.2.1树脂的预处理各种大孔树脂分别用去离子水溶胀、浮选24h后,在1 mol/L NaOH溶液中浸泡4h,用去离子水洗至中性; 然后在0. 5 mol/L HCl溶液中浸泡24 h, 用去离子水洗至中性; 再在70%的乙醇水溶液中浸泡24 h,不断搅拌,用去离子水洗至无白色浑
5、浊现象,无乙醇味后,用去离子水浸泡待用。将聚酰胺树脂用95%的乙醇溶液浸泡24 h用去离子水洗至无乙醇味后,再用4%的NaOH溶液浸泡24h,滤掉上层碱液，用去离子水洗至中性; 然后用4%的柠檬酸溶液浸泡24 h,再用去离子水洗至中性，用去离子水浸泡待用。4.2.2 各种树脂静态吸附性能比较选用7种树脂(NKA-、NKA-9、FL-1、S-8、FL-3、B2、聚酰胺)测定静态吸附量、吸附率并进行筛选。准确称取经预处理好的树脂2g,装入150 mL的磨口三角瓶中,准确加入100 ml的杜仲提取液,盖紧瓶塞,在(25 0. 5) 的恒温水浴振荡器上振摇24 h。充分吸附后过滤,测定吸附液中绿原酸的
6、浓度,按下式计算吸附量Q (mg/g)和吸附率E (% ) Q = (C0 Ce ) V /W, E = (C0 Ce ) / C0式中, C0 为吸附液中绿原酸的初始浓度(mg/mL) ; Ce 为吸附后绿原酸的剩余浓度(mg/mL) ; V为吸附液体积(mL) ;W 为树脂重量( g) 。4.2.3各种树脂静态脱附性能比较 7种树脂对绿原酸吸附完全后,一般可以使用甲醇、乙醇、丙酮等溶剂作为洗脱剂, 但丙酮易挥发、难回收,使工业化生产成本增加,所以通常选用甲醇作为洗脱剂。取上述吸附饱和的树脂，精密加入90ml 50%的甲醇溶液，在25-05下于恒温水浴振荡器上振荡24h，过滤，计算解吸率：解
7、吸率()=C1 V1【(Co 一Ce )V】 x 100式中：Cl表示解吸液中绿原酸的浓度(mgmL)； V1表示解吸液的体积(ml )；Co、Ce 、V意义同前。4.3树脂吸附、脱附的条件筛选出最佳树脂后，变换条件，得出其对吸附、脱附效果的影响。4.3.1不同pH值对吸附效果的影响 选用最佳树脂，在其他条件都相同，只有吸附液的pH不同的情况下，在pH为1、2、3、4、5、6、7时，判断不同pH值对吸附效果的影响，绘制相应的曲线，选出最佳pH值4.3.2不同浓度的洗脱剂对洗脱效果的影响 选用吸附完全的树脂，在其他条件都相同，只有洗脱液的浓度不同的情况下（20% 30% 40% 50% 60%
8、70% 80%），判断不同浓度的洗脱剂对洗脱效果的影响，绘制相应的曲线，选出效果最好的洗脱液浓度。4.4动态吸附、脱附实验取35g S-8树脂于玻璃吸附柱中，用70%的甲醇浓液浸没4h，取2g绿原酸粗品，超声溶解于3ml的水中，并移入玻璃吸附柱中，静置1-2h，使S-8树脂充分吸附绿原酸。用HL-2B数显恒流泵设置为1ml/min，分别抽20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的甲醇水溶液30ml于玻璃吸附柱中，并收集液体，每10ml于一容量瓶中，共27各容量瓶。用紫外测其吸光度A.画出不同浓度洗脱剂对洗脱效果的影响曲线五实验结果与分析5.1高效液相色谱所测的杜仲绿原酸粗
9、品含量 5.1.1杜仲绿原酸粗品的色谱图图1 绿原酸粗品的色谱图 5.1.2绿原酸粗品含量的计算液相测得结果:称粗品质量g峰面积稀释倍数液相测得含量ug/ml测得粗品含量1.15310064.308227.88%表1计算过程如下：绿原酸粗品的高效液相色谱检测图y=。由标准曲线y=31742x-可计算出分离出绿原酸浓度：x=64.3082ug/ml则粗品含量：W%=(64.30821005010-6)/1.153100%=27.88%52树脂筛选结果5.2.1各种树脂的静态吸附、脱附性能用紫外分光光度仪进行定量测量，可得，随着震荡的进行，各种树脂吸附、脱附时的吸光度变化如下列表3、表4所示表3
10、吸附时各树脂吸光度的变化种类时间NKA-NKA-9S-8B2FL-1FL-3聚酰胺10.73490.76950.53410.59040.62370.73610.955220.66910.67880.50820.60700.54720.62940.934430.69610.68270.50470.57460.54720.60920.943040.69180.69270.49850.47920.57440.59920.960150.67570.71040.48050.60480.56830.69590.969460.68800.69000.48250.61810.59390.66230.96537
11、0.68650.68290.48000.60920.56410.60030.9763: ：230.68380.68230.47780.51690.56220.65150.6771240.67360.70000.47790.52370.62520.66690.6067表4 脱附时各树脂吸光度的变化种类时间NKA-NKA-9S-8B2FL-1FL-3聚酰胺10.82300.29200.44240.31000.37220.49990.225120.89100.26400.44160.29580.38760.45210.222030.98130.26190.44230.30510.38810.4408
12、0.230440.93510.26110.43120.29610.38190.46850.251350.97100.26920.43080.27840.38560.47790.230560.95310.24990.42360.29000.39100.44160.234670.86040.24910.45340.27210.37870.41540.2445：230.75840.24000.38910.28510.33160.38260.2497240.77650.24010.46390.27710.35320.38510.2502从中选取NKA-树脂为例，计算吸附量、吸附率与解析率由以上实验可知
13、：以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出相应的回归方程为：y=0.0461x+0.0089 测得绿原酸原液的吸光度为：y=0.9100.代人回归方程：y=0.0461x+0.0089 可得19.5466ug/ml。因稀释500倍，即Co=19.5466*500=9.7733mg/ml测得经NKA-树脂吸附后的吸光度为：y=0.6736. 代人回归方程：y=0.0461x+0.0089 可得14.4187ug/ml。因稀释500倍，即Ce=14.4187*500=7.2093mg/ml测得经NKA-树脂脱附后的吸光度为：y=0.7765. 代人回归方程：y=0.046
14、1x+0.0089 可得16.6508ug/ml。因稀释100倍，即C1=16.6508*100=1.6651mg/ml吸附液体积为V=100ml脱附液体积为V=90mlNKA-树脂的重量为:W=2.0023g所以：吸附量Q=(9.7733-7.2093)*100/2.0023=128.0527mg/g 吸附率E=(9.7733-7.2093)/9.7733*100%=26.23% 解析率=1.6651*90/(9.7733-7.2093)*100*100%=58045%各树脂都如此计算，可得出下表5表5不同极性树脂的静态吸附、脱附性能树脂种类极性吸附容量/mg/g吸附率/%解析率%NKA-强
15、极性128.052726.3358.45NKA-9强极性113.533723.3019.82S-8强极性234.219651.0318.95B2中极性209.019742.2912.50FL-1中极性154.013831.6121.76FL-3中极性131.357126.9827.86聚酰胺非极性163.735033.6614.32综合考虑吸附、脱附效果。本文选用S-8树脂作为最佳吸附树脂5.2.2由紫外所测的S-8树脂对绿原酸静态吸附动力学曲线S-8树脂随时间的变化对绿原酸的吸附所得的吸光度相关关系如下表6所示表6时间h1234567吸光度A0.53410.50820.50470.49850
16、.48050.47280.4779 S-8 树脂的静态吸附动力学曲线如下图2所示 图2 树脂S-8的静态吸附动力学曲线由图可以看出，S-8树脂对绿原酸的吸附为快速平衡型，在5h内基本达到平衡。 5.2.3 用高效液相色谱测最佳吸附树脂S-8树脂的吸附、脱附色谱图如图3、图4所示：图3 S-8树脂的吸附色谱图图4 S-8树脂的脱附色谱图5.3 静态吸附、脱附实验结果5.3.1 不同pH值对吸附效果的影响53.1.1 最佳pH值的选取在不同pH值下进行吸附实验，由下表7可以看出，绿原酸在酸性条件下易被吸附，因为在酸性条件下，绿原酸以分子形式存在，疏水性增强，树脂对其吸附增强。但是酸性也不能过大，否
17、者吸附率反而会下降。碱性条件下，以离子形式存在的绿原酸不易被吸附。表7 不同pH值对吸附效果的影响pH值 吸光度A 吸附容量/mg/g 吸附率/% pH=1 0.5385 201.2982 41.25 pH=2 0.4059 273.2197 55.94 pH=3 0.4982 223.0858 45.70 pH=4 0.5792 179.2287 36.71 pH=5 0.6617 134.5222 27.55 pH=6 0.7680 76.9281 15.76 pH=7 0.8728 0.2013 4.129 其计算过程如4.3.1因而，可画出图形（图5）如下： 图5 不同pH值对吸附效果
18、的影响由图9可以看出，当pH值取23时的吸附率较大，但随着pH值的增大，吸附率渐渐减小。碱性时，绿原酸基本不被吸附。因此,吸附液的pH值应取23较为适宜。5.3.1.2 最佳pH的液相色谱图当pH=2时的液相色谱图如下图6所示图65.3.2不同浓度洗脱剂对洗脱效果的影响5. 3. 2. 1洗脱剂浓度的选择用不同浓度的甲醇洗脱绿原酸，得出数据可列下表8表 8不同浓度洗脱剂对洗脱效果的影响洗脱剂浓度%20304050607080解析率%16.8817.5818.0919.1521.8725.1125.815.3.2.2洗脱曲线的绘制（图7）图7图7为不同浓度洗脱剂对解析率的影响。S-8树脂是一种强
19、极性大孔吸附树脂，根据相似相溶原理，如图所示,洗脱剂的浓度越高,回收率越高,但当洗脱剂浓度超过70%以后,绿原酸已基本洗脱完全,再增大浓度对回收率影响不大,综合考虑成本等因素,选用浓度为70%的甲醇作洗脱剂为宜。5.3.2.3最佳洗脱剂浓度的液相色谱图(图8)图85.4动态吸附、脱附实验结果5.4.1由紫外所测的不同浓度洗脱剂对洗脱效果的影响其洗脱液甲醇的浓度与吸光度A的关系如表9所示：表9 动态吸附的不同浓度洗脱剂对洗脱效果的影响洗脱液甲醇的浓度%2030405060708090吸光度A10.25050.29520.42110.82061.51991.60731.16300.7075O.39
20、0020.25180.35600.43860.95861.63261.32510.96260.55290.348230.29300.36790.50751.30621.78771.32140.87770.51300.3015其曲线如下图9所示：图9可知，当洗脱剂的浓度为70%左右时的洗脱效果最好5.4.2 动态时洗脱剂的浓度为70%左右时的脱附色谱图色谱图如图10所示 图105.5.3动态洗脱效果最好时，绿原酸含量的计算由图9可知，当洗脱剂的浓度为70%左右时的洗脱效果最好，其色谱图如图10所示，其中绿原酸含量的计算如下：液相测得结果:称粗品质量g峰面积稀释倍数液相测得含量ug/ml测得粗品含
21、量0.0426515018.490565.03%表10计算过程如下：绿原酸粗品的高效液相色谱检测图y=。由标准曲线y=31742x 90可计算出分离出绿原酸浓度：x=18.4905ug/ml则粗品含量：W%=(18.49051501010-6)/0.04265100%=65.03%六 总结由以上实验可知用大孔树脂分离纯化杜仲绿原酸效果最好的大孔树脂为：S-8树脂；最佳pH值为：23较为适宜;最佳洗脱剂浓度为：70%的甲醇；以此为最佳条件做动态实验，分离纯化杜仲绿原酸可得出：分离后绿原酸含量%粗品含量%含量提高%65.0327.8837.15可知：S-8树脂可作为一种比较理想的绿原酸吸附剂，所得的绿原酸粗产品的含量达到65.03%