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1、黄瓜总 DNA 的提取及鉴定黄瓜总 DNA 的提取及鉴定摘要:植物 DNA 首先要在液氮或干冰中将新鲜或冷冻的植物组织研磨成粉，使细胞壁破碎，再用含有去污剂、螯合 EDTA 等成分的提取缓冲液处理组织匀浆。用氯仿-异戊醇把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将 DNA 与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开；再用 RNaseA 去除核酸中的 RNA,剩下的便是 DNA。DNA 可用乙醇或异丙醇沉淀，沉淀的DNA 可用挑取或离心方法收集。DNA 的纯度可用紫外分光光度计做初略测量。核酸、蛋白质、盐与小分子的最大吸收峰值分别为 260nm、280nm 及 230nm。顺序测定一个样品在这三种波长下的 OD 值
2、，如果提取的样品较纯，蛋白质及小分子的污染较小，则 OD260/OD2801.8，OD260/OD2302.0。通过测定 OD260，根据公式50OD260 DNA（双链）的浓度（ug/mL)。DNA 的完整性可用凝胶电泳来测定。常用的凝胶有聚丙烯酰胺与琼脂糖。琼脂糖电泳可分理相差 100bp 的 DNA 片段，但分离范围大，制备简单。方法：植物组织（削皮的黄瓜）在液氮中研磨，磨好的组织溶于 65CTAB 提取缓冲液中，保温一段时间后用酚-氯仿抽取 2 次，除去变性的蛋白及大部分碳水化合物。再用乙醇将 DNA 沉淀下来。获得的 DNA 用紫外分光光度计测定浓度及纯度，再用琼脂糖凝胶电泳检测完整
3、性。1.关键词：DNA，提取及鉴定2.实验材料与方法1/7黄瓜总 DNA 的提取及鉴定1.1 实验材料黄瓜1.1.1 试剂液氮；CTAB提取缓冲液；TE 缓冲液或重蒸水；酚：氯仿：异戊醇=25：24:1；异丙醇或无水乙醇；TE 缓冲液，重蒸水；0.3%(m/V）标准琼脂糖；0.5TBE 缓冲液，上样缓冲液；EB；1.1.2 器具研钵，小药勺；1.5mL 小离心管若干；定量移液器及枪头；离心机；恒温水浴锅；紫外分光光度计；水平电泳槽；2/7黄瓜总 DNA 的提取及鉴定三角瓶（500 或 1000mL)；微波炉或沸水浴，透射紫外灯3/7黄瓜总 DNA 的提取及鉴定1.1.3 生物材料黄瓜1.2 试
4、验方法1.2.1 提取 DNA1.CTAB于 65，水浴 30min。2.称取 8g(黄瓜去皮）研磨破碎细胞壁。3.加 20molCTAB于研磨中混匀酚浆，2 支离心管于 65水浴 15min，3500Hpm，5min 去除残渣。4.取上清液 5mL 于离心管中，加入 5mL 氯仿-异戊醇上下颠倒混合2min5.上清液转移至小烧杯中加 2 倍体积预冷的乙醇，观察纤维状沉淀。转移 10mol 离心管中，4水箱保存备用1.2.2DNA 浓度及纯度的测定1.将提取的 DNA 粗产物离心 3500rmp，10min。2.弃上清液，加约 5mL70%乙醇吹打洗涤，使沉淀悬浮。3.3500rmp,10mi
5、n 使 DNA 沉淀。4.弃上清，2 支离心管：一支加 5mL 氯化钠水溶液溶解；另一支 4保存下次备用5.用氯化钠作对照基线校正后沉淀 220-350nm 的光谱图。6.用氯化钠作空白对照，测定 OD260、OD280、OD230。3/7黄瓜总 DNA 的提取及鉴定1.2.3 琼脂糖凝胶电泳1.制胶：称取 0.25g 琼脂糖溶解在 25mL1TBE 中微波炉加热，微沸 3次冷却至 60倒胶。2.点样：待胶冷却凝固后，将DNA 样品加 2mlddH2O 溶解，取 10ml与 3mlloadingbuffe 混合，并用移液枪小心加入至样品槽中3.电泳：点样端放在负极。120V，40min凝胶成像
6、，EB 染胶 10min，流水 5min，凝胶成像在系统下观察。2.结果与分析2.1 提取 DNA提取出黄瓜的 DNA。2.2DNA 浓度及纯度的测定1.记录 220-350nm 时的光谱图2.计算OD260/OD280，OD260/OD230，分析 DNA 的纯度OD260=DNA 的浓度=50OD260稀释倍数=波长换成 280nm 及 230nm,用同一样品再次测 OD 的值：OD280=；OD230=OD260/OD280=；OD260/OD230=则提取 DNA 的纯度2.3 琼脂糖凝胶电泳4/7黄瓜总 DNA 的提取及鉴定观察并分析 DNA 的电泳图像从图中可以看出，如果基因组 D
7、NA 完整，应该仅出现一条主带；如果很多条深浅不一的带，则说明 DNA 已经降解；如果背景模糊，说明在 DNA 样品中混杂有 RNA；3.1 提取 DNACTAB提取液中各试剂分别的作用？1.细胞膜裂解，使 DNA 释放到提取缓冲液中，同时使组织匀浆中的蛋白质变性；缓冲液中的-疏基乙醇，-疏基乙醇抑制从组织匀浆释放的多酚氧化，防止植物组织黄褐变。3.3 琼脂糖凝胶电泳影响 DNA 电泳速率有哪些因素？5/7黄瓜总 DNA 的提取及鉴定1.DNA 片段的长度；2.DNA 的构象；3.琼脂糖的浓度；4.电压电泳的原理：带电物质在电场中向着与共电荷相反的电极移动 DNA分子在高于 PI 的溶液中带负电荷在电场中向阳极移动。琼脂糖的作用：使 DNA 分离开琼脂糖凝胶的口径越大，能被分离的DNA 越大。6/7