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1、重庆医科大学博士学位论文一次性电化学酒精生物传感器的研究姓名：罗鹏申请学位级别：博士专业：临床检验诊断学指导教师：宋方洲;谢国明20090401重庆医科大学博士研究生学位论文地应用于临床诊断、食品工业、环境监测等领域。以酶作为分子识别器件的电化学生物传感器称为酶电极。酶电极是由一个固定化的酶敏感膜和与之密切结合的电极组成的换能系统，它把固化酶和电极结合在一起。要使酶作为电化学生物传感器的敏感膜使用，必须将酶固定在电极表面，即在电极表面覆盖一层敏感膜。在固定过程中，既要保持酶本身固有的特性，又要避免自由酶应用上的缺陷。因此酶的固定化技术决定着酶电极的稳定性、选择性和灵敏度等主要性能。丝网印刷是印
2、刷业的一项传统工艺，有悠久的历史。2 0 世纪6 0年代以后广泛用于电子工业生产，作为制作电路板的主要工序。1 9 8 1年，一项专利文献报道将丝网印刷技术用于厚膜电化学传感器的制作。丝网印刷技术主要优点包括：可以在表面印制各种图案，设计十分灵活；印刷过程容易实现自动化；重现性好；适用于各种材质；成本低廉，因此能够大批量生产重现性好的生物传感器。由于传感器成本很低，可以一次性使用，即所谓“用过即扔，对临床检验非常方便。本研究将电化学酶传感器、纳米技术、丝网印刷技术、临床检验分析技术结合起来制备一次性酒精生物传感器，探讨了p H、缓冲液、温度、干扰物等对传感器响应电流的影响，并用于实际样品酒精浓
3、度检测，表现出了良好的特异性、敏感性、重复性、稳定性，而且响应时间快、线性范围宽，为医学实验室和交通执法部门提供了一种快速检测血酒精浓度的参考。弓重庆医科大学博士研究生学位论文本研究主要分为以下两个部分：1 基于交联法固定酶的丝网印刷电极(s c r e e n-p r i n t e de l e c t r o d e，S P E)酒精生物传感器的制备。方法：1)丝网印刷电极的制备：在0 2 m m 厚的聚氯乙烯(p o l y v i n y lc h l o r i d e，P V C)薄膜上首先印刷一层导电银膜，再用碳浆印刷直径为3 m m 的圆盘作为工作电极，然后用P V C 油墨
4、印刷在导电银膜上作为绝缘层。2)N a t i o n-M B 修饰电极的制备：丝网印刷电极在室温下依次用乙醇和超纯水超声清洗1 0 m i n，然后在空气中晾干。将5(w w)N a t i o n-1 1 7 溶液用无水乙醇稀释到1(w w)，然后吸取5 止1 的N a t i o n-乙醇溶液滴加在丝网印刷电极的工作区域，在空气中干燥，待电极表面干燥后形成一层N a t i o n 膜。然后将N a t i o n 修饰的丝网印刷电极置于含l m m o l L 麦尔多拉蓝(M e l d o l a Sb l u e，M B)的磷酸盐缓冲液(p h o s p h a t eb u f
5、 f e rs o l u t i o n,P B S)(0。l m o l L，p H 8 O)中用循环伏安法以5 0 m W s 的扫描速度进行循环伏安扫描，使M B 通过离子交换固定到N a t i o n 膜中。3)酒精生物传感器的制备：把4 m g 乙醇脱氢酶(A l c o h o lD e h y d r o g e n a s e，A D 竭、5 r a gN A D 十(N i c o t i n a m i d eA d e n i n eD i n u c l e o t i d e)、lO m g 牛血清白蛋白(b o v i n es e r u ma l b u m
6、 i n，B S A)溶于2 0 0 此磷酸盐缓冲液(O 1 m o l L，p H 8 O)中，再加入2 0 肛2 5 戊二醛溶液充分混合；再吸取5 止此溶液滴加到已制备好的N a t i o n-M B 修饰丝网印刷碳电极(s c r e e n-p r i n t e dc a r b o ne l e c t r o d e，S P C E)I 作区域，在空气中干燥，溶剂蒸发后形成一层酶膜，制成酒精生物传感器。制成的酒精生物传感器在使用前被置于4 C 冰箱保存。结果：所有测试均在电化学工作站中三电极系统下完成，饱和甘汞电极(s a t u r a t e dc a l o m e l4
7、重庆医科大学博士研究生学位论文e l e c t r o d e，S C E)作为参比电极，铂丝作为对电极，N a t i o n M B 一酶修饰丝网印刷电极作为工作电极。该传感器在2 5。C 时，以0 1 7 V(v s S C E)作为工作电位，在p H 为8 0 的磷酸盐缓冲液中响应电流达到最大。传感器检出限为1 1 x 1 0 一m o l L，达到9 5 稳态响应时间不超过3 0 S。用同一支生物传感器对含l m m o l L 的酒精的磷酸盐缓冲液(p H 8 0)重复测定lO 次，相对标准偏差(r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t
8、i o n,R S D)为3 6。在5个批次印制的丝网印刷电极中随机抽样5 个电极制成酒精生物传感器，分别对含l m m o l L 的酒精的磷酸盐缓冲液(p H 8 O)重复测定3 次取其平均值，相对标准偏差为4 3。酒精生物传感器于4 C 冰箱放置l O、2 0、3 0 天后，对相同浓度的底物响应电流分别减少了3 7、5 2、8 4。甲醇、糖、乳酸、抗坏血酸等均不会影响生物传感器对酒精的响应。结论：该酒精生物传感器可以快速检测酒精浓度，表现出良好的特异性、重复性、准确性、稳定性和抗干扰能力，可以为实验室检测酒精浓度提供一个参考。2 基于N a t i o n 和纳米金(g o l dn a
9、 n o p a r t i c l e s，G N P s)定酶的丝网印刷电极酒精生物传感器的制备。方法：1)纳米金的制备：取一定量的氯金酸溶液加热至沸，迅速加入柠檬酸钠溶液还原。所制备的溶液置于棕色瓶内于4 C 保存。纳米金溶胶的颜色为亮红色，其粒径可用透射电子显微镜测试约为2 0 n m。2)M B 修饰的丝网印刷电极的制备：用聚酯作为生物传感器的基质材料，在聚酯上首先印刷一层导电银膜，再用混合 2(w w)M B 的碳浆印刷直径为3 m m 的圆盘作为工作电极，然后印,昂U u v 胶作为绝缘层。银浆和碳浆印刷后，电极在4 0。C 干燥2 h 以除去气重庆医科大学博士研究生学位论文所应
10、用油墨中的水分。U v 胶印刷后需进行U V 固化。3)酒精生物传感器的制备：M B 修饰的丝网印刷电极在室温下依次用无水乙醇和超纯水超声清洗1 0 m i n，然后在空气中晾干。把4 m gA D H、5 m gN A D+溶于2 0 0 皿磷酸盐缓冲液(0 1 m o l L，p H 8 o)中配成酶液。再把1 0 0 肛酶液幂1 1 0 0 9 L5(w w)N a t i o n 溶液充分混合。然后1 0 0 此纳米金溶液被加入以上溶液并充分混合。接着1 0 皿混合溶液被滴加到M B 修饰丝网印刷电极的工作区域，在空气中干燥，溶剂蒸发后形成一层酶膜，制成酒精生物传感器。制成的酒精生物传
11、感器在使用前被置于4 冰箱保存。结果：所有测试均在电化学工作站中三电极系统下完成，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，M B 酶-N a f i o n-G N P s 修饰丝网印刷电极作为工作电极。该传感器在2 56 C 时，以0 0 V(v s S C E)作为工作电位，在p H 为8 0 的磷酸盐缓冲液中响应电流达到最大。传感器检出限为1 6 x 1 0 5 m o l L，检测上限达到了8 m m o l L，达到9 5 稳态响应时间不超过4 0 S。用同一个生物传感器在1 天内对两个不同的酒精浓度(1 和5 m m o l L)分别连续检测1 0 次，相对标准偏差为5 4 9
12、和1 4 4。从1 0 批丝网印刷电极中随机抽取1 0 支电极制成酒精生物传感器，然后用这1 0支不同的生物传感器分别对两个不同的酒精浓度(1 和5 r e t o o l L)进行检测，相对标准偏差为6。9 8 和2 4 9。酒精生物传感器于4 冰箱放置l O、2 0、3 0 天后，对l m m o l L 酒精响应电流分别减少了3 1、4 6、7。7。甲醇、糖、乳酸、抗坏血酸等均不会影响生物传感器对酒精的响应。结论：该酒精生物传感器可以快速检测血酒精浓度，表现出良好的特异性、重复性、准确性、稳定性和抗干扰能力，可以为实验室检测血6重庆医科大学博士研究生学位论文酒精浓度提供一个参考。关键词酒
13、精传感器，丝网印刷电极，麦尔多拉蓝，纳米金，N a t i o n7重庆医科大学博士研究生学位论文AD I S P O S A B L EB 1 0 S E N S O RB A S E DO NS C R E E N P R I N T E DE L E C T R O D EA B S T R A C TB l o o da l c o h o ld e t e r m i n a t i o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ef o r e n s i cm e d i c i n ea n dl a b o r a t o r y
14、m e d i c i n ef o rs e v e r a lr e a s o n s F i r s td r u n kd r i v i n gi sav e r ys e r i o u sp r o b l e mi nt h em o d e r nw o r l d，w h i c hr e s u l t si nl o t so ff a t a la c c i d e n t se v e r yy e a r B l o o da l c o h o lc o n c e n t r a t i o n(B A C)v a l u e ss e r v e da
15、st h e g o l ds t a n d a r d i nw h i c hd r i v e r sw e r er e c o g n i z e da sd r u n kd r i v i n gb yp o l i c eo f f i c e r s I ti sa l s on e c e s s a r yf o rc l i n i c a ll a b o r a t o r i e st od e t e c tt h ea c u t ea l c o h o l i s ma n ds o m es y n d r o m e sr e l a t e da
16、l c o h o la b u s e，N o w a d a y s，m a n ym e t h o d sh a v eb e e nu s e df o ra l c o h o lm e a s u r e m e n t，s u c ha ss p e c t r o m e t r i ca n dc h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i so rb r e a t h a l y z e rw h e r et h ea l c o h o lc o n c e n t r a t i o no rr e f r a c t i v
17、 i t yW a sd e t e c t e d H o w e v e r,t h e s em e t h o d sa r et i m ec o n s u m i n ga n dc o m p l e xt op e r f o r ml a b o r i o u ss a m p l ep r e t r e a t m e n t I na d d i t i o n,t h ee x p e n s i v ea n a l y t i c a la p p a r a t u si sn e c e s s a r y T h u s，t h e r ei sa ni
18、 n c r e a s i n gr e q u i r e m e n tf o rr a p i d，a c c u r a t ea n di n e x p e n s i v em e t l l o d sf o ra l c o h o ld e t e r m i n a t i o n T h ed i s p o s a b l ea m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rs h o u l db er e a d i l ya p p l i c a b l et oa l c o h o ld e t e r m i n a t
19、i o n，s i n c eb i o s e n s o r sh a v es u c hf a v o r a b l ea n a l y t i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa sp o r t a b i l i t y,l o wc o s ta n dp o t e n t i a lf o rf a b r i c a t i o n S e v e r a l8重庆医科大学博士研究生学位论文a l c o h o lb i o s e n s o r sh a v eb e e nr e p o r t e dt oc o n t
20、r o lt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s si nt h ef o o da n db e v e r a g e si n d u s t r i e s，b a s e do ni m m o b i l i z a t i o no fA l c o h o lO x i d a s e(A O D)o rA l c o h o lD e h y d r o g e n a s e(A D r r)I na nA O D b a s e db i o s e n s o r,0 2c o n s u m p t i o no rH 2 0
21、2p r o d u c t i o ni sd e t e r m i n e d H o w e v e r,t h i sk i n do fb i o s e n s o ri so x y g e nd e p e n d e n ta n dl o ws e l e c t i v i t yf o ra l c o h 0 1 C o n c e r n i n gA D H-b a s e db i o s e n s o r,i ti sp o s s i b l et od i r e c t l yd e t e c tr e d u c e df o r mo fN i
22、 c o t i n a m i d eA d e n i n eD i n u c l e o t i df N a D I-I)p r o d u c e di nt h ee n z y m a t i cr e a c t i o no fa l c o h o lw i t hN i c o t i n a m i d eA d e n i n eD i n u c l e o t i d ef N A D 3u n d e rc a t a l y s i so fA D H H o w e v e r,t h ee l e c t r o c h e m i c a lo x i
23、 d a t i o no fN A D Hi n v o l v e st h eu s eo fah i 曲o v e r p o t e n t i a la tw h i c haf e wo x i d i z a b l es u b s t a n c e si nt h er e a ls a m p l e sw o u l db eo x i d i z e d,t h u si n c r e a s i n gt h el i k e l i h o o do fi n t e r f e r e n c e s F o rt h i sp u r p o s em a
24、 n ye l e c t r o nt r a n s f e rm e d i a t o r sh a v eb e e nu s e df o re l e c t r o c h e m i c a lo x i d a t i o no fN A D H,w h i c hc o u l db ed e t e c t e da tal o wo x i d i z i n gp o t e n t i a l A m o n gt h e m,M e l d o l a SB l u e m)s h o w ss o m eo ft h em o s tp r o m i s i
25、 n gc h a r a c t e r i s t i c s H o w e v e r,i th a sb e e nf o u n dt h a tM Bc o u l dn o tb ea b s o r b e ds t a b l yo nt h ee l e c t r o d e，m e a n i n gt h a tt h ee l e c t r o d ei su n s t a b l ef o rp r a c t i c a la p p l i c a t i o n s T oi m p r o v eM Ba t t a c h m e n tt ot
26、h ee l e c t r o d e，af e wm e t h o d sh a v eb e e nu s e d H o w e v e r,t h e s em e t h o d sa r ec o m p l i c a t e d N a t i o n，ak i n do f i o ne x c h a n g e r,C a na b s o r bM Bt h r o u g hi o ne x c h a n g e S c r e e np r i n t i n gt e c h n o l o g y,d u et oi t sl o wc o s ta n
27、dm a s sp r o d u c t i o n,i sav e r s a t i l et o o lf o r t h ei n e x p e n s i v e，e a s ya n dh i g h l yr e p r o d u c i b l e9重庆医科大学博士研究生学位论文p r o d u c t i o no fd i s p o s a b l eb i o s e n s o r s U pt on o w,m o s to fd i s p o s a b l eb i o s e n s o r sb a s e do ns c r e e np r i
28、 n t i n gt e c h n o l o g ya r ea p p l i e di nt h ef o r e n s i cm e d i c i n ea n dl a b o r a t o r yd i a g n o s i s，s i n c ei tc o u l dr e s o l v es u c hc r i t i c a lp r o b l e m sa sl o wc o s t，f a s tr e s p o n s ea n dp o r t a b i l i t y T h i sp a p e rd e s c r i b e st h
29、ed e v e l o p m e n to fd i s p o s a b l ea l c o h o lb i o s e n s o rb a s e do ns c r e e n-p r i n t e de l e c t r o d e(S P E)。T h eb i o s e n s o rr e s p o n s ef o ra l c o h o li si n v e s t i g a t e di nt e r m so fp H，b u f f e rs o l u t i o n，t e m p e r a t u r ea n ds o m ei n
30、t e r f e r e n t s I tp r e s e n t st h eg o o ds p e c i f i c i t y,r e p r o d u c i b i l i t y,s t a b i l i t y,a c c u r a c ya n dp r o v i d e saf a s tr e s p o n s e。T h eb i o s e n s o ri sa p p l i e df o rm e a s u r i n gs e r u ma l c o h o la n ds a t i s f a c t o r yr e s u l t
31、i so b t a i n e d O u rr e s e a r c hi sm a i n l yd i v i d e di n t ot w op a r t sa sf o l l o w s：1。D e v e l o p m e n to ft h ed i s p o s a b l ea l c o h o lb i o s e n s o rb a s e do nt h ec r o s s 1 i n k i n gm e t h o dt oi m m o b i l i z eA D Ha n dN A D+o nt h eN a t i o n M Bm o
32、d i f i e ds c r e e n-p r i n t e de l e c t r o d e M e t h o d s：1)P r e p a r a t i o no fs c r e e n p r i n t e de l e c t r o d e。Ap o l y v i n y lc h l o r i d ef P V C)f i l mi ss e l e c t e da st h es u p p o r to fS P E T h eb i o s e n s o rc o m p r i s e sa3-m md i a m e t e rw o r k
33、 i n ga r e a,t h ei n s u l a t i o nl a y e ra n da ne l e c t r i c a lc o n t a c ts i t e T h eb i o s e n s o r sa r ep r i n t e do n t ot h eP V Cs h e e t。T h ed i f f e r e n tl a y e r si n c l u d i n gs i l v e rc o n d u c t i n gb a s a lt r a c k,c a r b o nw o r k i n ga r e aa n di
34、 n s u l a t i o nl a y e ra r ep r i n t e do n ea f t e rt h eo t h e r A f t e re v e r ys t e pt h ef i l mi sl e f tt od r yf o r2h o u r si na no v e na t4 0 Ct od r i v eo f f t h es o l v e n t sf r o mt h ea p p l i e di n k 2)P r e p a r a t i o no fN a f i o n-M Bm o d i f i e de l e c t
35、r o d e T h eS P Ei su l t r a s o n i c a l l yc l e a n e dw i t he t h a n o la n d1 0重庆医科大学博士研究生学位论文u l t r a p u r ew a t e rf o r10m i nr e s p e c t i v e l y,a n dd r i e da tr o o mt e m p e r a t u r e A5(w w)N a t i o n 一117s o l u t i o ni sd i l u t e dt o1(w w)w i t ha b s o l u t ee t
36、 h a n 0 1 5 肛o f1(w w)N a t i o ni sd r o p p e do n t ot h eS P Ea n dd r i e da tr o o mt e m p e r a t u r e T h ep r e t r e a t e de l e c t r o d ei ss c a n n e db yc y c l i cv o l t a m m e t r yi nt h eO 1 m o lL 一(p H 8 O)p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n(P B S)w i t hl m m o l
37、L。1M Ba tr o o mt e m p e r a t u r e E v e n t u a l l y,aN a f i o n-M Bm o d i f i e de l e c t r o d ei sr e a d yf o ru s e 3)P r e p a r a t i o no fa l c o h o lb i o s e n s o r 4 m go fA D H、5 m go fN A D+a n d1 0 m go fB S Aa r ed i s s o l v e di n2 0 0 皿o f0 1m o lL。1P B S(p H 8 0)，t h e
38、 n2 0 肛o f2 5(w w)g l u t a r a l d e h y d es o l u t i o ni sa d d e dt ot h em i x e de n z y m es o l u t i o nw i t hv i g o r o u ss t i r r i n g 5 肛o ft h em i x e ds o l u t i o nd e s c r i b e da b o v ei sd r o p p e do n t ot h ew o r k i n ga r e ao ft h ee l e c t r o d ea n da l l o
39、w e dt od r yi na i r a tr o o mt e m p e r a t u r ef o r12h o u r s T h ea l c o h o lb i o s e n s o ri sp r e p a r e da n dk e p td r yi nar e f r i g e r a t o ra t4 C b e f o r eu s e R e s u l t s：A 1 1e l e c t r o c h e m i c a lm e a s u r e m e n t sa r ec a r r i e do u ti nac o n v e n
40、 t i o n a lt h r e ee l e c t r o d ec e l lw h i c hi sc o m p o s e do fs a t u r a t e dc a l o m e lr e f e r e n c ee l e c t r o d e(S C E)，ap l a t i n u mw i r ec o u n t e re l e c t r o d ea n dam o d i f i e dw o r k i n ge l e c t r o d e T h em a x i m u mr e s p o n s ec u r r e n tf
41、o ra l c o h o li so b t a i n e di nO 1 m o lL。1P B S(p H8 0)a tt h ew o r k i n gp o t e n t i a lo f 一0 17 V(V S S C E)，a t2 5。C T h ed e t e c t i o nl i m i to ft h eb i o s e n s o ri se s t i m a t e dt ob e1 1xl0 5 m o lL a l c o h o la tas i g n a lt on o i s er a t i o no f3 T h el i n e a
42、 rr e s p o n s er a n g eo ft h eb i o s e n s o rt oa l c o h o lC a l lb ee x t e n d e da tl e a s tt o5 m m o lL。T h eb i o s e n s o rr e s p o n s et i m ei sv e r ys h o r t，r e a c h i n g9 5 o ft h es t e a d y s t a t e1 l重庆医科大学博士研究生学位论文c u r r e n tw i t h i n3 0 s T h er e p r o d u c i
43、 b i l i t yo ft h e i d e n t i c a lb i o s e n s o ri se x a m i n e di n0 1m o lL P B S(p H 8 O)w i t h1m m o lL a l c o h o la tt h ew o r k i n gp o t e n t i a lo f O 17 V(v s，S C E)，a t2 5。C，T h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o ni s3 6 f o r10s u c c e s s i v ea s s a y s 5e l
44、 e c t r o d e sa r er a n d o m l ys e l e c t e df r o m5b a t c h e so fs c r e e n p r i n t e de l e c t r o d e st of a b r i c a t et h ea l c o h o lb i o s e n s o r si n d e p e n d e n t l y T h ea c c e p t a b l eb a t c hr e p r o d u c i b i l i t yw i t har e l a t i v es t a n d a r
45、 dd e v i a t i o no f4 3 i so b t a i n e d T h es t o r a g es t a b i l i t yo fb i o s e n s o rt o w a r dt h er e s p o n s ef o ra l c o h o li se x a m i n e da sw e l l A f t e rb e i n gs t o r e da t4 Cf o r1 0，2 0，3 0d a y s，t h er e s p o n s ec u r r e n td e c r e a s e db y3 7，5 2，8
46、4 o ft h ei n i t i a lr e s p o n s e，r e s p e c t i v e l y T h ee l e c t r o a c t i v es u b s t a n c e sc o m m o n l yp r e s e n ti nt h er e a ls a m p l e s，s u c ha sm e t h a n o l，g l u c o s e，l a c t i ca c i d，a s c o r b i ea c i d，a Uc a nn o ti n f l u e n c eo nt h eb i o s e n
47、 s o rr e s p o n s ef o ra l c o h 0 1 C o n c l u s i o n：T h eb i o s e n s o rp r e s e n t st h eg o o ds p e c i f i c i t y,r e p r o d u c i b i l i t y,s t a b i l i t y,a c c u r a c ya n dp r o v i d e saf a s tr e s p o n s e T h ep r o p o s e db i o s e n s o rm a yp r o v i d eau s e
48、f u ls c r e e n i n gp r o c e d u r ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa l c o h 0 1 2 D e v e l o p m e n to ft h ed i s p o s a b l ea l c o h o lb i o s e n s o rb a s e do nN a t i o nc o m b i n e dw i t hg o l dn a n o p a r t i c l e s(G：N P s)t oi m m o b i l i z eA D Ha n dN A D+o nt
49、h eM Bm o d i f i e ds c r e e n-p r i n t e de l e c t r o d e M e t h o d s：1)P r e p a r a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e s G o l dn a n o p a r t i c l e sa r ep r e p a r e db ya d d i n gs o d i u mc i t r a t es o l u t i o nt oab o i l i n gH A u C l 4a q u e o u ss o l u t i o n T
50、 h es o l u t i o ni ss t o r e di nb r o w ng l a s sb o t t l e sa t4 Cr e f r i g e r a t o r T h ea v e r a g ep a r t i c l ed i a m e t e ri s重庆医科大学博士研究生学位论文2 0 n ma sd e t e r m i n e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y 2)P r e p a r a t i o no fM Bm o d i f i e ds c