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1、关于分光光度法关于分光光度法(2)第1页，讲稿共43张，创作于星期日第一节第一节 概述概述p分光光度法是利用被测物质在特定波长处或一定分光光度法是利用被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的选择性吸收特性而建立的一种波长范围内对光的选择性吸收特性而建立的一种分析方法，属于光谱分析法。分析方法，属于光谱分析法。p分类：根据测定的光的波长分分类：根据测定的光的波长分 紫外分光光度法紫外分光光度法 可见分光光度法可见分光光度法 红外分光光度法红外分光光度法 p特点：灵敏度高，适用于微量或痕量组分的分析特点：灵敏度高，适用于微量或痕量组分的分析 操作简单、准确度较高、重现性好、应用范围广操作简单、准
2、确度较高、重现性好、应用范围广第2页，讲稿共43张，创作于星期日一、光的性质与波长范围一、光的性质与波长范围 p光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和粒子性。粒子性。p光在传播时表现了光的波动性光在传播时表现了光的波动性 一定的光波具有一定的波长一定的光波具有一定的波长、频率、频率、光速、光速c等参数等参数来描述：来描述：c=光的性质光的性质第3页，讲稿共43张，创作于星期日续前：续前：波长：相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位波长：相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位可用纳米（可用纳米（nmnm），微米（），微米（umum）表示：）表示：1n
3、m=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m频率（频率（）：是每秒内光波的振动次数，单位是赫）：是每秒内光波的振动次数，单位是赫兹（兹（Hz）第4页，讲稿共43张，创作于星期日续前续前p光又具有粒子性，是由一颗一颗不连续的光子构光又具有粒子性，是由一颗一颗不连续的光子构成的粒子流，这种粒子叫光子，是量子化的。光成的粒子流，这种粒子叫光子，是量子化的。光子的能量（子的能量（E）取决于频率，其关系为：）取决于频率，其关系为：E=h =h c/（h为普朗克常数：为普朗克常数：h=6.62610-34 JS)p可见：光的波长越短（频率越高），其能量越大。可见：光的波长越短（频率越高），其能
4、量越大。第5页，讲稿共43张，创作于星期日光的分类光的分类p单色光：仅含某一种波长的光单色光：仅含某一种波长的光 p复合光：不同波长的光组合而成复合光：不同波长的光组合而成。如白光。如白光。物质对光的吸收具有选择物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。呈吸收光的互补光。第6页，讲稿共43张，创作于星期日波长范围：波长范围：p 可见光区：可见光区：400-760 nm 复合光复合光p 紫外光区：近紫外区紫外光区：近紫外区200-400 nm 远紫外区远紫外区100-200 nm p 红外光区：红外光区：0.7
5、6500um 近红外区：近红外区：0.762.5um 中红外区：中红外区：2.550um 远红外区：远红外区：50500um第7页，讲稿共43张，创作于星期日二、分子吸收光谱的产生二、分子吸收光谱的产生p分子运动包括：分子运动包括：分子外层的价电子运动分子外层的价电子运动电子能级电子能级 分子内原子在平衡位置附近的振动分子内原子在平衡位置附近的振动振动能级振动能级 分子绕重心轴的转动分子绕重心轴的转动转动能级转动能级分子能量：电子能量、振动能量、转动能量之和分子能量：电子能量、振动能量、转动能量之和 E电电E振振E转转 高能级的运动中包括低能级的运动高能级的运动中包括低能级的运动 第8页，讲稿
6、共43张，创作于星期日续前续前p当用一定波长的光线照射试样时，其分子选择吸当用一定波长的光线照射试样时，其分子选择吸收了某些具有特定波长（或频率）的光子后，由收了某些具有特定波长（或频率）的光子后，由较低能级（基态）跃迁到较高能级（激发态）时，较低能级（基态）跃迁到较高能级（激发态）时，所吸收光子的能量正好等于跃迁前后的能级差。所吸收光子的能量正好等于跃迁前后的能级差。p把分子吸收能量随波长变化的情况记录下来所得把分子吸收能量随波长变化的情况记录下来所得的图谱为吸收光谱。的图谱为吸收光谱。p利用物质的吸收光谱进行定性、定量及结构分析利用物质的吸收光谱进行定性、定量及结构分析的方法称为吸收光谱法
7、，简称光谱法。的方法称为吸收光谱法，简称光谱法。第9页，讲稿共43张，创作于星期日三、光的吸收定律三、光的吸收定律（一）百分透光率（一）百分透光率（T）和吸收度（）和吸收度（A）入射光入射光 I0 吸收吸收Ia 透射透射It I0=Ia+It 透光率（描述入射光透过溶液的程度）透光率（描述入射光透过溶液的程度）T=It/I0 或或 T%=It/I0100%透光率的负对数称为吸光度，用符号透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。表示。吸光度吸光度 A=-lgT=lg I0/It A愈大，溶液对光的吸收愈多。愈大，溶液对光的吸收愈多。第10页，讲稿共43张，创作于星期日（二）朗伯（二）朗伯-比尔定
8、律比尔定律p当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液的温度等条件不变的液时，在单色光强度、溶液的温度等条件不变的情况下，溶液对光的吸收度与溶液的浓度及液层情况下，溶液对光的吸收度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。厚度的乘积成正比。A=lgT=ECL 朗伯朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气体比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气体和固体的非散射均匀体系。和固体的非散射均匀体系。第11页，讲稿共43张，创作于星期日（三）吸收系数（三）吸收系数吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸
9、收度。当溶液的浓度当溶液的浓度C的单位不同时，吸收系数的意义和表示方法也的单位不同时，吸收系数的意义和表示方法也不同，常用的表示方法有两种：不同，常用的表示方法有两种：1、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为，液层厚度为1cm时的吸收度，用时的吸收度，用表示。表示。2、百分吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为、百分吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为1%（g/ml），液层厚度为），液层厚度为1cm时的吸收度，时的吸收度，表表示。示。第12页，讲稿共43张，创作于星期日续前续前百分吸收系数与摩尔吸收系数之间的关系是：百
10、分吸收系数与摩尔吸收系数之间的关系是：吸收系数是物质的特性常数，表明物质对某一特定波吸收系数是物质的特性常数，表明物质对某一特定波长光的吸收能力。不同物质对同一波长的单色光有不长光的吸收能力。不同物质对同一波长的单色光有不同的吸收系数，吸收系数越大，表明吸光能力越强，同的吸收系数，吸收系数越大，表明吸光能力越强，灵敏度越高，所以吸收系数是物质定性和定量分析的灵敏度越高，所以吸收系数是物质定性和定量分析的依据。依据。第13页，讲稿共43张，创作于星期日四、吸收光谱四、吸收光谱p吸收光谱又称吸收曲线，是在浓度一定的条件下，吸收光谱又称吸收曲线，是在浓度一定的条件下，以波长（以波长（）或波数（）或波
11、数（）为横坐标，以吸收度）为横坐标，以吸收度（A）为纵坐标所描绘的曲线。）为纵坐标所描绘的曲线。吸收峰吸收峰 最大吸收波长最大吸收波长max 吸收谷吸收谷最小吸收波长最小吸收波长min 肩峰肩峰sh 末端吸收末端吸收第14页，讲稿共43张，创作于星期日续前续前pmax、min、sh及整个吸收光谱的形状取决于及整个吸收光谱的形状取决于物质的分子结构，可作为定性分析的依据。物质的分子结构，可作为定性分析的依据。p同一物质的吸收光谱应有相同的同一物质的吸收光谱应有相同的max、min、sh；而且在相同浓度时，同一物质的吸收曲线应；而且在相同浓度时，同一物质的吸收曲线应相互重合。相互重合。第15页，讲
12、稿共43张，创作于星期日第二节第二节 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法一、基本原理一、基本原理 物质分子受到紫外物质分子受到紫外-可见光的照射，选择吸收某些适宜能量可见光的照射，选择吸收某些适宜能量的光子后，其原子的外层电子（成键电子、未成键电子）的光子后，其原子的外层电子（成键电子、未成键电子）由基态跃迁至激发态，在相应波长的位置出现吸收所形成由基态跃迁至激发态，在相应波长的位置出现吸收所形成的光谱，称为紫外的光谱，称为紫外-可见吸收光谱。可见吸收光谱。适用范围：适用范围：p分子中含有芳环或共轭双键的有机药物，在紫外光区有特分子中含有芳环或共轭双键的有机药物，在紫外光区有特征吸收征吸收
13、p外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收p都可用紫外都可用紫外-可见分光光度法进行分析。可见分光光度法进行分析。第16页，讲稿共43张，创作于星期日仪器仪器 可见分光光度计721型分光光度计型分光光度计第17页，讲稿共43张，创作于星期日仪器仪器 紫外-可见分光光度计第18页，讲稿共43张，创作于星期日一、基本组成一、基本组成1.1.光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为可见光区：钨灯
14、作为光源，其辐射波长范围在光源，其辐射波长范围在3503501000 nm1000 nm。紫外区：氢、氘灯。紫外区：氢、氘灯。发射发射200200360 nm360 nm的连续的连续光谱。光谱。第19页，讲稿共43张，创作于星期日 2.2.单色器单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。的光学系统。入射狭缝：光源的光由此进入单色器；入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅色散元件：将
15、复合光分解成单色光；棱镜或光栅；聚焦装置：透镜或凹面聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。出射狭缝。第20页，讲稿共43张，创作于星期日3.样品室 样品室放置各种类型的吸收池（比色样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。英池，可见区一般用玻璃池。4.4.检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池的光利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光信号变成可
16、测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。电池、光电管或光电倍增管。5.5.结果显示记录系统结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理动控制和结果处理第21页，讲稿共43张，创作于星期日二、分光光度计的类型二、分光光度计的类型1.1.单光束单光束 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。的稳定性。2.2.双光束双光束 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、自动记录
17、，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。分析。仪器复杂，价格较高。第22页，讲稿共43张，创作于星期日3.双波长 将不同波长的两束单色光将不同波长的两束单色光(1 1、2 2)快速交替通过快速交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。=1 12nm2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。两波长同时扫描即可获得导数光谱。三种分光光度计的比较三种分光光度计的比较p721型分光光度计的使用型分光光度计的使用第23页，讲稿共
18、43张，创作于星期日第三节第三节 药物分析中含量测定和微量杂质的检查药物分析中含量测定和微量杂质的检查第24页，讲稿共43张，创作于星期日p紫外可见分光光度法是药物分析中的一种重要的紫外可见分光光度法是药物分析中的一种重要的方法，常用语药物鉴别、检查和方法，常用语药物鉴别、检查和含量测定含量测定第25页，讲稿共43张，创作于星期日（一）定性鉴别（一）定性鉴别 根据物质的吸收光谱特征，如吸收光谱的形状、根据物质的吸收光谱特征，如吸收光谱的形状、最大吸收波长、吸收峰数目、各吸收峰的位置，最大吸收波长、吸收峰数目、各吸收峰的位置，强度和相应的吸收系数等进行分析。强度和相应的吸收系数等进行分析。第26
19、页，讲稿共43张，创作于星期日1、比较光谱的一致性、比较光谱的一致性 p两个化合物相同，在相同的条件下测出的吸收光两个化合物相同，在相同的条件下测出的吸收光谱应完全相同。谱应完全相同。p具体做法：具体做法：（1）样品与标准品在完全相同的情况下，分别测出）样品与标准品在完全相同的情况下，分别测出吸收光谱，比较二者光谱是否一致吸收光谱，比较二者光谱是否一致（2）没有标准品，用标准光谱图对归照比较，二者）没有标准品，用标准光谱图对归照比较，二者吸收光谱一致，可初步断定是同一化合物。吸收光谱一致，可初步断定是同一化合物。p注意：结构完全相同的物质，其吸收光谱完全一注意：结构完全相同的物质，其吸收光谱完
20、全一致，但吸收光谱完全相同的物质却不一定是同一致，但吸收光谱完全相同的物质却不一定是同一物质。物质。第27页，讲稿共43张，创作于星期日2、比较吸收光谱特征数据的一致性、比较吸收光谱特征数据的一致性 p常用最大吸收波长和吸收系数常用最大吸收波长和吸收系数 p不同的化合物，可有相同的最大吸收波长，但因不同的化合物，可有相同的最大吸收波长，但因分子量不同，其百分吸收系数有明显的差异。分子量不同，其百分吸收系数有明显的差异。第28页，讲稿共43张，创作于星期日3、比较吸收度或吸收系数比值的一致性、比较吸收度或吸收系数比值的一致性 p适用于吸收峰较多的药物，各吸收峰对应的吸收适用于吸收峰较多的药物，各
21、吸收峰对应的吸收度或吸收系数的比值是一定的，可作为鉴别的标度或吸收系数的比值是一定的，可作为鉴别的标准。准。用分光光度法进行鉴别时的要求用分光光度法进行鉴别时的要求:仪器必须按要求严格校正合格后方可使用仪器必须按要求严格校正合格后方可使用 样品的纯度必须达到要求才能测定样品的纯度必须达到要求才能测定第29页，讲稿共43张，创作于星期日一、含量测定一、含量测定1、吸收系数法：、吸收系数法：（1）利用待测物质的吸收系数与测得的一定浓度时）利用待测物质的吸收系数与测得的一定浓度时的吸收度比较计算含量的方法，又称绝对法。的吸收度比较计算含量的方法，又称绝对法。根据朗伯根据朗伯-比尔定律比尔定律A=EC
22、L，得：，得：第30页，讲稿共43张，创作于星期日例例1p已知维生素已知维生素B12在在361nm处的处的E值是值是207，现测得维，现测得维生素生素B12水溶液的吸收度为水溶液的吸收度为0.414，吸收池厚度为，吸收池厚度为1cm，求该溶液的浓度。，求该溶液的浓度。p解：解：即该溶液的浓度为即该溶液的浓度为0.002%（g/ml），即），即100ml维生素维生素B12水溶液中含维生素水溶液中含维生素B120.002g。第31页，讲稿共43张，创作于星期日1、吸收系数法：、吸收系数法：p（2）按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的）按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光
23、度，再以该品种在规定条件下的标波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的标准溶液吸收系数计算含量。准溶液吸收系数计算含量。第32页，讲稿共43张，创作于星期日例例2p精密称取维生素精密称取维生素B12供试品供试品25.0mg，加水溶解并稀释制，加水溶解并稀释制成成1000ml，于，于1cm厚的吸收池中，在厚的吸收池中，在361nm处测得吸收处测得吸收度为度为0.507，按，按C68H88CoN14O14P的的 为为 207计算，求维计算，求维生素生素B12的含量百分比。的含量百分比。p解：解：第33页，讲稿共43张，创作于星期日2、标准曲线法、标准曲线法p是分光光度法中最经典的是分光光度法中
24、最经典的方法。方法。p特点：对仪器要求不高，特点：对仪器要求不高，是分光光度法中简便易是分光光度法中简便易行的方法。行的方法。第34页，讲稿共43张，创作于星期日步骤：步骤：p（1）标准系列标准系列：先用于待测物质组分相同的标准：先用于待测物质组分相同的标准品，配成一系列浓度不同的标准溶液，在相同条品，配成一系列浓度不同的标准溶液，在相同条件下，分别测定其吸收度。件下，分别测定其吸收度。p（2）绘制标准曲线绘制标准曲线：以浓度：以浓度C为横坐标，以相应为横坐标，以相应的吸收度的吸收度A为纵坐标，绘制为纵坐标，绘制A-C曲线，称为工作曲曲线，称为工作曲线。线。p（3）查找查找：在相同条件下，测出
25、供试品溶液的吸：在相同条件下，测出供试品溶液的吸收度，从标准曲线上便可查出与此吸收度值相应收度，从标准曲线上便可查出与此吸收度值相应的供试品溶液的浓度。的供试品溶液的浓度。第35页，讲稿共43张，创作于星期日注意事项：注意事项：p1、标准系列的数目应在四个伊桑、标准系列的数目应在四个伊桑p2、注明时间、测定项目和条件、注明时间、测定项目和条件p3、条件发生改变时，应重新绘制标准曲线、条件发生改变时，应重新绘制标准曲线第36页，讲稿共43张，创作于星期日3、对照品比较法、对照品比较法 p在相同条件下，配制标准对照品和供试品溶液，在选在相同条件下，配制标准对照品和供试品溶液，在选定的波长处分别测定
26、吸收度定的波长处分别测定吸收度A标标和和A供供。根据：根据：A标标=EC标标L A供供=EC供供L 标准对照品与供试品是同一种物质，在同一仪器、同标准对照品与供试品是同一种物质，在同一仪器、同一波长下测定，因此一波长下测定，因此L和和E相等。相等。第37页，讲稿共43张，创作于星期日例例3 p精密称取奥沙西泮供试品与对照品各精密称取奥沙西泮供试品与对照品各15mg，加乙醇溶解并稀释至，加乙醇溶解并稀释至200ml，再精密量取，再精密量取5ml，置，置100ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，在量瓶中，加乙醇稀释至刻度，在229nm波长处测定吸收度分别为：波长处测定吸收度分别为：A供供=0.462，A
27、标标=0.470，求奥沙，求奥沙西泮的含量。西泮的含量。p解：供试品与标准品在相同条件下配制与测定，解：供试品与标准品在相同条件下配制与测定，C标标=C原原第38页，讲稿共43张，创作于星期日续前续前 优点：对照法采用对照品与供试品平行操作的方优点：对照法采用对照品与供试品平行操作的方式，具有消除仪器与方法误差的优点，是中国药式，具有消除仪器与方法误差的优点，是中国药典中采用较多的方法。典中采用较多的方法。第39页，讲稿共43张，创作于星期日二、微量杂质的检查方法二、微量杂质的检查方法p杂质：任何影响药品纯度的物质均称杂质，可在杂质：任何影响药品纯度的物质均称杂质，可在生产中或运输中产生生产中
28、或运输中产生p杂质检查也叫纯度检查杂质检查也叫纯度检查p药物中微量杂质的检查方法较多用药物中微量杂质的检查方法较多用比色法比色法和和分光分光光度法光度法p 第40页，讲稿共43张，创作于星期日（一）、比色法（一）、比色法p常用来检查常用来检查无机杂质离子无机杂质离子。p应用：利用杂质离子与其他物质生成有色物质或应用：利用杂质离子与其他物质生成有色物质或生成难溶物使得溶液浑浊，再与标准品比较。生成难溶物使得溶液浑浊，再与标准品比较。p目视比色法是用眼睛辨别、比较供试品溶液与标目视比色法是用眼睛辨别、比较供试品溶液与标准溶液的颜色深浅，以确定被测物质的含是。准溶液的颜色深浅，以确定被测物质的含是。第41页，讲稿共43张，创作于星期日（二）纯度检查（二）纯度检查p药物的吸收光谱与所含杂质的吸收光谱有差异时，药物的吸收光谱与所含杂质的吸收光谱有差异时，可用紫外可用紫外-可见分光光度法检查杂质。可见分光光度法检查杂质。p检查对象：药物在紫外光区或可见光区无吸收而检查对象：药物在紫外光区或可见光区无吸收而杂质有吸收，或在杂质吸收峰处药物无吸收，则杂质有吸收，或在杂质吸收峰处药物无吸收，则杂质可被检查出来。杂质可被检查出来。p例如：肾上腺素中肾上腺酮的检查。例如：肾上腺素中肾上腺酮的检查。第42页，讲稿共43张，创作于星期日感谢大家观看12.10.2022第43页，讲稿共43张，创作于星期日