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1、关于兽用疫苗生产与检验技术关于兽用疫苗生产与检验技术第1页，讲稿共110张，创作于星期日 兽用生物制品系指用天然或人工改造的微生物兽用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（细菌、病毒、衣原体、钩端螺旋体等）及其代谢产物、（细菌、病毒、衣原体、钩端螺旋体等）及其代谢产物、寄生虫、动物血液或组织等为原材料，采用生物学、分寄生虫、动物血液或组织等为原材料，采用生物学、分子生物学或生物化学等相应技术制成的生物制剂，用于子生物学或生物化学等相应技术制成的生物制剂，用于预防、治疗或诊断畜禽疫病。预防、治疗或诊断畜禽疫病。1 1、按照性质和制造方法、按照性质和制造方法 疫（菌）苗、类毒素、抗血疫（菌）苗、类
2、毒素、抗血清、诊断制剂和微生态制剂等。清、诊断制剂和微生态制剂等。2 2、按照作用与用途、按照作用与用途 预防、诊断和治疗用生物制品。预防、诊断和治疗用生物制品。第2页，讲稿共110张，创作于星期日 将细菌、病毒、寄生虫等接种于特殊基质进行培养，将细菌、病毒、寄生虫等接种于特殊基质进行培养，收获其抗原单位或亚单位，或用人工合成的抗原单位或亚单位制备收获其抗原单位或亚单位，或用人工合成的抗原单位或亚单位制备而成的活的或灭活的、具有特异性和免疫原性的生物制品，用于预而成的活的或灭活的、具有特异性和免疫原性的生物制品，用于预防靶动物的疾病。防靶动物的疾病。预防用兽用生物制品包括：灭活疫苗、活疫苗、重
3、组亚单预防用兽用生物制品包括：灭活疫苗、活疫苗、重组亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重组活载体疫苗和核酸位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重组活载体疫苗和核酸（DNADNA）疫苗。）疫苗。第3页，讲稿共110张，创作于星期日 1)1)强毒强毒(菌菌)或弱毒（菌）或弱毒（菌）培养培养灭活灭活或加热或加热纯化或浓缩纯化或浓缩佐剂或防腐剂。佐剂或防腐剂。2)2)灭活的毒素或提取的亚单位或灭活的毒素或提取的亚单位或rDNArDNA产产生亚单位。生亚单位。灭活疫苗稳定、安全，便于运输和保灭活疫苗稳定、安全，便于运输和保存，易于提纯纯化和制备多价、多联苗。存，易于提纯纯化和制备多价、多联苗。但用量较
4、大、接种次数多、免疫力产生慢、但用量较大、接种次数多、免疫力产生慢、注射困难、注射局部可能有反应等。注射困难、注射局部可能有反应等。第4页，讲稿共110张，创作于星期日 1 1）致弱的弱毒（菌、虫）株）致弱的弱毒（菌、虫）株 动物、组动物、组织、细胞、鸡胚或培养基织、细胞、鸡胚或培养基培养培养降低毒力、降低毒力、保留免疫原性保留免疫原性筛选。筛选。2 2）自然弱（无）毒（菌、虫）株。）自然弱（无）毒（菌、虫）株。3 3）异种毒（菌、虫）株。）异种毒（菌、虫）株。4 4）基因工程改造弱毒株。）基因工程改造弱毒株。活疫苗对原宿主动物无致病性或引起活疫苗对原宿主动物无致病性或引起亚临床感染，能产生主
5、动免疫力，用量少、亚临床感染，能产生主动免疫力，用量少、成本低、免疫力产生快、免疫期长。但可成本低、免疫力产生快、免疫期长。但可能存在不安全风险能存在不安全风险。第5页，讲稿共110张，创作于星期日 1 1）微生物）微生物物理和化学方法物理和化学方法提取有效抗原成分。提取有效抗原成分。2 2）病原）病原基因工程技术基因工程技术保护性保护性抗原基因序列插入合适的表达质粒抗原基因序列插入合适的表达质粒高效稳定表达高效稳定表达生产抗原生产抗原亚单位亚单位疫苗。疫苗。第6页，讲稿共110张，创作于星期日用化学方法人工合成多肽作为抗原。纯用化学方法人工合成多肽作为抗原。纯度高、稳定，但只能线性表达，不能
6、折度高、稳定，但只能线性表达，不能折叠，免疫原性较差。叠，免疫原性较差。第7页，讲稿共110张，创作于星期日 病原体病原体基因工程方法基因工程方法缺失致病性缺失致病性基因或非必要糖蛋白基因或非必要糖蛋白保持免疫原性保持免疫原性降降低致病性。疫苗毒力不易恢复，稳定性低致病性。疫苗毒力不易恢复，稳定性好，可配合鉴别诊断方法，区别免疫动好，可配合鉴别诊断方法，区别免疫动物和自然感染动物。物和自然感染动物。第8页，讲稿共110张，创作于星期日病原保护性抗原基因序列病原保护性抗原基因序列插入另一种无插入另一种无毒或弱毒的微生物基因组毒或弱毒的微生物基因组表达表达构建构建重组活载体疫苗株。可以同时表达多种
7、抗重组活载体疫苗株。可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，毒力不返强。原，制成多价或多联疫苗，毒力不返强。第9页，讲稿共110张，创作于星期日 病原保护性抗原基因病原保护性抗原基因连接细菌连接细菌或病毒或病毒DNA DNA 直接导入动物体直接导入动物体表达表达抗原抗原诱导产生免疫保护。制造简便、诱导产生免疫保护。制造简便、成本低、安全、免疫期长、热稳定性好，成本低、安全、免疫期长、热稳定性好，但仍未商品化生产。但仍未商品化生产。第10页，讲稿共110张，创作于星期日1 1、常规免疫、常规免疫血清学诊断技术血清学诊断技术 （1 1）凝集试验抗原：）凝集试验抗原：直接凝集试验（平板法、试管法）
8、：抗原和抗直接凝集试验（平板法、试管法）：抗原和抗体混合后直接发生凝集反应。体混合后直接发生凝集反应。间接凝集试验（间接凝集试验（间接血凝、胶乳凝集和反相间接间接血凝、胶乳凝集和反相间接血凝试验血凝试验）。）。第11页，讲稿共110张，创作于星期日（2）免疫沉淀试验抗原：包括试管沉淀法、单相免疫扩散试免疫沉淀试验抗原：包括试管沉淀法、单相免疫扩散试验和双相免疫扩散试验、免疫电泳、对流免疫电泳等。验和双相免疫扩散试验、免疫电泳、对流免疫电泳等。（3 3）中和试验：将特异性血清与相应病原混合，用血清）中和试验：将特异性血清与相应病原混合，用血清病毒混合物接种靶动物、鸡胚或细胞培养，观察感染情况进病
9、毒混合物接种靶动物、鸡胚或细胞培养，观察感染情况进行疾病诊断。行疾病诊断。（4 4）补体结合试验抗原：抗原抗体复合物可以激活补体，出现）补体结合试验抗原：抗原抗体复合物可以激活补体，出现各种生物学反应。各种生物学反应。第12页，讲稿共110张，创作于星期日（5 5）酶联免疫吸附试验（）酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）：包括直接法、间接法、）：包括直接法、间接法、双抗体夹心、竞争双抗体夹心、竞争ELISAELISA等。等。（6 6）荧光抗体染色技术：直接法、间接法、竞争法等。）荧光抗体染色技术：直接法、间接法、竞争法等。（7 7）胶体金免疫检测技术。）胶体金免疫检测技术。（8 8）免疫组
10、化诊断试剂。）免疫组化诊断试剂。第13页，讲稿共110张，创作于星期日（1 1）生物技术：单克隆抗体技术（荧光抗体染色技术或酶联免）生物技术：单克隆抗体技术（荧光抗体染色技术或酶联免疫染色技术）。疫染色技术）。（2 2）分子生物学技术。）分子生物学技术。PCRPCR（RTRTPCRPCR）扩增技术。）扩增技术。荧光定量荧光定量PCRPCR（RTRTPCRPCR）。）。基于核酸序列扩增技术（基于核酸序列扩增技术（NASBANASBA）。）。核酸探针。核酸探针。第14页，讲稿共110张，创作于星期日1 1、抗血清：用抗原多次免疫动物，提取血清制成，用于治疗或预防、抗血清：用抗原多次免疫动物，提取血
11、清制成，用于治疗或预防动物疾病。动物疾病。2 2、微生态制剂：含活菌的制剂，具有调节机体菌群、增强免、微生态制剂：含活菌的制剂，具有调节机体菌群、增强免疫力、促生长等。疫力、促生长等。3 3、卵黄抗体：用抗原多次免疫禽类，提取卵黄抗体制成，用、卵黄抗体：用抗原多次免疫禽类，提取卵黄抗体制成，用于治疗或预防动物疾病。于治疗或预防动物疾病。4 4、干扰素：用病毒等诱导产生干扰素。、干扰素：用病毒等诱导产生干扰素。5 5、转移因子：用动物脏器或组织提取制成，作为非特异性免疫调节转移因子：用动物脏器或组织提取制成，作为非特异性免疫调节剂，增强机体免疫力，提高生产性能。剂，增强机体免疫力，提高生产性能。
12、第15页，讲稿共110张，创作于星期日（一）兽用灭活疫苗的制备技术（一）兽用灭活疫苗的制备技术 灭活疫苗是用菌（毒）种培养物或含毒组灭活疫苗是用菌（毒）种培养物或含毒组织或细胞培养物，经化学灭活剂灭活或加热处理，织或细胞培养物，经化学灭活剂灭活或加热处理，使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入适当的使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入适当的防腐剂或加入免疫佐剂制成。防腐剂或加入免疫佐剂制成。第16页，讲稿共110张，创作于星期日1.11.1、菌（毒）种菌（毒）种标准标准历史清楚；历史清楚；生物学性状明显；生物学性状明显；遗传稳定；遗传稳定；优良的免疫原性与反应原性；优良的免疫原性与反应原性；
13、毒力在规定的范围内。毒力在规定的范围内。第17页，讲稿共110张，创作于星期日原种原种 细菌原种应规定其培养特性、生化特性、血清学特性、毒力和免疫原性细菌原种应规定其培养特性、生化特性、血清学特性、毒力和免疫原性等，并作纯粹检查。病毒原种应规定其生物学特性、理化特性、血清学特性、最等，并作纯粹检查。病毒原种应规定其生物学特性、理化特性、血清学特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并纯粹。小感染量、最小免疫量、安全性等，并纯粹。基础种子基础种子 基础种子由原种制备而来，基础种子为企业生产兽用生物制品提基础种子由原种制备而来，基础种子为企业生产兽用生物制品提供种子来源，应作系统鉴定，并规定代次。
14、供种子来源，应作系统鉴定，并规定代次。生产种子生产种子 生产种子由生产企业用基础种子进行复壮、繁殖。细菌等生产种生产种子由生产企业用基础种子进行复壮、繁殖。细菌等生产种子应作纯粹检查。病毒生产种子应作含量测定和纯净检查。子应作纯粹检查。病毒生产种子应作含量测定和纯净检查。第18页，讲稿共110张，创作于星期日菌种的选育菌种的选育 分离病原分离病原纯粹检验纯粹检验致病性鉴定和抗原致病性鉴定和抗原性测定性测定设计制成灭活疫苗设计制成灭活疫苗接种实验室动物接种实验室动物攻毒攻毒用本动物进行保护率测定用本动物进行保护率测定以确定疫苗候选株。以确定疫苗候选株。毒种的选育毒种的选育 弱毒毒种有天然弱毒株或
15、人工致弱毒株；强毒弱毒毒种有天然弱毒株或人工致弱毒株；强毒毒株分离毒株分离系统鉴定（无污染、毒力强而稳定、免疫原系统鉴定（无污染、毒力强而稳定、免疫原性好、抗原谱广、与流行毒血清型相符）性好、抗原谱广、与流行毒血清型相符）疫苗候选疫苗候选株。株。第19页，讲稿共110张，创作于星期日冷冻真空干燥法冷冻真空干燥法 冻干的菌种一般在冻干的菌种一般在2 28 8 C C保存；冻干的毒保存；冻干的毒种一般在种一般在-20-20 C C以下保存，以下保存，温度越低保存期越长。温度越低保存期越长。结冻保存结冻保存 有些病毒可用含毒组织在低温条件下（有些病毒可用含毒组织在低温条件下（-20-20 C C以下
16、）。以下）。液氮保存液氮保存 有些细胞结合毒须在有些细胞结合毒须在196196 C C的液氮中保存。的液氮中保存。动物继代保存动物继代保存 虫种一般通过动物继代保存。虫种一般通过动物继代保存。第20页，讲稿共110张，创作于星期日生产检验用菌（毒）种实行分级管理制度，种子分三级生产检验用菌（毒）种实行分级管理制度，种子分三级（原种、基础种子和生产种子）。（原种、基础种子和生产种子）。原种和由国家兽医微生物菌种保藏中心或分中心负责保管；原种和由国家兽医微生物菌种保藏中心或分中心负责保管；基础种子由菌种中心或分中心负责制备、鉴定、保管和供基础种子由菌种中心或分中心负责制备、鉴定、保管和供应；生产种
17、子由生产企业自行制备、鉴定和保管。应；生产种子由生产企业自行制备、鉴定和保管。第21页，讲稿共110张，创作于星期日供应：菌种中心及分中心统一供应。供应：菌种中心及分中心统一供应。索取：须持有相应级别机构出具的正式公函，说明菌种名索取：须持有相应级别机构出具的正式公函，说明菌种名称、型别、数量及用途。一、二类菌种时，必须由省（市、称、型别、数量及用途。一、二类菌种时，必须由省（市、自治区）兽医行政主管部门审核，农业部批准后，方可供自治区）兽医行政主管部门审核，农业部批准后，方可供应。有产品批准文号者，可由生产企业直接向菌种中心或应。有产品批准文号者，可由生产企业直接向菌种中心或分中心领取。分中
18、心领取。要求：其他任何单位不得转发生产用菌（毒）种。烈性传染要求：其他任何单位不得转发生产用菌（毒）种。烈性传染病或人畜共患传染病的强毒菌（毒）种，必须有专职技术人病或人畜共患传染病的强毒菌（毒）种，必须有专职技术人员领取。员领取。第22页，讲稿共110张，创作于星期日1.2.1 1.2.1 细菌培养技术细菌培养技术细菌的繁殖是以二分裂法进行，分四个时期：迟缓期细菌的繁殖是以二分裂法进行，分四个时期：迟缓期（细菌处于静止适应状态）；对数增殖期（以恒定的速（细菌处于静止适应状态）；对数增殖期（以恒定的速度增殖）；稳定期（细菌增加数与死亡数保存平衡）；度增殖）；稳定期（细菌增加数与死亡数保存平衡）
19、；衰退期（活菌数下降）。衰退期（活菌数下降）。第23页，讲稿共110张，创作于星期日 需氧菌的培养需氧菌的培养 平板培养法平板培养法 有平板划线培养法和倾注培养法。有平板划线培养法和倾注培养法。需氧芽孢菌的培养需氧芽孢菌的培养 将接种材料先接种于液体培养基将接种材料先接种于液体培养基中，置水浴加入至中，置水浴加入至8080 C C，维持，维持15152020分钟，以杀死非芽分钟，以杀死非芽孢菌，然后在孢菌，然后在3737 C C作增菌培养。作增菌培养。抑菌分离培养抑菌分离培养 利用某些化学药品对某类细菌的抑制或杀灭利用某些化学药品对某类细菌的抑制或杀灭作用，而对另一些细菌不生产明显的作用，来分
20、离培养某些作用，而对另一些细菌不生产明显的作用，来分离培养某些细菌。细菌。接种试验动物进行培养。接种试验动物进行培养。第24页，讲稿共110张，创作于星期日厌氧菌的培养厌氧菌的培养 生物学方法生物学方法 在培养基中加入植物或动物组织在培养基中加入植物或动物组织（如马铃薯、发芽谷物、灭菌的新鲜动物组织块）（如马铃薯、发芽谷物、灭菌的新鲜动物组织块），以消耗养气或使氧化还原电势下降。用这些培，以消耗养气或使氧化还原电势下降。用这些培养基培养厌氧菌时，先将培养基煮沸养基培养厌氧菌时，先将培养基煮沸15153030分钟，分钟，降温后在培养基表面加一层灭菌的液体石蜡，然降温后在培养基表面加一层灭菌的液体
21、石蜡，然后接种培养。后接种培养。第25页，讲稿共110张，创作于星期日化学方法化学方法 利用还原作用强的化学物质，吸收环境或培养基内利用还原作用强的化学物质，吸收环境或培养基内的养气或还原氧化型物质，降低氧化还原电势。的养气或还原氧化型物质，降低氧化还原电势。物理学方法物理学方法 利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝培养环境或培养基中的养气，形成无氧状态，以除或隔绝培养环境或培养基中的养气，形成无氧状态，以利于厌氧菌的生长。常用的有厌氧罐法。利于厌氧菌的生长。常用的有厌氧罐法。第26页，讲稿共110张，创作于星期日有些细菌特别是初次分离培养，在含
22、有有些细菌特别是初次分离培养，在含有5 51010CO2CO2环境下生长良环境下生长良好，培养时，可直接利用二氧化碳培养箱培养，按照需要调节培养箱内好，培养时，可直接利用二氧化碳培养箱培养，按照需要调节培养箱内二氧化碳的浓度。二氧化碳的浓度。在没有条件的实验室，简便的做法是用有盖玻璃容器，放入接种在没有条件的实验室，简便的做法是用有盖玻璃容器，放入接种的培养物后，点燃蜡烛，加盖密闭容器，由于燃烧耗氧产生二氧的培养物后，点燃蜡烛，加盖密闭容器，由于燃烧耗氧产生二氧化碳，蜡烛即熄灭。此时容器内含有较高浓度的二氧化碳，将容化碳，蜡烛即熄灭。此时容器内含有较高浓度的二氧化碳，将容器放入适宜温度培养。器
23、放入适宜温度培养。第27页，讲稿共110张，创作于星期日病毒是严格的细胞内寄生物，由于病毒缺乏自主复制的酶系统，病毒是严格的细胞内寄生物，由于病毒缺乏自主复制的酶系统，不能独自进行物质代谢，必须依赖宿主细胞或细胞的某些成分不能独自进行物质代谢，必须依赖宿主细胞或细胞的某些成分合成核酸和蛋白质，所以只能在易感的细胞内以复制的方式进合成核酸和蛋白质，所以只能在易感的细胞内以复制的方式进行增殖，而不能在任何无细胞的培养液内生长。行增殖，而不能在任何无细胞的培养液内生长。除少数病毒除少数病毒外，大多数动物病毒能在试验动物、受精卵和细胞培养中增外，大多数动物病毒能在试验动物、受精卵和细胞培养中增殖。殖。
24、第28页，讲稿共110张，创作于星期日病毒细胞培养的营养需求病毒细胞培养的营养需求1 1）无机离子）无机离子 维持渗透压、提供细胞酶与代谢活动所需要的物维持渗透压、提供细胞酶与代谢活动所需要的物质，促进细胞贴壁等。常用弱碳酸氢盐来调节培养液的质，促进细胞贴壁等。常用弱碳酸氢盐来调节培养液的pHpH值，培值，培养液的养液的pHpH值一般维持在值一般维持在7.2-7.47.2-7.4。2)2)碳水化合物碳水化合物 常用的碳水化合物是葡萄糖。有些复杂的培养基，常用的碳水化合物是葡萄糖。有些复杂的培养基，还需添加其它糖类或简单的化合物如乳酸、丙酮酸及醋酸，或代替还需添加其它糖类或简单的化合物如乳酸、丙
25、酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。葡萄糖。3)3)氨基酸氨基酸 细胞培养所用的氨基酸为左旋异构体。维持细胞生长的细胞培养所用的氨基酸为左旋异构体。维持细胞生长的最低营养要求需要以下最低营养要求需要以下1313种氨基酸。种氨基酸。第29页，讲稿共110张，创作于星期日4)4)维生素维生素 大部分维生素与细胞代谢有关。使用较多的维生素大部分维生素与细胞代谢有关。使用较多的维生素主要是主要是B B族维生素，复杂的培养液中还含有还原剂、谷胱甘肽、族维生素，复杂的培养液中还含有还原剂、谷胱甘肽、抗坏血酸及抗坏血酸及L L半胱氨酸。在不含血清的培养液中，常含有半胱氨酸。在不含血清的培养液中，常含有脂溶性维生素。脂
26、溶性维生素。5)5)蛋白质蛋白质 动物血清是蛋白质的主要来源，常用的有胎牛血清动物血清是蛋白质的主要来源，常用的有胎牛血清或犊牛血清。血清起营养作用，保护细胞或去毒，抑制蛋白溶或犊牛血清。血清起营养作用，保护细胞或去毒，抑制蛋白溶解酶，促进细胞在玻璃上附着和铺开。解酶，促进细胞在玻璃上附着和铺开。6 6）抗生素）抗生素 控制细胞培养中细菌的污染，常用的抗生素有青霉素、控制细胞培养中细菌的污染，常用的抗生素有青霉素、链霉素、制霉菌素或两性霉素链霉素、制霉菌素或两性霉素B B。第30页，讲稿共110张，创作于星期日 细胞培养类型细胞培养类型 （1 1）原代细胞）原代细胞 原代细胞是用动物新鲜组织如
27、胚胎或幼畜的原代细胞是用动物新鲜组织如胚胎或幼畜的组织或受精卵，经胰蛋白酶消化分散后制备而成。病毒对原组织或受精卵，经胰蛋白酶消化分散后制备而成。病毒对原代细胞易感，繁殖滴度高，且无致瘤性等。但原代细胞不能代细胞易感，繁殖滴度高，且无致瘤性等。但原代细胞不能在体外多次传代，组织原材料的来源不固定，易混入外源病在体外多次传代，组织原材料的来源不固定，易混入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其质量，影响产品的纯净原，造成外源病毒污染，不易控制其质量，影响产品的纯净和安全性。和安全性。第31页，讲稿共110张，创作于星期日2 2）二倍体细胞株二倍体细胞株 原代细胞原代细胞次代细胞次代细胞多次连续传
28、代成多次连续传代成为二倍体细胞。二倍体细胞的细胞形态学可能发生变化，但为二倍体细胞。二倍体细胞的细胞形态学可能发生变化，但细胞染色体数与原代细胞一样。不能在体外无限制传代，从细胞染色体数与原代细胞一样。不能在体外无限制传代，从几代至几十代，兼有原代细胞和传代细胞的优点，病毒对其几代至几十代，兼有原代细胞和传代细胞的优点，病毒对其易感，质量可控，适用于繁殖病毒。易感，质量可控，适用于繁殖病毒。3 3）传代细胞系）传代细胞系 由肿瘤组织培养而成或由细胞株转化而来。可由肿瘤组织培养而成或由细胞株转化而来。可在体外无限制的传代，其染色体数不正常，成为异倍体。适宜于在体外无限制的传代，其染色体数不正常，
29、成为异倍体。适宜于许多动物病毒的生长，易于培养，可以建立种子库，质量易控制。许多动物病毒的生长，易于培养，可以建立种子库，质量易控制。但存在潜在的致瘤性，要求背景情况应详细，并作系统鉴定合格但存在潜在的致瘤性，要求背景情况应详细，并作系统鉴定合格后，方可用于繁殖病毒生产灭活疫苗。后，方可用于繁殖病毒生产灭活疫苗。第32页，讲稿共110张，创作于星期日检验项目检验项目主细胞库主细胞库工作工作细胞库细胞库最高限制最高限制代次细胞代次细胞高于最高代次高于最高代次1010代的细胞代的细胞显微镜检查显微镜检查细菌和霉菌细菌和霉菌支原体支原体病毒病毒细胞鉴别细胞鉴别胞核学检查胞核学检查致瘤和致癌性致瘤和致
30、癌性第33页，讲稿共110张，创作于星期日1)1)细胞保存细胞保存 收集新鲜细胞，用细胞冷冻保护液收集新鲜细胞，用细胞冷冻保护液(含含2020犊牛血清、犊牛血清、5 51010二甲基亚砜的营养液二甲基亚砜的营养液)调整细胞浓度达调整细胞浓度达100100万一万一200200万个细胞万个细胞m1m1，分装，分装于安瓿中，封口，于安瓿中，封口，44预冷预冷30min30min，封口严密的安瓿移至，封口严密的安瓿移至-50-507070 C C冰箱冰箱中预冷，然后移至液氮罐内贮存，可保存数年。中预冷，然后移至液氮罐内贮存，可保存数年。2)2)细胞复苏细胞复苏 将安瓶自液氮罐取出后立即放入将安瓶自液氮
31、罐取出后立即放入37374040温水中，在温水中，在lminlmin之之内使细胞融化，换液培养至形成细胞单层。内使细胞融化，换液培养至形成细胞单层。3)3)细胞运输细胞运输 单层细胞培养瓶装满生长液，以防液体振荡冲脱细胞，或只留少量单层细胞培养瓶装满生长液，以防液体振荡冲脱细胞，或只留少量生长液能覆盖单层，以防细胞干燥。细胞悬液装于冰盒保持温度在生长液能覆盖单层，以防细胞干燥。细胞悬液装于冰盒保持温度在15152525左右。左右。第34页，讲稿共110张，创作于星期日1 1）静止培养）静止培养 静止培养是指将制备好的细胞悬液分装在适宜的静止培养是指将制备好的细胞悬液分装在适宜的培养瓶中，密闭瓶
32、口，置恒温培养箱内静止培养或以松口的容器培养瓶中，密闭瓶口，置恒温培养箱内静止培养或以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培养箱中静止培养，形成细胞单通入二氧化碳或在含二氧化碳的培养箱中静止培养，形成细胞单层后，接种病毒悬液，层后，接种病毒悬液，37373838 C C左右继续培养。左右继续培养。2 2）转动培养）转动培养 将制备好的细胞悬液分装在玻璃或塑料转瓶中，密闭将制备好的细胞悬液分装在玻璃或塑料转瓶中，密闭瓶口，置转瓶机上，以每小时瓶口，置转瓶机上，以每小时5 51010转转动培养，细胞在转动培转转动培养，细胞在转动培养时，贴附于瓶壁四周，长成细胞单层后，接种病毒悬液，养时，贴附于瓶
33、壁四周，长成细胞单层后，接种病毒悬液，37373838 C C左右继续转动培养。左右继续转动培养。第35页，讲稿共110张，创作于星期日3 3）悬浮培养）悬浮培养 在悬浮培养罐中通过不断搅拌，并随时补充营养在悬浮培养罐中通过不断搅拌，并随时补充营养液和校正液和校正pHpH值，使细胞在悬浮的条件下培养生长。由于悬浮培养值，使细胞在悬浮的条件下培养生长。由于悬浮培养细胞能及时得到充足的营养和养气，细胞生长速度快，产量高，细胞能及时得到充足的营养和养气，细胞生长速度快，产量高，可以得到大量的细胞。可以得到大量的细胞。4 4）微载体培养）微载体培养 通过搅拌使微载体悬浮在培养液中，细胞通过搅拌使微载体
34、悬浮在培养液中，细胞通过贴附在微载体固体颗粒表面上生长形成细胞单层，细胞通过贴附在微载体固体颗粒表面上生长形成细胞单层，细胞的浓度较大、生长快。微载体培养可采用通气搅拌法，也可的浓度较大、生长快。微载体培养可采用通气搅拌法，也可采用转瓶培养法进行。采用转瓶培养法进行。第36页，讲稿共110张，创作于星期日鸡胚的选择鸡胚的选择 必须是来源于健康易感的种鸡群，其种蛋必须新鲜，必须是来源于健康易感的种鸡群，其种蛋必须新鲜，清洁。种鸡群必须定期监测，不得含有繁殖病毒的相应抗体。清洁。种鸡群必须定期监测，不得含有繁殖病毒的相应抗体。鸡胚接种途径和接种方法鸡胚接种途径和接种方法1 1）尿囊腔途径）尿囊腔途
35、径 取取9 91111日龄的鸡胚，在灯光照射下，在离气日龄的鸡胚，在灯光照射下，在离气室约室约0.30.30.5cm0.5cm处无大血管的位置作一标记，作为接种部位，在气处无大血管的位置作一标记，作为接种部位，在气室和待接种部位各打一小孔，将受精卵横放在蛋盘上，在待接种处室和待接种部位各打一小孔，将受精卵横放在蛋盘上，在待接种处垂直刺入针头约垂直刺入针头约0.5cm0.5cm，接种，接种0.050.050.2ml0.2ml病毒溶液，用石蜡封病毒溶液，用石蜡封口，继续孵化。也可将气室向上放于蛋盘中，在气室距边缘约口，继续孵化。也可将气室向上放于蛋盘中，在气室距边缘约0.5cm0.5cm处打一小孔
36、。沿受精卵长径平行方向刺入针头约处打一小孔。沿受精卵长径平行方向刺入针头约1cm1cm，注入，注入接种物接种物0.050.050.2ml0.2ml，用石蜡封孔，继续孵化。，用石蜡封孔，继续孵化。第37页，讲稿共110张，创作于星期日2 2）绒毛尿囊膜途径）绒毛尿囊膜途径 在气室中心钻一小孔，直接从气室处刺入针头在气室中心钻一小孔，直接从气室处刺入针头约约0.5cm0.5cm，滴入，滴入0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，继续垂直刺入针头，穿病毒溶液，继续垂直刺入针头，穿过卵膜和绒毛尿囊膜，拔出针头。也可用人工气室法进行，过卵膜和绒毛尿囊膜，拔出针头。也可用人工气室法进行，在胚胎附近处和气
37、室处各打一小孔，然后用吸球紧贴气室小在胚胎附近处和气室处各打一小孔，然后用吸球紧贴气室小孔处轻轻吸气，造成负压，形成人工气室，接种孔处轻轻吸气，造成负压，形成人工气室，接种0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，用石蜡封孔。病毒溶液，用石蜡封孔。3 3）卵黄囊途径）卵黄囊途径 在气室中心钻一小孔，垂直刺入针头约在气室中心钻一小孔，垂直刺入针头约3cm3cm，注入，注入接种物接种物0.20.20.5ml0.5ml，用石蜡封口，继续孵化。也可在气室外和卵长，用石蜡封口，继续孵化。也可在气室外和卵长径的径的1/21/2处各打一小孔，并在中间孔处刺入针头约处各打一小孔，并在中间孔处刺入针头约1.5c
38、m1.5cm，接种，接种0.10.10.5ml0.5ml病毒溶液，用石蜡封孔。病毒溶液，用石蜡封孔。第38页，讲稿共110张，创作于星期日4 4）羊膜腔途径）羊膜腔途径 将气室端靠近胚胎侧的卵壳锯穿，在卵膜上将气室端靠近胚胎侧的卵壳锯穿，在卵膜上滴入一滴无菌液体石蜡或生理盐水，避开血管，在气室处刺入滴入一滴无菌液体石蜡或生理盐水，避开血管，在气室处刺入针头约针头约0.5cm0.5cm，在气室内的卵膜上滴入，在气室内的卵膜上滴入0.10.10.2ml0.2ml病毒溶液，病毒溶液，继续垂直刺入针头，穿过卵膜和绒毛尿囊膜，拔出针头。或在继续垂直刺入针头，穿过卵膜和绒毛尿囊膜，拔出针头。或在人工气室孔
39、处呈人工气室孔处呈3030 角刺入针头约角刺入针头约0.5cm0.5cm，接种，接种0.10.10.2ml0.2ml病毒病毒溶液，用石蜡封孔。溶液，用石蜡封孔。5 5）静脉途径）静脉途径 画出直而粗的静脉处位置，卵壳，加一滴液体画出直而粗的静脉处位置，卵壳，加一滴液体石蜡，使卵膜透明。用长约石蜡，使卵膜透明。用长约1.5cm1.5cm的的4 4号针头插入血管内注射接号针头插入血管内注射接种物种物0.02-0.05ml0.02-0.05ml。第39页，讲稿共110张，创作于星期日接种后一般在接种后一般在3737 C C左右继续孵化左右继续孵化2 27 7天，不必翻蛋。每天，不必翻蛋。每日照蛋日照
40、蛋1 12 2次，弃去接种后次，弃去接种后2424小时内非特异死亡的鸡胚，小时内非特异死亡的鸡胚，2424小时后死亡的鸡胚随时捡出，置小时后死亡的鸡胚随时捡出，置4 48 8 C C冷却冷却4 42424小时。小时。观察期结束，所有活胚同样冷却处理。分别收获收获观察期结束，所有活胚同样冷却处理。分别收获收获胚体、卵黄囊、尿囊液、绒毛尿囊膜等。收获期间注胚体、卵黄囊、尿囊液、绒毛尿囊膜等。收获期间注意检查胚胎、绒毛尿囊膜的病变情况、尿囊液是否浑意检查胚胎、绒毛尿囊膜的病变情况、尿囊液是否浑浊等。浊等。第40页，讲稿共110张，创作于星期日病毒病毒胚龄胚龄接种接种途径途径培养培养温度温度培养培养时
41、间时间鸡胚鸡胚变化变化收获收获材料材料鸡新城疫鸡新城疫9 91111尿囊腔尿囊腔3737左右左右3 35 5天天出血、死亡、出血、死亡、血凝血凝尿囊液尿囊液鸡痘鸡痘10101111CAMCAM3737左右左右5 5天天膜上痘疱膜上痘疱CAMCAM鸡传染性鸡传染性喉气管炎喉气管炎10101111CAMCAM3737左右左右5 5天天膜上痘疱膜上痘疱CAMCAM狂犬狂犬6 67 7卵黄囊卵黄囊3737左右左右8 81010天天卵黄囊卵黄囊乙脑乙脑6 68 8卵黄囊卵黄囊3737左右左右3 3天天死亡死亡鸡胚鸡胚第41页，讲稿共110张，创作于星期日 2.4.1 2.4.1 动物接种途径和接种方法动
42、物接种途径和接种方法1 1）脑内接种）脑内接种 给小鼠和地鼠脑内接种时，用左手大拇指和食指固定头部，给小鼠和地鼠脑内接种时，用左手大拇指和食指固定头部，消毒左侧眼与耳之间上部注射部位，并于眼后角、耳前缘及颅前后中线所构消毒左侧眼与耳之间上部注射部位，并于眼后角、耳前缘及颅前后中线所构成之位置中间刺入针头成之位置中间刺入针头2 23mm3mm，乳鼠接种，乳鼠接种0.01-0.02ml0.01-0.02ml，成年鼠和地鼠为，成年鼠和地鼠为0.03-0.03-0.05ml0.05ml。给豚鼠和家兔进行脑内接种时，先作麻醉或人工固定，在颅前后中线旁。给豚鼠和家兔进行脑内接种时，先作麻醉或人工固定，在颅
43、前后中线旁边边5mm5mm平行线与动物瞳孔横线交叉处消毒，用锥刺穿颅骨，然后用针头刺入平行线与动物瞳孔横线交叉处消毒，用锥刺穿颅骨，然后用针头刺入4 410mm10mm，接种，接种0.1-0.025ml0.1-0.025ml。绵羊脑内接种时，先固定在接种台上，剪去头。绵羊脑内接种时，先固定在接种台上，剪去头顶部的毛，并用硫化钡脱毛，碘酊消毒后，在颅顶部中线左或右侧，用锥钻顶部的毛，并用硫化钡脱毛，碘酊消毒后，在颅顶部中线左或右侧，用锥钻一小孔，硬脑膜下或脑内接种一小孔，硬脑膜下或脑内接种1ml1ml，立即用火棉胶封闭接种孔。，立即用火棉胶封闭接种孔。第42页，讲稿共110张，创作于星期日2 2
44、）皮内接种）皮内接种 常用于大动物。在背部、颈部、腹部、耳部及尾根部先剪常用于大动物。在背部、颈部、腹部、耳部及尾根部先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮肤，用针头斜面向外，毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮肤，用针头斜面向外，与皮肤面平行刺入与皮肤面平行刺入2 23mm3mm，接种，接种0.1-0.2ml0.1-0.2ml。注射剂量较大时，可分点注射。注射剂量较大时，可分点注射。牛、羊舌面皮内注射时，先固定动物，抓住动物舌头并固定，然后接种。牛、羊舌面皮内注射时，先固定动物，抓住动物舌头并固定，然后接种。3 3）皮下注射）皮下注射 豚鼠和家兔可选择腹部及大腿内侧皮肤松弛
45、处，小鼠可选豚鼠和家兔可选择腹部及大腿内侧皮肤松弛处，小鼠可选择尾根部或背部，碘酊消毒皮肤处，用针头水平方向挑起皮肤，刺入择尾根部或背部，碘酊消毒皮肤处，用针头水平方向挑起皮肤，刺入1.5-2cm1.5-2cm，缓慢注入接种物，缓慢注入接种物0.2-1ml0.2-1ml。第43页，讲稿共110张，创作于星期日4 4）静脉接种）静脉接种 小鼠尾静脉注射时，先将小鼠尾巴在小鼠尾静脉注射时，先将小鼠尾巴在50505555 C C水中浸泡水中浸泡1 1分钟，使尾静脉扩张，用鼠缸扣住鼠体，露出尾分钟，使尾静脉扩张，用鼠缸扣住鼠体，露出尾部，用左手拇指和中指将鼠尾拉直，以食指托住尾部，消毒部，用左手拇指和
46、中指将鼠尾拉直，以食指托住尾部，消毒注射部位后由靠近尾尖端处平行刺入针头，再向下刺入静脉，注射部位后由靠近尾尖端处平行刺入针头，再向下刺入静脉，慢慢注入慢慢注入0.1-1ml0.1-1ml接种物。家兔耳静脉注射时，先固定在特制固定接种物。家兔耳静脉注射时，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精棉球涂擦注射部位静脉器上或人工固定，剃耳毛，用酒精棉球涂擦注射部位静脉1 1分钟，分钟，使静脉扩张，再用左手拇指及中食指抓住耳尖部，刺入针头使静脉扩张，再用左手拇指及中食指抓住耳尖部，刺入针头缓慢注射缓慢注射1 15ml5ml接种物。鸡翅下肱静脉注射时，侧卧固定，张接种物。鸡翅下肱静脉注射时，侧卧
47、固定，张开翅膀，拔去注射部位的羽毛，碘酊消毒，用针头斜面朝上刺入开翅膀，拔去注射部位的羽毛，碘酊消毒，用针头斜面朝上刺入静脉注射静脉注射1 15ml5ml接种物。接种物。第44页，讲稿共110张，创作于星期日5 5）腹腔接种）腹腔接种 家兔和豚鼠先在腹股沟处刺入皮下，家兔和豚鼠先在腹股沟处刺入皮下，进针少许后再刺入腹腔注射进针少许后再刺入腹腔注射0.5-5ml0.5-5ml。小鼠腹腔接种。小鼠腹腔接种时，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其头背部，时，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其头背部，翻转鼠体使腹部向上，把鼠尾和右后脚夹于小指和翻转鼠体使腹部向上，把鼠尾和右后脚夹于小指和无名指之间，右手
48、将针头平行刺入腿根处腹部皮下，无名指之间，右手将针头平行刺入腿根处腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射向下斜行刺入腹腔，注射0.5-1ml0.5-1ml。第45页，讲稿共110张，创作于星期日动物接种后应每天观察，注意动物的活动、饮食、粪便与尿液及动物接种后应每天观察，注意动物的活动、饮食、粪便与尿液及皮毛体表等情况，还应根据接种微生物的特性及动物性别、年龄皮毛体表等情况，还应根据接种微生物的特性及动物性别、年龄等的不同而有所侧重，如体温曲线、特征性临床症状的出现及注等的不同而有所侧重，如体温曲线、特征性临床症状的出现及注射部位的特征性变化等。根据观察结果，选出接种后符合要求的射部位的特征性变化等
49、。根据观察结果，选出接种后符合要求的反应特征的动物，按照规定方法剖杀动物，收集含毒血液或采集反应特征的动物，按照规定方法剖杀动物，收集含毒血液或采集含毒组织、器官等。含毒组织、器官等。第46页，讲稿共110张，创作于星期日大量培养细菌的方法大量培养细菌的方法 （1 1）固体培养基表面培养法固体培养基表面培养法 此法是将溶化此法是将溶化的肉汤琼脂培养基，分装于大扁瓶的肉汤琼脂培养基，分装于大扁瓶(大型克氏瓶大型克氏瓶)，灭菌后平放使凝固，经培养观察无污染，在无菌室接灭菌后平放使凝固，经培养观察无污染，在无菌室接入种子液，使均匀分布于表面，平放温室静置培养，入种子液，使均匀分布于表面，平放温室静置
50、培养，然后倾去凝集水，收集菌苔制成菌悬浮液。然后倾去凝集水，收集菌苔制成菌悬浮液。第47页，讲稿共110张，创作于星期日（2 2）液体静置培养法液体静置培养法 此法适于一般菌苗的生产，培养容此法适于一般菌苗的生产，培养容器可用大玻瓶也可用培养罐器可用大玻瓶也可用培养罐(或称发酵罐或称发酵罐)，按容器的深度，按容器的深度，装入适量培养基，一般是容器深度的装入适量培养基，一般是容器深度的1 12 22 23 3为宜，经高压为宜，经高压蒸汽灭菌之后，冷至室温接入细菌种子，保持适宜温度静置培蒸汽灭菌之后，冷至室温接入细菌种子，保持适宜温度静置培养。养。（3 3）液体深层通气培养法）液体深层通气培养法