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1、关于分子生物学关于分子生物学 第1页，讲稿共142张，创作于星期一基因工程基因工程 genetic engineering genetic engineering遗传工程遗传工程 genetic engineering genetic engineering基因操作基因操作 gene manipulation gene manipulationDNA DNA 重组技术重组技术 recombinant DNA recombinant DNA techniquetechnique基因克隆基因克隆 gene cloning gene cloning分子克隆分子克隆 molecular cloning
2、 molecular cloning第2页，讲稿共142张，创作于星期一 基因工程：外源基因工程：外源DNA，通过具有复，通过具有复制能力的载体分子形成重组制能力的载体分子形成重组DNA分子，分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋或蛋白质。白质。第3页，讲稿共142张，创作于星期一基因工程的理论依据：基因工程的理论依据：遗传物质遗传物质DNA DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型 操纵子学说操纵子学说 基因的表达与突变（中心法则）基因的表达与突变（中心法则）基因工程的工具酶的发现基因工程的工具酶的发现第
3、4页，讲稿共142张，创作于星期一基因工程的基本程序：基因工程的基本程序：分分 切切 接接 转转 筛筛基因工程技术的特点：基因工程技术的特点：1.可在体外人工的可在体外人工的,有目的的有目的的,根据需根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复；修复；2.方法简便、快速、准确、特异，能方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。保证研究与开发的需要。第5页，讲稿共142张，创作于星期一基基因因工工程程的的基基本本程程序序第6页，讲稿共142张，创作于星期一第7页，讲稿共142张，创作于星期一 1972年年，美国的，美国的Berg和和Jackson等
4、人将猿猴病毒基因等人将猿猴病毒基因组组SV40DNA、噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。在体外重组获得成功。1973年年，美国斯坦福大学的，美国斯坦福大学的Cohen和和Boyer等人在等人在体外构建出含体外构建出含 有四环素和链霉素两个抗性基因的重组有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，重组质粒得以稳定质粒分子，将之导入大肠杆菌后，重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞抗性，由此宣告了复制，并赋予受体细胞抗性，由此宣告了基因工程的基因工程的诞生诞生。基因工程大事记基因工程大事记第8页，讲稿共142张，创作于星期一1
5、978 Genentech公司公司 人胰岛素人胰岛素 世界上世界上第一种基因工程蛋白药物第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物第一个基因工程药物-重组人胰岛重组人胰岛素在英、美获准使用素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国中国 转基因鱼转基因鱼 第9页，讲稿共142张，创作于星期一 中科院水生生物研究所培育的转基因鲤鱼，表现出快速生长中科院水生生物研究所培育的转基因鲤鱼，表现出快速生长效应。效应。第10页，讲稿共142张，创作于星期一19931993 基因工程西红柿在美国上市基因工程西红柿在美国上市1997 1997 多
6、莉羊多莉羊 英国爱丁堡罗斯林研究所英国爱丁堡罗斯林研究所 1999.91999.9 中国获准加入人类基因组计划中国获准加入人类基因组计划.负责负责测定人类基因组全部序列的测定人类基因组全部序列的1%1%2000.6.262000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图科学家公布人类基因组工作草图2001.2.112001.2.11 公布人类基因组基本信息公布人类基因组基本信息生物技术工程：生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程工程、细胞工程、发酵工程、发酵工程 第11页，讲稿共142张，创作于星期一克隆羊多利克隆羊多利（Dolly）的诞生的诞生199719
7、97年年 1212月月，英英 国国 RoslinRoslin研研 究究 所所 克克 隆隆 羊羊 多多 利利（DollyDolly）的的诞诞生生揭揭示示一一个个全全新新概概念念：由由成成年年机机体体的的一一个个体体细细胞胞核核，可可以以复复制制一一个个基基因因完完全全相相同同的的新新生生命个体。命个体。克克隆隆鼠鼠、克克隆隆牛牛等等实实验验的的成成功功进进一一步步验验证证了了其其科科学学性性将将体体细细胞胞核核移移植植去去核核卵卵细细胞胞形形成成的的克克隆隆细细胞胞，其其基基因因组组DNADNA与与细细胞胞核核供供体体一一致致，由由克克隆隆细细胞胞复复制制出出可可供供移移植植、无无免免疫疫排排斥
8、斥的的各各种种组组织织细细胞胞、器器官官，是是2121世纪生命科学的一个新里程碑。世纪生命科学的一个新里程碑。第12页，讲稿共142张，创作于星期一第13页，讲稿共142张，创作于星期一第14页，讲稿共142张，创作于星期一第15页，讲稿共142张，创作于星期一*组织纤溶酶原激活剂组织纤溶酶原激活剂*生长激素生长激素*促生长素促生长素*抗血友病因子抗血友病因子*脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶*葡糖脑苷脂酶葡糖脑苷脂酶*鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体*胰岛素胰岛素*人生长激素人生长激素*干扰素干扰素*白细胞介素白细胞介素2 2*粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子*粒细胞巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细
9、胞集落刺激因子*红细胞生成素红细胞生成素 EPO EPO第16页，讲稿共142张，创作于星期一基因工程的主要技术基因工程的主要技术DNA、RNA的分离纯化的分离纯化凝胶电泳技术凝胶电泳技术PCR酶切及鉴定、酶切及鉴定、DNA重组连接重组连接DNA测序、测序、DNA合成技术合成技术分子杂交分子杂交微生物的培养、保存微生物的培养、保存第17页，讲稿共142张，创作于星期一 克隆（克隆（clone）无性繁殖无性繁殖 名词：从一个共同祖先无性繁殖下名词：从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的来的一群遗传上同一的DNA分子、分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。细胞或个体所组成的特殊的生命群体。
10、动词：动词：第18页，讲稿共142张，创作于星期一基因克隆基因克隆应用酶学的方法，在体外将应用酶学的方法，在体外将目的基因目的基因与与载载体体DNA结合成一具有自我复制能力的结合成一具有自我复制能力的DNA分子（分子（重组体重组体），继而通过转化或转染宿主），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷分子拷贝贝。第19页，讲稿共142张，创作于星期一基因克隆示意图基因克隆示意图第20页，讲稿共142张，创作于星期一第21页，讲稿共142张，创作于星期一自然界的基因转移和重
11、组自然界的基因转移和重组基因重组基因重组(genetic recombination)整段整段DNA在细胞内或细胞间在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进甚至不同物种间进行行交换交换,并能在新的位置上并能在新的位置上复制复制,转录和翻转录和翻译译自然界的基因转移和重组是无目的的自然界的基因转移和重组是无目的的基因工程有目的基因工程有目的第22页，讲稿共142张，创作于星期一结合作用结合作用质粒质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）。细胞（细菌）。转化作用转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA
12、，使，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程。过程。第23页，讲稿共142张，创作于星期一基因工程基因工程工具酶工具酶载体载体重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程基因的克隆和分离基因的克隆和分离文库的构建文库的构建克隆基因的表达克隆基因的表达第24页，讲稿共142张，创作于星期一工具酶工具酶限制性核酸内切酶切割双链DNADNA连接酶生成3-5磷酸二酯键DNA聚合酶探针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：常用的工具酶：第25页，讲稿共142张，创作于星期一
13、一把特殊的剪刀一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现阿尔伯阿尔伯(Arber)(Arber)、史密斯、史密斯(Smith)(Smith)和内森斯和内森斯(Nathans)(Nathans)，获，获19781978年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖第26页，讲稿共142张，创作于星期一第27页，讲稿共142张，创作于星期一限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction enzyme)识别识别双链双链DNA内部内部特异位点特异位点并裂解磷酸并裂解磷酸二酯键二酯键分类：分类：型、型、型型、型型命名：命名：EcoR(E：属名；：属名；co：种名；：种名；R：株；：株；：
14、发：发现次序现次序)第28页，讲稿共142张，创作于星期一识别和切割位点识别和切割位点回文结构回文结构 46 bp出现两种末端出现两种末端*粘性末端粘性末端 粘端粘端*平头末端平头末端 平端平端 同工异源酶：同工异源酶：来源不同，但能识别和切来源不同，但能识别和切割同一位点割同一位点同尾酶：同尾酶：识别序列不同，但产生相同的识别序列不同，但产生相同的粘性末端粘性末端第29页，讲稿共142张，创作于星期一粘性末端与平头末端粘性末端与平头末端第30页，讲稿共142张，创作于星期一DNA聚合酶聚合酶逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)T4DNA连接酶连接酶(T4 ligas
15、e)碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)Taq DNA聚合酶聚合酶修饰酶修饰酶第31页，讲稿共142张，创作于星期一DNA聚合酶(pol)的活性5至至3的聚合活性的聚合活性5 3方向方向核酸核酸 外切酶活性外切酶活性5 3外切酶活性外切酶活性3 5外切酶活性外切酶活性pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段大片段 （Klenow片段）：聚合活性、片段）：聚合活性、3 5外切活性外切活性 常用的
16、工具酶常用的工具酶第32页，讲稿共142张，创作于星期一核酸外切酶活性核酸外切酶活性35外切酶活性外切酶活性53外切酶活性外切酶活性第33页，讲稿共142张，创作于星期一DNA 连接酶连接酶第34页，讲稿共142张，创作于星期一第35页，讲稿共142张，创作于星期一碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的脱脱磷磷酸酸作作用用第36页，讲稿共142张，创作于星期一末末端端脱脱氧氧核核苷苷酰酰转转移移酶酶(TDT)第37页，讲稿共142张，创作于星期一载体载体 vectorDNA，能在宿主细胞中进行自我复制和，能在宿主细胞中进行自我复制和表达表达克隆载体、表达载体克隆载体、表达载体原核载体原核载体：质粒：质粒(p
17、BR322,pUC）噬菌体（噬菌体（，M13）等）等真核载体真核载体：动物病毒载体：动物病毒载体pLXSN等等第38页，讲稿共142张，创作于星期一载体的基本要求：载体的基本要求：1.复制单位复制单位;2.克隆位点克隆位点(多个单克隆位点多个单克隆位点);3.筛选标记筛选标记;4.分子量尽可能小分子量尽可能小;5.外源外源DNA插入后不影响载体本身的复制插入后不影响载体本身的复制.没有一个天然的没有一个天然的DNA完全符合载体条件完全符合载体条件,故使用时需进行改造故使用时需进行改造.第39页，讲稿共142张，创作于星期一 质粒质粒 plasmid -噬菌体噬菌体-phage M13 柯斯质粒
18、柯斯质粒 cosmid 常用的克隆载体：常用的克隆载体：第40页，讲稿共142张，创作于星期一第41页，讲稿共142张，创作于星期一质粒质粒(plasmid)存在于细菌染色体外的小型环存在于细菌染色体外的小型环状双链状双链DNA分子分子理想的质粒理想的质粒 *拷贝数多拷贝数多;*两三个遗传标志，如抗药性基因：两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄抗氨苄青霉素基因青霉素基因(ampr)、抗四环素基因抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(lac Z)筛选标志筛选标志*多个限制酶的单一切点，即多个限制酶的单一切点，即多克隆位点多克隆位点(multiple cloning sites
19、,MCS)第42页，讲稿共142张，创作于星期一 *大小大小 210kb；*优点：易于操作、保存；优点：易于操作、保存；*缺点：转化效率较低，一般缺点：转化效率较低，一般106-7 clone/1ug 转化方法：化学法转化方法：化学法 电转电转 *应用：应用：1.小基因组的克隆小基因组的克隆 2.单一序列的克隆单一序列的克隆(目的基因的目的基因的 克隆克隆)第43页，讲稿共142张，创作于星期一pBR系列系列 来源于来源于Psc101、colE1和和RSF2124三三个天然质粒改造重组而成，个天然质粒改造重组而成，pBR322是是应用最多的大肠杆菌质粒载体，应用最多的大肠杆菌质粒载体，用氯用氯
20、霉素扩增法可使质粒霉素扩增法可使质粒DNA占细胞占细胞DNA总量的总量的50%，这对制备大量质粒，这对制备大量质粒DNA极为有利。极为有利。常用的质粒载体常用的质粒载体第44页，讲稿共142张，创作于星期一 四环素四环素抗性基因抗性基因氨苄青霉素氨苄青霉素 抗性基因抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r)(ter(terr r)常用的质粒载体常用的质粒载体第45页，讲稿共142张，创作于星期一第46页，讲稿共142张，创作于星期一第47页，讲稿共142张，创作于星期一pUC系列系列 pUC系列质粒（系列质粒（pUC
21、8、9、12、13、18、19）具有）具有pBR和和M13的许多特的许多特性，一般性，一般2.7kb.含有含有Ampr基因和基因和LacZ基因的一部分。基因的一部分。常用的质粒载体常用的质粒载体第48页，讲稿共142张，创作于星期一第49页，讲稿共142张，创作于星期一筛选指示系统筛选指示系统蓝白斑筛选蓝白斑筛选 在培养基中加入诱导物在培养基中加入诱导物IPTG（异（异丙基硫代半乳糖苷）和底物丙基硫代半乳糖苷）和底物x-gal，IPTG诱导诱导LacZ表达产生表达产生-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，使使x-gal水解，产生兰色化合物，形成水解，产生兰色化合物，形成兰色菌落；兰色菌落；当插入外源片段，
22、使当插入外源片段，使LacZ基因失基因失活，形成无色菌斑。活，形成无色菌斑。第50页，讲稿共142张，创作于星期一IPTG;X-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳半乳糖苷糖苷)第51页，讲稿共142张，创作于星期一常用的克隆载体常用的克隆载体噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体(phage)外源外源DNA：923kb常用：常用：EMBL 系列、系列、gt 系列、系列、charon系列系列粘性质粒粘性质粒(cosmid)：DNA的的 cos区区+质粒，双质粒，双链环状链环状DNA，克隆容量：，克隆容量：4050kbM13噬菌体噬菌体第52页，讲稿共142张，创作于星期一第53页，讲稿共142
23、张，创作于星期一第54页，讲稿共142张，创作于星期一第55页，讲稿共142张，创作于星期一噬菌体噬菌体(phage)特点：一种能感染大肠杆菌的病毒，野生特点：一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型为双链线状型为双链线状DNA分子，长度分子，长度48.5kb,分子两端分子两端各有一个各有一个12bp组成的粘性末端组成的粘性末端,感染大肠杆菌感染大肠杆菌后后,线状线状DNA通过粘性末端互补连接成环通过粘性末端互补连接成环,连接连接处称处称COS位点。位点。1.本身有复制体系本身有复制体系;2.中间中间(J-N间间)是是生长非必需区生长非必需区,可被其它外可被其它外源源DNA取代取代;第56页，讲稿共1
24、42张，创作于星期一第57页，讲稿共142张，创作于星期一第58页，讲稿共142张，创作于星期一 3.DNA在体外可包装成病毒颗粒在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高感染效率高;4.载体容量大载体容量大,可装入大片段外源可装入大片段外源DNA(20kb);5.可人工加入多克隆位点可人工加入多克隆位点;6.筛选容易筛选容易噬菌斑筛选噬菌斑筛选;7.主要用于主要用于DNA文库构建文库构建.第59页，讲稿共142张，创作于星期一 插入型载体插入型载体含单一的限制含单一的限制性酶切位点，可接受性酶切位点，可接受10kb以下的以下的外源片段，可用于外源片段，可用于cDNA文库构文库构建；建；取代型载体取代
25、型载体含某一限制性含某一限制性酶的两个切点，可接受酶的两个切点，可接受20kb左右左右的外源片段，可用于基因组的外源片段，可用于基因组DNA文库构建。文库构建。第60页，讲稿共142张，创作于星期一第61页，讲稿共142张，创作于星期一将基因组片段克隆进将基因组片段克隆进lambda置换型载体的基本方法置换型载体的基本方法第62页，讲稿共142张，创作于星期一粘性质粒粘性质粒(cosmid)是一种人工改造的载体是一种人工改造的载体,双链环状双链环状DNA，DNA的的 cos区区+质粒，克隆容量：质粒，克隆容量：40 50kb 1.-DNA的的COS位点及控制包装的序列位点及控制包装的序列;2.
26、质粒的复制起点和抗药性标记质粒的复制起点和抗药性标记(Ampr);3.多种单一的酶切位点多种单一的酶切位点.第63页，讲稿共142张，创作于星期一cos:cohesive-end site特点：特点：第64页，讲稿共142张，创作于星期一 cosmid较小较小,约约4 6kb,可容纳可容纳40-45kb的外源的外源DNA,重组体可象噬菌体重组体可象噬菌体一样进行外壳装配一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进进入宿主细胞后入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选并依赖抗药性被筛选.第65页，讲稿共
27、142张，创作于星期一粘性质粒粘性质粒(Cosmid)第66页，讲稿共142张，创作于星期一优缺点优缺点:1.克隆效率高克隆效率高;2.可利用质粒可利用质粒DNA的方式扩增的方式扩增;3.可克隆较大可克隆较大DNA片段片段;主要用于真核基因的克隆主要用于真核基因的克隆,基基因组文库构建因组文库构建 4.缺点缺点:产生串联现象。产生串联现象。第67页，讲稿共142张，创作于星期一第68页，讲稿共142张，创作于星期一M13噬菌体噬菌体 一种丝状单链噬菌体，闭环一种丝状单链噬菌体，闭环正链正链ssDNA，全长，全长6.5kb,感染大肠感染大肠杆菌后杆菌后,ssDNA 转变为转变为dsDNA,可可用
28、作克隆载体用作克隆载体.最大优点：最大优点：产生单链产生单链DNA,可制可制备单链备单链DNA探针、探针、DNA序列分析序列分析及及DNA的点突变的点突变.第69页，讲稿共142张，创作于星期一第70页，讲稿共142张，创作于星期一RF DNA:replicational form DNA第71页，讲稿共142张，创作于星期一第72页，讲稿共142张，创作于星期一YAC载体（载体（yeast artificial chromosome）酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达达200kb-1000kb，含有酵母第，含有酵母第4号染色体的着丝号染色体的着丝粒粒C
29、EN4、自主复制序列、自主复制序列ARS1和作为端粒的和作为端粒的Tel序列，选择性标志序列，选择性标志URA3、TRP1和和SUP4，能在，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。文库构建。第73页，讲稿共142张，创作于星期一一个典型的一个典型的YAC系列载体系列载体第74页，讲稿共142张，创作于星期一YAC克隆的基本过程克隆的基本过程第75页，讲稿共142张，创作于星期一BAC（bacterial artificial chromosome）细细菌人工染色体菌人工染色体 基于大肠杆菌的基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低质
30、粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS，一个，一个RepE 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座子代细胞的基因座（parA,parB,和和 parC），可容纳外源基因片段长达可容纳外源基因片段长达300kb以上，常用于大的以上，常用于大的染色体基因组染色体基因组DNA文库构建。文库构建。第76页，讲稿共142张，创作于星期一第77页
31、，讲稿共142张，创作于星期一表达载体表达载体(expressing vector)特点：带表达构件特点：带表达构件转录和翻译所需的转录和翻译所需的DNA序列序列大肠杆菌表达载体：含启动子大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体核糖体结合位点结合位点克隆位点克隆位点转录终止信号转录终止信号启动子：启动子：trp-lac(tac)启动子、启动子、噬菌体噬菌体PL启启动子、动子、T7噬菌体启动子噬菌体启动子核糖体结合位点核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子：起始密码子(ATG)和和SD序列序列转录终止序列转录终止序列第78页，讲稿共142张，创作于星期一表达载体
32、包括的元件表达载体包括的元件第79页，讲稿共142张，创作于星期一第80页，讲稿共142张，创作于星期一pET11c表达载体表达载体第81页，讲稿共142张，创作于星期一pT7-7表达载体表达载体第82页，讲稿共142张，创作于星期一哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体真核表达元件：启动子真核表达元件：启动子/增强子增强子克隆位克隆位点点终止信号和加终止信号和加poly(A)信号信号第83页，讲稿共142张，创作于星期一第84页，讲稿共142张，创作于星期一克隆技术克隆技术克克隆隆来来源源与与英英语语“clone”clone”或或“cloning”“cloning”的的音音译译，曾曾译译为为无无性
33、性生生殖殖或或无无性性繁繁殖殖，即即由由同同一一个个祖祖先先细细胞胞分分裂裂而而形形成成的的纯纯细细胞胞系系，这这个个细细胞胞系系每每个个细细胞胞的的基基因彼此是相同的。因彼此是相同的。克隆技术第一个发展时期克隆技术第一个发展时期微生物克隆。微生物克隆。克隆技术第二个发展时期克隆技术第二个发展时期生物技术克隆。生物技术克隆。克隆技术第三个发展时期克隆技术第三个发展时期动物克隆。动物克隆。第85页，讲稿共142张，创作于星期一DNA Cloningi).Restriction endonucleasesii).Cloning vectorsiii).The process of cloning
34、a segment of DNA 第86页，讲稿共142张，创作于星期一 How does one isolate a gene for an inherited disorder?There are three options:Start with a candidate proteinDNA protein Start with a candidate mRNADNAmRNA Direct positional cloningDNAAll three options require the cloning of DNA.DNA mRNA protein第87页，讲稿共142张，创作于星期一
35、4-base cutter:cuts DNA into 256 bp average-sized fragments in a random sequenceevery 256 bp:NO256 bp average-size fragments:YESBar=256 bpRestriction endonucleases第88页，讲稿共142张，创作于星期一Products generated by restriction enzymes COHESIVE ENDSEcoRI5GAATTC3 5GAATTC33CTTAAG5 3CTTAA G5PstI5CTGCAG35CTGCA G33GA
36、CGTC5 3GACGTC5 BLUNT ENDSHaeIII 5GGCC3 5GG CC33CCGG5 3CC GG5第89页，讲稿共142张，创作于星期一Formation of recombinant DNA moleculescut DNAsmix together fragments and anneal cohesive endsseal 3,5 ends by DNA ligaserecombinant DNAs第90页，讲稿共142张，创作于星期一Vectors used in molecular cloningVector Insert (and host)Character
37、istics size rangePlasmid Small circular DNA phage)plaques form as a consequence of a spreading lytic infectionstarting with a single phage-infected bacterial cell each phage plaque is a clone of identical recombinant phage prepare replica of phage plaques and hybridize DNA with probeE.coli lawn is g
38、rown on agar plate and thenoverlayered with the recombinant phage library.Wherever a single bacteriophage particleinfects a bacteria cell,a plaque will form.This is a clear area caused by the lysisof bacteria on the lawn of E.coli.A replica of the agar plate is made on anitrocellulose sheet-the DNA
39、is denaturedand adheres to the nitrocellulose.The nitrocellulose is hybridized with a labeledDNA probe(such as an oligonucleotide)andthe nitrocellulose is exposed to X-ray film.X-ray film第110页，讲稿共142张，创作于星期一Labeled probe in solutione.g.an oligo probe32P labelHybridization of probe toimmobilized DNA
40、Probe hybridized to immobilized DNAforming double-stranded region第111页，讲稿共142张，创作于星期一 How does one isolate a gene for an inherited disorder?Start with a candidate proteinDNAprotein If a protein candidate has been identified for a genetic disease it can be used to make a probe to screen for the gene1
41、.oligonucleotide probe purify the protein of interest partially sequence the protein find a region having amino acids with the fewest possible codons predict a DNA sequence that could represent a gene regionencoding a portion of the protein synthesize a set of degenerate oligonucleotides for that re
42、gion hybridize the labeled oligonucleotide to the phage libraryMET.GLU.PHE.TYR.ILE.CYS.GLN.LYS amino acidsAUG.GAA.UUU.UAU.AUU.UGU.CAA.AAA G C C C C G G all possible A oligonucleotides 1 X 2 X 2 X 2 X 3 X 2 X 2 X 2=192-fold degenerate第112页，讲稿共142张，创作于星期一2.antibody probe purify the protein of interest
43、 make an antibody to that protein construct cDNA library to express recombinant proteins in E.coli use the antibody to detect the protein being made from the cloned cDNA encoded by the recombinant phage in E.coli using plaque hybridization method modified for antibody probesleft armright armbacteria
44、l promoter and Shine-Dalgarno sequencehuman cDNA insert第113页，讲稿共142张，创作于星期一 How does one isolate a gene for an inherited disorder?Start with a candidate mRNADNAmRNA mRNA candidates can be identified by comparing mRNA populations between normal and abnormal tissues,or by looking for a specific functi
45、on encoded by the mRNA1.differential cDNA library screening prepare duplicate plaque replica plates hybridize one with a labeled cDNA probe made to all the mRNAsin the normal cell and hybridize the other(duplicate)with thecorresponding probe to the abnormal cell differences in cell function should b
46、e reflected by differencesin the mRNA populations any plaques showing differential hybridization are candidates hybridization with cDNA probe from normal cellshybridization with cDNA probe from abnormal cellsdifferentially expressed clonenohybrid-izationto thisplaque第114页，讲稿共142张，创作于星期一第115页，讲稿共142张
47、，创作于星期一2.expression screening develop a cell-based functional assay for the abnormality (e.g.,a transport assay)construct cDNA library in a way that will allow expression of protein in mammalian cells inject groups of cDNA clones into cells and assay function narrow down cDNA clones using smaller gr
48、oups of clones until the function is observed with a single cDNA species inject groups of cDNA clones if the function being assayed is observed,divide the group of clones into smaller groups and retest continue process of testing smaller groups until the function being assayed is obtained with one c
49、lone for example,inject clones and test cells for transport activityleft armright armhuman cDNA insertmammalian promoter第116页，讲稿共142张，创作于星期一克隆基因的表达克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件；载体有转录、翻译的元件；密码子通用密码子通用原核表达体系原核表达体系 原核表达载体的标准原核表达载体的标准*合适的筛选标志合适的筛选标志*强启动子强启动子*翻译控制序列翻译控制序列*多克隆位点多克隆位点第117页，讲稿共142张，创作于星期一融合蛋白（融合蛋白（fus
50、ion protein,包涵体）包涵体）表达的蛋白质或多肽的表达的蛋白质或多肽的N末端由原核末端由原核DNA编码，编码，C末断由克隆的真核末断由克隆的真核DNA编码。编码。大肠杆菌表达体系的不足大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性很难表达大量的可溶性蛋白很难表达大量的可溶性蛋白第118页，讲稿共142张，创作于星期一第119页，讲稿共142张，创作于星期一真核表达体系真核表达体系转染方法转染方法磷酸钙沉淀磷