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1、关于分子生物学基因治疗关于分子生物学基因治疗第1页，讲稿共45张，创作于星期日一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念19901990人类第一例基因治疗获得人类第一例基因治疗获得人类第一例基因治疗获得人类第一例基因治疗获得成功成功成功成功19661966年，年，年，年，LederbergLederberg提出基因治疗概念提出基因治疗概念基因治疗基因治疗(gene therapy)gene therapy)：将正常基因植入靶细胞代替遗将正常基因植入靶细胞代替遗将正常基因植入靶细胞代替遗将正常基因植入靶细胞代替遗传缺陷的基因传缺陷的基因传缺陷的基因传缺陷的基因,或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预或关
2、闭、抑制异常表达的基因，以达到预或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预防和治疗疾病的一种临床治疗技术。防和治疗疾病的一种临床治疗技术。防和治疗疾病的一种临床治疗技术。防和治疗疾病的一种临床治疗技术。人类疾病治疗的重大突破人类疾病治疗的重大突破人类疾病治疗的重大突破人类疾病治疗的重大突破!与传统的方法相比较，从根与传统的方法相比较，从根与传统的方法相比较，从根与传统的方法相比较，从根本上消除遗传病因。本上消除遗传病因。本上消除遗传病因。本上消除遗传病因。第2页，讲稿共45张，创作于星期日二、基因治疗类型和途径二、基因治疗类型和途径生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗
3、生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗(germinal gene thrapy)体外（体外（体外（体外（ex vivoex vivo）间接基因治疗间接基因治疗间接基因治疗间接基因治疗 体细胞基因治疗体细胞基因治疗体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic gene thrapy)somatic gene thrapy)1 1、类型、类型、类型、类型2、途径、途径 体内（体内（体内（体内（in vivoin vivo）直接基因治疗直接基因治疗直接基因治疗直接基因治疗第3页，讲稿共45张，创作于星期日1 1、基因矫正：、基因矫正：、基因矫正：、基因矫正：原位修复缺陷基因原位修复缺陷基因原位修复缺陷
4、基因原位修复缺陷基因原位替换（同源重组）原位替换（同源重组）2、基因添加：、基因添加：、基因添加：、基因添加：正常基因非特异插入基因组以补偿正常基因非特异插入基因组以补偿正常基因非特异插入基因组以补偿正常基因非特异插入基因组以补偿 异常基因的功能缺陷异常基因的功能缺陷异常基因的功能缺陷异常基因的功能缺陷3 3、基因失活：、基因失活：、基因失活：、基因失活：抑制、关闭异常表达的基抑制、关闭异常表达的基抑制、关闭异常表达的基抑制、关闭异常表达的基 因因因因矫正突变矫正突变矫正突变矫正突变三、基因治疗的策略三、基因治疗的策略4 4、重新开放已关闭的基因、重新开放已关闭的基因、重新开放已关闭的基因、重
5、新开放已关闭的基因第4页，讲稿共45张，创作于星期日四、基因治疗的方法四、基因治疗的方法（一）体细胞的基因治疗方法（一）体细胞的基因治疗方法（一）体细胞的基因治疗方法（一）体细胞的基因治疗方法 2 2、受体细胞的选择受体细胞的选择 3、将治疗转移到受体细胞内将治疗转移到受体细胞内 4 4、将带有目的基因的细胞重新输回体内将带有目的基因的细胞重新输回体内将带有目的基因的细胞重新输回体内将带有目的基因的细胞重新输回体内体外基因治疗时体外基因治疗时体外基因治疗时体外基因治疗时（二）反义技术（二）反义技术（二）反义技术（二）反义技术（antisense technology)antisense tec
6、hnology)（三）（三）（三）（三）RNARNA干扰（干扰（short interference RNA)short interference RNA)1 1、治疗基因的制备治疗基因的制备治疗基因的制备治疗基因的制备第5页，讲稿共45张，创作于星期日五、基因治疗的现状五、基因治疗的现状1 1、一些单基因病的治疗、一些单基因病的治疗、一些单基因病的治疗、一些单基因病的治疗 严重复合免疫缺陷症（严重复合免疫缺陷症（严重复合免疫缺陷症（严重复合免疫缺陷症（ADAADA综合症）、血友病综合症）、血友病B B B B、囊性纤囊性纤维化（维化（CFCFCFCF），），），），苯丙酮尿症等苯丙酮尿症等苯
7、丙酮尿症等苯丙酮尿症等2 2、Bata-Bata-Bata-Bata-地中海贫血病地中海贫血病地中海贫血病地中海贫血病 别醇嘌呤重新开放别醇嘌呤重新开放别醇嘌呤重新开放别醇嘌呤重新开放r r r r基因基因基因基因3 3 3 3、多基因病、多基因病、多基因病、多基因病心血管疾病，糖尿病、神经系统疾病等心血管疾病，糖尿病、神经系统疾病等心血管疾病，糖尿病、神经系统疾病等心血管疾病，糖尿病、神经系统疾病等4 4 4 4、肿瘤、肿瘤、肿瘤、肿瘤5 5 5 5、其它疾病：、其它疾病：、其它疾病：、其它疾病：HIVHIVHIVHIV第6页，讲稿共45张，创作于星期日六、基因治疗的问题、前景六、基因治疗的
8、问题、前景问题：问题：问题：问题：1 1、稳定性稳定性稳定性稳定性 2 2、安全性、安全性、安全性、安全性 3 3、导入基因的高效表达、导入基因的高效表达、导入基因的高效表达、导入基因的高效表达 4 4、免疫性、免疫性、免疫性、免疫性 5 5、伦理问题、伦理问题、伦理问题、伦理问题 前景：前景：前景：前景：十分有潜力的技术，有深远的意义十分有潜力的技术，有深远的意义 “基因治疗作为一项新的治疗技术，将不只限于遗传病和基因治疗作为一项新的治疗技术，将不只限于遗传病和基因治疗作为一项新的治疗技术，将不只限于遗传病和基因治疗作为一项新的治疗技术，将不只限于遗传病和肿瘤的治疗，在可见的将来，它将是临床
9、上多种疾病可选择的肿瘤的治疗，在可见的将来，它将是临床上多种疾病可选择的肿瘤的治疗，在可见的将来，它将是临床上多种疾病可选择的肿瘤的治疗，在可见的将来，它将是临床上多种疾病可选择的治疗方法。治疗方法。治疗方法。治疗方法。”第7页，讲稿共45张，创作于星期日应用腺苷脱应用腺苷脱应用腺苷脱应用腺苷脱 氨酶基因氨酶基因氨酶基因氨酶基因ADAADA，经经逆转录病毒逆转录病毒载体导入载体导入严重复合免疫缺陷症（严重复合免疫缺陷症（SCID）第8页，讲稿共45张，创作于星期日遗传病的常规治疗遗传病的常规治疗（一）外科治疗一）外科治疗 矫正畸形、组织和器官移植矫正畸形、组织和器官移植矫正畸形、组织和器官移植
10、矫正畸形、组织和器官移植 （二）内科治疗（二）内科治疗（二）内科治疗（二）内科治疗 用药物及饮食治疗用药物及饮食治疗 1、禁其所忌禁其所忌禁其所忌禁其所忌 酶缺乏不能对底物进行正常代谢酶缺乏不能对底物进行正常代谢酶缺乏不能对底物进行正常代谢酶缺乏不能对底物进行正常代谢 的遗传病。的遗传病。的遗传病。的遗传病。2、去其所余去其所余 酶缺乏使体内贮存过多的酶缺乏使体内贮存过多的“毒物毒物”所致的遗传病所致的遗传病所致的遗传病所致的遗传病 促排泄剂或螯合剂促排泄剂或螯合剂促排泄剂或螯合剂促排泄剂或螯合剂 、换血或血浆过滤等、换血或血浆过滤等、换血或血浆过滤等、换血或血浆过滤等 3 3、补其不足补其不
11、足补其不足补其不足 由于基因缺陷使体内缺乏某种酶和蛋白质而导致由于基因缺陷使体内缺乏某种酶和蛋白质而导致功能丧失的遗传病。功能丧失的遗传病。第9页，讲稿共45张，创作于星期日第10页，讲稿共45张，创作于星期日第11页，讲稿共45张，创作于星期日ACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAAACGTCGGTGCGTCGCTTTGCAGCCACGCAGCGAACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAA突变基因原位修复突变基因原位修复突变基因原位修复突变基因原位修复突变突变修复修复修复修复第12页，讲稿共45张，创作于星期日带异常基因的染带异常基因的染
12、色体色体DNADNA分子分子分子分子带正常基因的带正常基因的带正常基因的带正常基因的外源同源片段外源同源片段外源同源片段外源同源片段同源重组过程同源重组过程同源重组过程同源重组过程第13页，讲稿共45张，创作于星期日添加正常基因添加正常基因第14页，讲稿共45张，创作于星期日使使使使 重新表达，形成重新表达，形成重新表达，形成重新表达，形成HbFHbFHbFHbF,HbF,HbF代偿代偿HbAHbAHbAHbA的功能。的功能。第15页，讲稿共45张，创作于星期日目的基因的制备方法目的基因的制备方法1 1、从基因组中分离、从基因组中分离、从基因组中分离、从基因组中分离2 2、化学合成、化学合成、
13、化学合成、化学合成3 3、用、用、用、用mRNA逆转录合成逆转录合成逆转录合成逆转录合成cDNAcDNA4 4、从基因文库中筛选从基因文库中筛选5、PCRPCR合成合成第16页，讲稿共45张，创作于星期日受体细胞的选择受体细胞的选择 选择受体细胞的原则：选择受体细胞的原则：1 1、易于从人体分离又便于输回体内、易于从人体分离又便于输回体内、易于从人体分离又便于输回体内、易于从人体分离又便于输回体内 2 2、易于接受外源的遗传物质、易于接受外源的遗传物质、易于接受外源的遗传物质、易于接受外源的遗传物质 3 3、能够分裂，生命周期长、能够分裂，生命周期长、能够分裂，生命周期长、能够分裂，生命周期长
14、 4、患病的器官或部位。、患病的器官或部位。常用的受体细胞：常用的受体细胞：常用的受体细胞：常用的受体细胞：骨髓干细胞骨髓干细胞骨髓干细胞骨髓干细胞 皮肤纤纬细胞皮肤纤纬细胞皮肤纤纬细胞皮肤纤纬细胞 血管内皮细胞血管内皮细胞血管内皮细胞血管内皮细胞 肝细胞肝细胞肝细胞肝细胞 淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞第17页，讲稿共45张，创作于星期日治疗基因的转移方法治疗基因的转移方法3、腺相关病毒、腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)4、单疱疹病毒、单疱疹病毒(Herpes simplex viruses,HSVHerpes simplex viruses,HSV)化学
15、法化学法化学法化学法 磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀物理法物理法 微粒轰击、电穿孔法微粒轰击、电穿孔法、显微注射、显微注射 脂质体法脂质体法生物法生物法 将病毒（将病毒（virus)改造成缺陷病毒载体改造成缺陷病毒载体1、逆转录病毒载体（、逆转录病毒载体（RetrovirusesRetroviruses)2、腺病毒介导的基因转移（、腺病毒介导的基因转移（AdenovirusesAdenoviruses）第18页，讲稿共45张，创作于星期日脂质体法脂质体法脂质体法脂质体法优点：优点：易大量制备易大量制备无致病性无致病性无致病性无致病性细胞类型多细胞类型多细胞类型多细胞类型多治疗过程可控治疗过程可控缺点
16、：缺点：缺点：缺点：转化效率不高转化效率不高转化效率不高转化效率不高血循中快速清除血循中快速清除(肝巨噬细胞肝巨噬细胞)第19页，讲稿共45张，创作于星期日第20页，讲稿共45张，创作于星期日逆转录病毒的改造逆转录病毒的改造逆转录病毒的改造逆转录病毒的改造第21页，讲稿共45张，创作于星期日逆转录病毒感染细胞过程逆转录病毒感染细胞过程逆转录病毒感染细胞过程逆转录病毒感染细胞过程第22页，讲稿共45张，创作于星期日逆转录介导基因转移的优缺点逆转录介导基因转移的优缺点优点：优点：优点：优点：1 1、能高效率的感染宿主细胞（能高效率的感染宿主细胞（能高效率的感染宿主细胞（能高效率的感染宿主细胞（10
17、0%100%100%100%）2 2 2 2、其宿主范围广泛，包括来自不同种的生物和细胞类型、其宿主范围广泛，包括来自不同种的生物和细胞类型、其宿主范围广泛，包括来自不同种的生物和细胞类型、其宿主范围广泛，包括来自不同种的生物和细胞类型3 3 3 3、被整合的基因在宿主基因组中稳定表达、被整合的基因在宿主基因组中稳定表达、被整合的基因在宿主基因组中稳定表达、被整合的基因在宿主基因组中稳定表达4 4、用复制缺陷的重组逆转录病毒感染，毒性小、用复制缺陷的重组逆转录病毒感染，毒性小缺点：缺点：1 1 1 1、只能感染分裂细胞、只能感染分裂细胞、只能感染分裂细胞、只能感染分裂细胞2 2 2 2、其外源
18、、其外源、其外源、其外源DNADNA的容量太小的容量太小的容量太小的容量太小3 3、安全性问题（激活癌基因的潜在性）、安全性问题（激活癌基因的潜在性）第23页，讲稿共45张，创作于星期日腺病毒感染细胞的过程腺病毒感染细胞的过程腺病毒感染细胞的过程腺病毒感染细胞的过程第24页，讲稿共45张，创作于星期日腺病毒介导基因转移的优缺点腺病毒介导基因转移的优缺点优点：优点：1 1、具有较广的宿主范围，能感染除造血细胞以外的几乎具有较广的宿主范围，能感染除造血细胞以外的几乎具有较广的宿主范围，能感染除造血细胞以外的几乎具有较广的宿主范围，能感染除造血细胞以外的几乎所有细胞所有细胞所有细胞所有细胞2 2、可
19、以感染分裂及非分裂细胞可以感染分裂及非分裂细胞可以感染分裂及非分裂细胞可以感染分裂及非分裂细胞3 3、能高效地感染宿主细胞能高效地感染宿主细胞能高效地感染宿主细胞能高效地感染宿主细胞4 4、外源基因容量大、外源基因容量大、外源基因容量大、外源基因容量大5、安全性较高（不引起癌基因激活）、安全性较高（不引起癌基因激活）缺点：缺点：缺点：缺点：1 1、技术上需进一步改进技术上需进一步改进技术上需进一步改进技术上需进一步改进 2 2 2 2、不整合到人类基因组、不整合到人类基因组、不整合到人类基因组、不整合到人类基因组 腺病毒是基因治疗载体的发展方向。腺病毒是基因治疗载体的发展方向。腺病毒是基因治疗
20、载体的发展方向。腺病毒是基因治疗载体的发展方向。第25页，讲稿共45张，创作于星期日1 1、野生型的、野生型的AAVAAV为非病原性，其安全性高为非病原性，其安全性高2 2、AAVAAV病毒颗粒的物理化学性质较为稳定病毒颗粒的物理化学性质较为稳定3 3、应用宿主范围较广，使用于分裂及非分裂细胞、应用宿主范围较广，使用于分裂及非分裂细胞4 4、可整合入宿主染色体上，可长期表达目的蛋白、可整合入宿主染色体上，可长期表达目的蛋白腺相关病毒载体腺相关病毒载体优点：优点：缺点：缺点：缺点：缺点：重组重组AAV的制作较为繁杂、的制作较为繁杂、效率低，滴度效率低，滴度效率低，滴度效率低，滴度 低低低低第26
21、页，讲稿共45张，创作于星期日单疱疹病毒载体单疱疹病毒载体优点优点 具有对神经元的特异的亲和力具有对神经元的特异的亲和力 可插入的基因片段容量很大，可达可插入的基因片段容量很大，可达40-50kb40-50kb缺点缺点 对细胞有较大的毒性对细胞有较大的毒性第27页，讲稿共45张，创作于星期日反义技术反义技术 反义技术反义技术反义技术反义技术（antisense technology)也称反义寡核也称反义寡核也称反义寡核也称反义寡核苷酸苷酸苷酸苷酸,是指利用人工合成的反义是指利用人工合成的反义是指利用人工合成的反义是指利用人工合成的反义RNA或反义或反义或反义或反义DNADNA来阻来阻断基因的转
22、录或翻译，控制细胞生长的中间阶段，断基因的转录或翻译，控制细胞生长的中间阶段，断基因的转录或翻译，控制细胞生长的中间阶段，断基因的转录或翻译，控制细胞生长的中间阶段，使基因不能转录或翻译，因而不能合成蛋白质，以使基因不能转录或翻译，因而不能合成蛋白质，以使基因不能转录或翻译，因而不能合成蛋白质，以使基因不能转录或翻译，因而不能合成蛋白质，以达到治疗某中疾病的目的。达到治疗某中疾病的目的。达到治疗某中疾病的目的。达到治疗某中疾病的目的。(1)(1)将将将将cDNAcDNA导入基因组中，转录得反义导入基因组中，转录得反义导入基因组中，转录得反义导入基因组中，转录得反义RNA(2)(2)直接输入反义
23、寡核苷酸直接输入反义寡核苷酸直接输入反义寡核苷酸直接输入反义寡核苷酸二、二、二、二、反义基因技术（阻断转录）反义基因技术（阻断转录）反义基因技术（阻断转录）反义基因技术（阻断转录）类型：类型：类型：类型：1 1、反义反义反义反义RNARNA技术（阻断翻译）技术（阻断翻译）技术（阻断翻译）技术（阻断翻译）第28页，讲稿共45张，创作于星期日*第29页，讲稿共45张，创作于星期日*第30页，讲稿共45张，创作于星期日转录阻断转录阻断反基因技术示意图反基因技术示意图反基因技术示意图反基因技术示意图第31页，讲稿共45张，创作于星期日第32页，讲稿共45张，创作于星期日正常细胞正常细胞(无细胞毒性无细
24、胞毒性无细胞毒性无细胞毒性)胞嘧啶脱氨胞嘧啶脱氨胞嘧啶脱氨胞嘧啶脱氨酶基因酶基因酶基因酶基因erbB-2erbB-2启动子启动子启动子启动子5-5-FCFC5-5-FCFC5-5-FUFU(细胞毒性细胞毒性细胞毒性细胞毒性)肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤特异性肿瘤特异性肿瘤特异性肿瘤特异性高表达因子高表达因子高表达因子高表达因子药物靶向治疗肿瘤药物靶向治疗肿瘤药物靶向治疗肿瘤药物靶向治疗肿瘤细胞死亡细胞死亡细胞死亡细胞死亡第33页，讲稿共45张，创作于星期日RNARNA干扰（干扰（干扰（干扰（RNA interference RNAi)RNA interference RNAi)2003
25、2003年年年年1010大科学进展大科学进展大科学进展大科学进展-第四第四第四第四(Science)正常生物体内一些小的双链正常生物体内一些小的双链正常生物体内一些小的双链正常生物体内一些小的双链RNARNA可以抑制特定基因表达的可以抑制特定基因表达的一种现象。一种现象。当细胞中导入与内源性当细胞中导入与内源性当细胞中导入与内源性当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的小双编码区同源的小双编码区同源的小双编码区同源的小双链链链链RNA(double stranded RNARNA(double stranded RNA，dsRNA)dsRNA)时，可以通过促使该时，可以通过促使该时，可以通过促
26、使该时，可以通过促使该mRNAmRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因的表达，从而降解来高效、特异的阻断体内特定基因的表达，从而降解来高效、特异的阻断体内特定基因的表达，从而降解来高效、特异的阻断体内特定基因的表达，从而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默又称为转录后基因沉默又称为转录后基因沉默又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencingpost-transcri
27、ptional gene silencing，PTGS)PTGS)。这些小的双链这些小的双链这些小的双链这些小的双链RNARNA称为称为称为称为siRNA(Small/short interfering siRNA(Small/short interfering RNARNA，siRNA)siRNA)。第34页，讲稿共45张，创作于星期日RISC:RISC:RNA-inducedRNA-induced silencing complex silencing complex RNA RNA诱导沉默复合物诱导沉默复合物诱导沉默复合物诱导沉默复合物第35页，讲稿共45张，创作于星期日RNAi in
28、gene therapy第36页，讲稿共45张，创作于星期日基因治疗的现状基因治疗的现状基因治疗的现状基因治疗的现状-1-1-1-1第37页，讲稿共45张，创作于星期日基因治疗的现状基因治疗的现状-2-2第38页，讲稿共45张，创作于星期日基因治疗的现状基因治疗的现状基因治疗的现状基因治疗的现状-3-3-3-3第39页，讲稿共45张，创作于星期日基因治疗的现状基因治疗的现状-4-4第40页，讲稿共45张，创作于星期日基因治疗的现状基因治疗的现状基因治疗的现状基因治疗的现状-5-5第41页，讲稿共45张，创作于星期日基因治疗的现状基因治疗的现状基因治疗的现状基因治疗的现状-6-6第42页，讲稿共
29、45张，创作于星期日Hemophilia BHemophilia B,FIX function reduced,X-linkedFIX function reduced,X-linkedMales to bleed after circumcision第一例临床实验第一例临床实验第一例临床实验第一例临床实验中国上海中国上海中国上海中国上海1995-19961995-1996年年年年载体载体载体载体AAVAAV自体皮肤成纤维细胞自体皮肤成纤维细胞自体皮肤成纤维细胞自体皮肤成纤维细胞两名血友病两名血友病两名血友病两名血友病B B患者患者患者患者(兄弟兄弟兄弟兄弟),),先后治疗了先后治疗了先后治疗
30、了先后治疗了四名患者四名患者四名患者四名患者FIXFIX水平升高水平升高水平升高水平升高2 2倍并持续了倍并持续了倍并持续了倍并持续了1 1年以上年以上年以上年以上 2003 2003年年年年获获得国家批准得国家批准得国家批准得国家批准进进行行行行中中中中国国国国首次首次首次首次AAVAAV基因治基因治基因治基因治疗疗血友病血友病血友病血友病B B临临床床床床试验试验中国的基因治疗中国的基因治疗中国的基因治疗中国的基因治疗第43页，讲稿共45张，创作于星期日AAV based gene therapy for AAV based gene therapy for hemophilia Bhem
31、ophilia B1 1.Viral genes are removed from AAV Viral genes are removed from AAV 2.2.A gene for blood clotting protein A gene for blood clotting protein Factor IX is placed inside the Factor IX is placed inside the empty AAV empty AAV 3.3.The Factor IX-bearing viruses are The Factor IX-bearing viruses
32、 are injected into the thigh muscle injected into the thigh muscle 4.4.The viruses infect muscle cells,and The viruses infect muscle cells,and the gene begins to produce the the gene begins to produce the Factor IX protein that allows the Factor IX protein that allows the blood to clot.blood to clot.血友病血友病B的治疗方法的治疗方法的治疗方法的治疗方法中国的基因治疗中国的基因治疗中国的基因治疗中国的基因治疗第44页，讲稿共45张，创作于星期日感谢大家观看2022/10/12第45页，讲稿共45张，创作于星期日