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1、关于蛋白质测定凯氏定氮法第一页，讲稿共二十二页哦【基础知识基础知识】蛋白质概述蛋白质概述蛋白质是食品营养价值的重要指标，含蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区别其他有是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量接近，一般来说，机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量接近，一般来说，pro的平均含氮量为的平均含氮量为16%，即一份氮相当于，即一份氮相当于6.25份蛋白质，份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。此数值称为蛋白质系数。注意：注意：不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为青豆、鸡蛋等为6.25，花生为，
2、花生为5.46，大米为，大米为5.95，大豆及，大豆及其制品为其制品为5.71，小麦粉为，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、燕麦、裸、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是麦和小米是5.83；硬果类为；硬果类为5.30；牛乳及其制品为牛乳及其制品为6.38。第二页，讲稿共二十二页哦【一、实验目的一、实验目的】1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。2、学会使用凯氏定氮装置。、学会使用凯氏定氮装置。3、了解蛋白质系数在蛋白质含量计算中的应用。、了解蛋白质系数在蛋白质含量计算中的应用。蛋白质是食品营养价值的重要指标。测量食品中蛋白质蛋白质是食品营养价值的重
3、要指标。测量食品中蛋白质的含量对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资的含量对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、指导生产、优化食品配方、提高产品质量具有重要源、指导生产、优化食品配方、提高产品质量具有重要的意义。的意义。第三页，讲稿共二十二页哦注意注意：此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗粗pro。【二、原理二、原理】第四页，讲稿共二十二页哦1、消化、消化仪器及试剂的准备仪器及试剂的准备仪器：仪器：【三、实验步骤三、实
4、验步骤】第五页，讲稿共二十二页哦试剂试剂作用作用硫酸铜硫酸铜a催化作用催化作用：加速有机物的氧化分解。：加速有机物的氧化分解。b消化完全的指示剂消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；：蓝绿色，澄清，透明；c蒸馏时碱性反应的指示剂蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀：变深蓝色或产生黑色沉淀硫酸钾硫酸钾提高溶液沸点提高溶液沸点，从而加快有机物分解，从而加快有机物分解 浓硫酸浓硫酸氧化作用氧化作用：有机物质氧化分解为：有机物质氧化分解为H2O和和CO2样品预处理样品预处理固体试样固体试样 0.22g半固体试样半固体试样 25g液体试样液体试样 1025g样品充分混匀样品充分混匀直接消化直接
5、消化第六页，讲稿共二十二页哦样品称量、消化样品称量、消化1.000g1.000g奶粉奶粉0.2g0.2g硫酸铜硫酸铜6g6g硫酸钾硫酸钾20mL20mL浓硫酸浓硫酸玻璃珠玻璃珠小火加热炭化小火加热炭化至泡沫完全停止至泡沫完全停止轻摇轻摇 大火加热大火加热保持瓶中液体微沸保持瓶中液体微沸至蓝绿色澄清透明至蓝绿色澄清透明继续加热继续加热0.51h冷却冷却加加20mL水水冷却冷却同时做试剂同时做试剂空白试验空白试验第七页，讲稿共二十二页哦第八页，讲稿共二十二页哦2、蒸馏、吸收、蒸馏、吸收仪器及试剂的准备仪器及试剂的准备仪器：仪器：100mL 3只只 试剂（混合指示剂）：试剂（混合指示剂）：2 2份份
6、甲基红乙醇甲基红乙醇液（液（1g/L1g/L）与）与1 1份份亚甲基蓝乙醇亚甲基蓝乙醇液（液（1g/L1g/L）临用）临用时混合。指示剂在碱性溶液中呈时混合。指示剂在碱性溶液中呈绿色绿色,在中性溶液中呈在中性溶液中呈灰色灰色,在酸在酸性溶液中呈性溶液中呈红色红色。第九页，讲稿共二十二页哦凯氏定氮蒸馏装置凯氏定氮蒸馏装置传统装置传统装置1：电炉：电炉2：水蒸气发生器：水蒸气发生器3：螺旋夹：螺旋夹4：小玻杯及棒状玻塞：小玻杯及棒状玻塞5：反应室：反应室6：反应室外层：反应室外层7：橡皮管及螺旋夹：橡皮管及螺旋夹8：冷凝管：冷凝管9：蒸馏液接收瓶：蒸馏液接收瓶第十页，讲稿共二十二页哦水蒸气发生器：
7、水蒸气发生器：装水至装水至2/32/3处，加入数粒处，加入数粒玻璃珠玻璃珠，加，加甲基红乙醇指示剂甲基红乙醇指示剂数滴及数滴及硫酸硫酸数数mlml，使水呈微红色（保持酸性以防水中，使水呈微红色（保持酸性以防水中氨的逸出）氨的逸出）按上图所示搭好装置按上图所示搭好装置第十一页，讲稿共二十二页哦蒸馏及吸收蒸馏及吸收n10.0mL10.0mL硼酸溶液硼酸溶液100mL100mL三角瓶三角瓶加加1 12 2滴混合指示剂滴混合指示剂 冷凝冷凝管下端插入三角瓶液面下管下端插入三角瓶液面下准确吸取准确吸取10mL10mL试样试样由小玻杯流入反由小玻杯流入反应室应室少量水洗涤小漏斗少量水洗涤小漏斗盖紧玻璃塞盖
8、紧玻璃塞 量筒取量筒取10.0mLNaOH10.0mLNaOH溶液溶液倒入小玻杯倒入小玻杯提起玻塞使其缓慢流入反应室提起玻塞使其缓慢流入反应室立即塞紧立即塞紧玻璃塞玻璃塞加水于小玻杯防漏气加水于小玻杯防漏气 通蒸汽通蒸汽颜色变化时开始颜色变化时开始计时蒸馏计时蒸馏5min 5min 移动接受瓶使液面离开冷凝管下端移动接受瓶使液面离开冷凝管下端再蒸馏再蒸馏1min1min 用少量水冲洗冷凝管下端外部用少量水冲洗冷凝管下端外部取下接收瓶取下接收瓶第十二页，讲稿共二十二页哦注意注意加加NaOH一定要过量一定要过量，此时溶液生成，此时溶液生成深蓝色深蓝色或黑色或黑色沉淀沉淀为为防止样液中氨气逸出。防止
9、样液中氨气逸出。一是要水封，二要夹紧废液蝴蝶夹后再一是要水封，二要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，三要注意接头处有无松漏现象通蒸汽，三要注意接头处有无松漏现象硼酸吸收液的颜色硼酸吸收液的颜色反应室中溶液的颜色反应室中溶液的颜色第十三页，讲稿共二十二页哦 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸收液温度不应超过收液温度不应超过4040，避免氨气逸出，避免氨气逸出，若超过时可置于若超过时可置于冷水浴中使用。冷水浴中使用。在蒸馏时，在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断，蒸馏过程中不得停火断汽汽,否则会发生否则会发生倒吸倒吸
10、。蒸馏完毕后，先将冷凝管下端离开液面，再蒸蒸馏完毕后，先将冷凝管下端离开液面，再蒸1 1分钟，分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，开，最后关闭电源最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生发生倒吸倒吸。所用的试剂溶液所用的试剂溶液 必须用必须用无氨蒸馏水无氨蒸馏水配制。配制。第十四页，讲稿共二十二页哦 3、盐酸滴定、盐酸滴定接收瓶接收瓶 以以HCL标准滴定液滴定标准滴定液滴定 灰色终点灰色终点 记录记录VHcl（1 1）硼酸吸收液的）硼酸吸收液的颜色颜色（2 2）吸收氨气后的）吸收氨
11、气后的硼酸吸收液的颜色硼酸吸收液的颜色（3 3）盐酸滴定终点）盐酸滴定终点的颜色的颜色第十五页，讲稿共二十二页哦项目名称项目名称检测日期检测日期样品名称样品名称检验依据检验依据内容内容1 12 23 3 空白空白样品质量样品质量m/gm/gV V初初 /mL/mLV V终终 /mLmL消耗的体积消耗的体积V V1 1 /mL /mL吸取消化液体积吸取消化液体积V V3 3 /mL/mL蛋白质含量（蛋白质含量（g/100gg/100g）平均值（平均值（g/100gg/100g）（g/100gg/100g）F F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数：牛乳及其制品的蛋白质换算系数6.386.38【四、数据
12、记录与计算四、数据记录与计算】第十六页，讲稿共二十二页哦n有效数字：有效数字：n蛋白质含量蛋白质含量1 g/100 g时，结果保留时，结果保留三位三位有效数字有效数字n蛋白质含量蛋白质含量1 g/100 g时，结果保留时，结果保留两位两位有效数字。有效数字。n精密度：精密度：n在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的平均值的10%（g/100g）第十七页，讲稿共二十二页哦小结小结步骤步骤反应前后颜色变化反应前后颜色变化湿法消化湿法消化凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）加硫加硫酸炭化黑色酸炭化黑
13、色消化后红棕色消化后红棕色 棕褐色棕褐色消消化终点蓝绿色化终点蓝绿色/墨绿色墨绿色淡蓝色（冷却后溶淡蓝色（冷却后溶液）液）碱化蒸馏碱化蒸馏反应室：深蓝色或黑色沉淀反应室：深蓝色或黑色沉淀硼酸吸收硼酸吸收紫红色紫红色绿色绿色盐酸滴定盐酸滴定甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色灰色灰色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色蓝紫色蓝紫色第十八页，讲稿共二十二页哦n凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测定，但凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非因样品中含有核酸、生物碱、
14、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白质含量。粗蛋白质含量。n若要测定样品的蛋白氮若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入则需要向样品中加入三氯乙酸三氯乙酸溶液溶液,使使其最终浓度为其最终浓度为5%,5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋白质含量进一步计算出蛋白质含量:蛋白氮蛋白氮=总氮总氮-非蛋白氮非蛋白氮第十九页，讲稿共二十二页哦l准准确确称称取取某某乳乳粉粉样样品品0.8000.800克克，经经凯凯氏氏法法消消化化定定容
15、容至至100ml100ml，移移取取5ml5ml消消化化液液进进行行蒸蒸馏馏，用用20ml20ml硼硼酸酸吸吸收收，再再用用0.05000mol/lHCl0.05000mol/lHCl滴滴定定，结果消耗结果消耗5.00ml5.00ml，试计算该乳粉的蛋白质含量？，试计算该乳粉的蛋白质含量？l试试述述蛋蛋白白质质测测定定中中，样样品品消消化化过过程程所所必必须须注注意意的的事事项项，消消化化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？l样样品品经经消消化化进进行行蒸蒸馏馏前前，为为什什么么要要加加入入氢氢氧氧化化钠钠？这这时时溶溶液液发发生生什什么变化？为什么？如
16、果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？第二十页，讲稿共二十二页哦知识拓展：三聚氰胺假蛋白知识拓展：三聚氰胺假蛋白“原理原理”三聚氰胺的三聚氰胺的“优点优点”1、普通蛋白质含氮量平均为、普通蛋白质含氮量平均为16%，一般不超过，一般不超过30%，而三聚氰胺含氮量为，而三聚氰胺含氮量为66.7。2、三聚氰胺为白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后、三聚氰胺为白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现，但是尿素等却有气味，掺入后容易被检测出来不易被发现，但是尿素等却有气味，掺入后容易被检测出来若以合格奶粉蛋白质含量为若以合格奶粉蛋白质含量为18%计算，则含氮量为计算，则含氮量为2.88%。三聚氰胺含氮量是牛奶的三聚氰胺含氮量是牛奶的151倍，是奶粉的倍，是奶粉的23倍。每倍。每100g牛牛奶中添加奶中添加0.1克三聚氰胺，就能提高克三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白质。蛋白质。第二十一页，讲稿共二十二页哦感谢大家观看第二十二页，讲稿共二十二页哦