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1、钩端螺旋体病1第1页，本讲稿共31页一、病原一、病原 钩端螺旋体病钩端螺旋体病1、分类、分类：钩体目前公认的只有一个：钩体目前公认的只有一个种，再根据物生物学特点不同，可种，再根据物生物学特点不同，可分为两大群：分为两大群：（1）双曲钩体，为非致病性或腐生）双曲钩体，为非致病性或腐生性钩体。性钩体。（2）问号状钩体，为致病性钩体；）问号状钩体，为致病性钩体；第2页，本讲稿共31页 2、形态特点：、形态特点：钩体形态纤细，螺旋整齐而钩体形态纤细，螺旋整齐而致密，一端或两端弯曲如钩，不易为普致密，一端或两端弯曲如钩，不易为普通细菌染色剂着色，常用镀银染色和姬通细菌染色剂着色，常用镀银染色和姬姆萨染
2、色法，最容易观察的方法是将活姆萨染色法，最容易观察的方法是将活菌置暗视野显微镜下观察，可见钩体象菌置暗视野显微镜下观察，可见钩体象一串发亮的微细珠粒，运动活泼而特殊，一串发亮的微细珠粒，运动活泼而特殊，沿长轴方向旋转，旋转时两端柔软，中沿长轴方向旋转，旋转时两端柔软，中段僵硬，由此可确认。段僵硬，由此可确认。第3页，本讲稿共31页n姬姆萨染色n姬姆萨染液（天青色素、伊红、次甲蓝的混合液）的染色法。n染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。n初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，
3、细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中 n姬姆萨染色姬姆萨染色n初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。n革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这第4页，本讲稿共31页菌形态第5页，本讲稿共31页n 4培养：培养：对营养要求不严格，但初次分离的菌株需用要含兔血清的培养基，最常用的为柯索夫氏和希夫纳氏培养基。在人工培养基上生长较一般细菌为慢，如在上述培养基上，置28-30需5-7天，最长在一月以上才能生长良好，此时液体呈半透明、云雾状混浊，（1%）琼脂固体培养基上，有些菌株生长不好。第6页，本讲稿共31页n钩端螺旋体培养基一柯少夫
4、（钩端螺旋体培养基一柯少夫（Korthof）培）培养基养基 配法n蛋白胨400mg，氯化钠700mg，碳酸氢钠10mg，氯化钾20mg，氯化钙20mg，磷酸二氢钾120mg，磷酸氢二钠44Omg，蒸馏水500ml，无菌兔血清（灭活）8-10ml。n将各成分溶于蒸馏水内煮沸20min，以滤纸滤，调至pH 为7.2，分装烧瓶内每瓶100ml，121 灭菌20min;无菌采取兔心血分离血清，置56 水浴箱中30min以破坏补体；上述蛋白胨盐溶液每100ml中加入无菌兔血清8-10ml；混合后，用无菌分装中号试管中，每管5ml；置56 水浴箱30min;37 温箱中孵育2 天，剔去污染者。第7页，本讲
5、稿共31页n注：n为防止污染，每100ml培养基可加50mg磺胺嘧啶钠。n为了促进钩端螺旋体生长，可于该培养基中加入维生素Bl2 及烟酸（各1 mg100ml），并将兔血清量自8减至5%，培养基中不加氯化钙，（因氯化钙对生长无作用，且常形成沉淀物），再以100 加热30min。用此法制得培养基清晰，无任何沉淀。第8页，本讲稿共31页n4实验动物：实验动物：以50-60g金地鼠和100-200g豚鼠最敏感。n5抵抗力：抵抗力：对理化（如日光、高温、干燥，酸碱、一般消毒剂、抗生素）很敏感，但对低温抵抗力较强，如可在-20可存活100天，但在中性到偏弱碱性（pH7.0-7.6）较适宜，可在pH 7.
6、2-7.4水中生存1-2月，弱碱性湿土中生存达279天，这在流行病学上有一定意义。第9页，本讲稿共31页二、流行病学二、流行病学n 几乎所有温血动物都可感染钩体。流行病学几乎所有温血动物都可感染钩体。流行病学上意义最大的是鼠、猪、犬、蛙；上意义最大的是鼠、猪、犬、蛙；动物种类动物种类 带菌率带菌率 带菌时间带菌时间黑线鼠黑线鼠 14.6-28.0%黄胸鼠 2.4-4.8%1-2年，甚至终身年，甚至终身黄毛鼠黄毛鼠 8.1-34.6%猪（但放养猪）猪（但放养猪）5-7%（45.9%）371天天 犬犬 高高 700天天 蛙蛙 46天天 不详不详第10页，本讲稿共31页n主要以消化道、还可通过交配、
7、主要以消化道、还可通过交配、损伤皮肤粘膜、乳汁、精液、尿损伤皮肤粘膜、乳汁、精液、尿分别传给仔猪、母猪，也可以吸分别传给仔猪、母猪，也可以吸血昆虫传播，有明显季节性（血昆虫传播，有明显季节性（7-10月为高峰）。月为高峰）。第11页，本讲稿共31页三、症状三、症状 猪：主要菌型是波摩那，出血性黄疸和犬型三种；猪：主要菌型是波摩那，出血性黄疸和犬型三种；居于症状首位的是流产及新生仔猪多数归于死亡。居于症状首位的是流产及新生仔猪多数归于死亡。妊娠母猪感染后妊娠母猪感染后1-4周流产，常为死胎或弱胎，周流产，常为死胎或弱胎，产后不久即死亡。流产率可高达半数以上。产木乃伊产后不久即死亡。流产率可高达半
8、数以上。产木乃伊胎是本病与其它细菌子宫感染区别之一；胎是本病与其它细菌子宫感染区别之一；哺乳、断奶前后小猪，初似感冒，腹泻，后出现哺乳、断奶前后小猪，初似感冒，腹泻，后出现结膜炎（图结膜炎（图4）、皮肤黄染（图）、皮肤黄染（图3）、贫血、头颈或全）、贫血、头颈或全身水肿（图身水肿（图2），尿色深黄色），尿色深黄色，茶尿病死率很高，架子，茶尿病死率很高，架子猪可见体温升高，耳、尾尖皮肤坏死。猪可见体温升高，耳、尾尖皮肤坏死。第12页，本讲稿共31页图2下颔水肿第13页，本讲稿共31页图3病猪全身黄胆和水肿第14页，本讲稿共31页图4眼炎第15页，本讲稿共31页n牛：最初发热、鼻镜干燥、龟裂，皮肤
9、粘牛：最初发热、鼻镜干燥、龟裂，皮肤粘膜黄染、贫血，随之出现血红蛋白尿，产膜黄染、贫血，随之出现血红蛋白尿，产乳量下降，乳色变黄，浓如初乳并含有血乳量下降，乳色变黄，浓如初乳并含有血凝块；凝块；n 还可见脑炎型：出现兴奋不安，冲向还可见脑炎型：出现兴奋不安，冲向障碍物，自行撞伤，有的运动失常、障碍物，自行撞伤，有的运动失常、转圈运动。转圈运动。n 妊畜流产。妊畜流产。第16页，本讲稿共31页n 马：马：体温升高，出血，黄疸。皮肤干裂、坏死，体温升高，出血，黄疸。皮肤干裂、坏死，血红蛋白尿，妊娠马流产；血红蛋白尿，妊娠马流产；也有报道脑膜脑炎型；也有报道脑膜脑炎型；周期性眼炎：多半两眼同时受害，
10、病马常失明。周期性眼炎：多半两眼同时受害，病马常失明。n 犬：犬：以犬型最多见，发热、黄疸，厌食呕吐，以犬型最多见，发热、黄疸，厌食呕吐，腹泻，齿龈口粘膜常见到小溃疡、扁桃体炎，呼腹泻，齿龈口粘膜常见到小溃疡、扁桃体炎，呼出恶臭气体，许多犬表现腹壁紧张，同时肾区有出恶臭气体，许多犬表现腹壁紧张，同时肾区有压痛。压痛。第17页，本讲稿共31页五、病变五、病变n急性病例，主要为黄疸、出血，血红蛋白尿、急性病例，主要为黄疸、出血，血红蛋白尿、肝肾损害，慢性或轻型病例，则以肾的变化肝肾损害，慢性或轻型病例，则以肾的变化为突出为突出。皮肤、皮下、粘膜、浆膜。皮肤、皮下、粘膜、浆膜，脏器，脏器表面有出血、
11、黄疸，胸腔有黄色积液，膀胱表面有出血、黄疸，胸腔有黄色积液，膀胱积有血红蛋白尿或浓茶样尿，肝肿大，棕黄积有血红蛋白尿或浓茶样尿，肝肿大，棕黄色，肾肿大淤血，慢性者有散在灰白色病灶，色，肾肿大淤血，慢性者有散在灰白色病灶，有的皮肤坏死，有的还在身体各部，（头、有的皮肤坏死，有的还在身体各部，（头、颈、背、胃壁）等处出现水肿。颈、背、胃壁）等处出现水肿。第18页，本讲稿共31页六、诊断六、诊断n 1微生物学检查：发热期、未出现黄微生物学检查：发热期、未出现黄疸前，采取血液，发病中后期用尿液疸前，采取血液，发病中后期用尿液（脊髓液不常用），要求在发病后（脊髓液不常用），要求在发病后6-10天，死后立
12、即采取（不超过天，死后立即采取（不超过1-3小时，小时，）肝、肾、脾、脑等组织，进行处理后，）肝、肾、脾、脑等组织，进行处理后，作暗视野检查或荧光抗体染色镜检，病作暗视野检查或荧光抗体染色镜检，病理组织可用姬姆萨染色或镀银染色后检理组织可用姬姆萨染色或镀银染色后检查。查。第19页，本讲稿共31页n分离培养：分离培养：上述材料接种柯索夫上述材料接种柯索夫氏培养基（需灭活的兔血清），氏培养基（需灭活的兔血清），28-30培养，每隔培养，每隔5-7天，需作一次检天，需作一次检查，一般查，一般720天内开始生长，有时天内开始生长，有时在在1-3月才出现，镜检阳性者要及时月才出现，镜检阳性者要及时传代，
13、适应后可传代，适应后可2个月传代一次，若个月传代一次，若需保存毒力，需用动物和培养基交替需保存毒力，需用动物和培养基交替传代，个别钩体在常用培养基不生长，传代，个别钩体在常用培养基不生长，兼用动物接种分离更好。兼用动物接种分离更好。第20页，本讲稿共31页n3动物接种：采用幼龄豚鼠或地鼠，动物接种：采用幼龄豚鼠或地鼠，腹腔接种被检材料腹腔接种被检材料2-3ml，隔离饲养，隔离饲养观察，污水和尿可用浸泡感染法，动观察，污水和尿可用浸泡感染法，动物感染后物感染后3-14日发病，应于发热时采日发病，应于发热时采取心血检查，或濒死前剖检，观察病取心血检查，或濒死前剖检，观察病变并取肾、肝组织盲传三代。
14、变并取肾、肝组织盲传三代。第21页，本讲稿共31页 4血清学诊断血清学诊断：凝溶试验：本试验适于钩体病诊断和菌型鉴定。一般先定性（初筛），将血清作低倍稀释，查明被检血清是否有钩体抗体及群别，后定量，即将血清作进一步稀释，测定凝溶效价及型别，作出诊断。补反：血清效价在1：20以上有诊断价值，本试验所用抗原具有属特异性，阳性结果只能证明是钩体感染，不能定型，故常用于流行病学调查（感染3天即出现，4周达高峰，持续一年）。第22页，本讲稿共31页n钩端螺旋体的显微镜凝集（显凝）实验钩端螺旋体的显微镜凝集（显凝）实验n【原理】钩端螺旋体显凝实验是一种血清学反应，可用已知的抗原（标准菌株）来测定患者血清中
15、的未知抗体及其效价来进行辅助诊断；也可用已知的抗体（标准免疫血清）来鉴定未知菌株的型别作血清学鉴定。钩体运动活泼，在暗视野显微镜下，明显可见，若遇到相应抗体时可发生凝集。如血清中的补体未灭活，时间过久出现凝集的钩体发生溶解，则为钩体的凝（集）溶（解）实验。第23页，本讲稿共31页n【材料】1、抗原的选择和制备：将我国15群15型钩端螺旋体代表株接种于：Korthof培养液中，28培养57天，暗视野显微镜检查，暗视野显微镜400倍观察每视野下不少于50条，运动活泼且无自凝者可作显凝抗原。2、钩体免疫血清（家兔免疫血清）做血清学诊断时用疑似患者的血清。3、1ml无菌吸管、无菌试管、清洁载玻片及盖玻
16、片、0.9%氯化钠溶液、塑料凹孔板、2428温箱。第24页，本讲稿共31页n【方法】1、用0.95氯化钠溶液将钩端螺旋体免疫血清自1:50开始，做50倍系列稀释，直到1:1600。2、取各稀释度免疫血清0.1ml分别加入塑料凹孔板中，最后1孔加0.1ml0.9%氯化钠溶液作对照。3、每孔加0.1ml钩端螺旋体纯培养物，摇匀，置2830温箱。4、2小时后用接种环自各孔中取12环于载玻片上，置暗视野显微镜下观察。第25页，本讲稿共31页n【结果】先观察阴性对照孔，该孔如出现凝集则实验失败。该孔无凝集时方能观察实验孔，根据凝集程度以“+”记录结果，结果判定参照如下标准进行。-：完全无凝集，与对照管相
17、同。+：25%以上钩端螺旋体凝集呈小蜘蛛状，大多数游离且运动活泼。+：50%以上钩端螺旋体凝集呈蜘蛛状，约有半数未凝集。+：75%以上钩端螺旋体凝集呈蜘蛛状，其间有少数游离。+：几乎全部钩端螺旋体凝集呈巨大蜘蛛状，偶见极少数游离钩端螺旋体存在。效价判定：出现“+”的血清最高稀释度（终末稀释度加入等量抗原后的稀释度）为该血清的凝集效价。测定患者血清时，单份血清效价1：300以上有诊断意义，双份血清呈4倍以上升高时，更有诊断价值。第26页，本讲稿共31页补体结合反应原理：在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素（红细胞相应抗体）为指示系统的抗原抗体反应。此反应包括两个系统，5种成分。一是被检系统，即已知
18、的抗体（或抗原）和被检的抗原（或抗体）；另一个是指示系统，包括绵羊红细胞和溶血素，以及补体成分。补体用豚鼠新鲜血清。实验方法是先将被检系统的抗原、抗体及补体放入试管中，作用一定时间后，再加入指示系统，继续作用一定时间后，观察结果。n 第27页，本讲稿共31页间接凝集（炭凝集、间接血凝、乳胶凝集等）利用钩体属特异性抗原吸附于载体颗粒上，使之成为致敏颗粒抗原，当与被检血清中相应抗体相遇时，则出现肉眼可见的凝集现象，其方法简便迅速，准确性强。ELISA、荧光抗体法：检出率高，且有早期诊断的优点，有条件单位可试用。多价菌苗紧急接种诊断，用人用的3-5价菌苗作紧急接种，两周后新病例停止出现，既具有诊断效
19、果，也具有治疗效果。第28页，本讲稿共31页七、防制七、防制 1.做好防鼠、灭鼠和家畜管理工作，消除带菌、排菌的各种动物；清理污染的水源，污水、淤泥、牧地，饲养场、舍，用具，以防扩散传染。2.选用与当地流行菌型一致的菌苗预防接种，或使用多价浓缩菌苗预防，接种应在本病流行前一月完成，中草药：穿心莲、板蓝天根、金银花、土茯苓，千里光，大青叶有一定预防效果。第29页，本讲稿共31页n3.治疗：治疗：急、亚急性抗菌素疗效不佳，可结合急、亚急性抗菌素疗效不佳，可结合保肝、强心利尿，可用高免血清或多价保肝、强心利尿，可用高免血清或多价苗试治，慢性、带菌者可用土霉素、四苗试治，慢性、带菌者可用土霉素、四环素、链霉素等药物治疗环素、链霉素等药物治疗。第30页，本讲稿共31页第31页，本讲稿共31页