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1、关于蛋白质表达和抗体制备第一页，讲稿共三十二页哦常用蛋白表达系统常用蛋白表达系统(host)原核：大肠杆菌。真核：酵母、昆虫、哺乳动物、植物。第二页，讲稿共三十二页哦大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统 大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：优越性：对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解；对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解；商品化的载体和菌株种类非常齐全；商品化的载体和菌株种类非常齐全；表达效率高；表达效率高；易培养，成本低。易培养，成本低。缺点：缺
2、点：因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体；因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体；蛋白质不能糖基化；蛋白质不能糖基化；其内毒素很难除去。其内毒素很难除去。第三页，讲稿共三十二页哦酵母表达系统酵母表达系统 优越性：优越性：蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白；蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白；表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，实现高效率表达；表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，实现高效率表达；表达载体都为表达载体都为E.c
3、oli/Pichia Pastoris的穿梭载体，可在获得克隆后采用的穿梭载体，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量细胞大量扩增。扩增。易培养，成本低易培养，成本低,可高密度发酵。可高密度发酵。缺点：缺点：糖基化与哺乳动物有所差别；糖基化与哺乳动物有所差别；培养上清多糖浓度高，不利于纯化。培养上清多糖浓度高，不利于纯化。第四页，讲稿共三十二页哦昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统 利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。优越性：优越性：重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；
4、重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；可容纳较大片段的外源可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段插入，因此是表达大片段DNA的理想载体；的理想载体；可进行分泌表达。可进行分泌表达。缺点：缺点：糖基化与哺乳动物有所差别；糖基化与哺乳动物有所差别；表达量有限；表达量有限；作为药物宿主细胞未被作为药物宿主细胞未被FDA认可；认可；培养成本高。培养成本高。第五页，讲稿共三十二页哦哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。优越性：优越性：糖基化与人源蛋白一致；糖基化与人源蛋白一致；能
5、表达天然结构的完整蛋白，活性很高；能表达天然结构的完整蛋白，活性很高；可进行分泌表达。可进行分泌表达。缺点：缺点：表达量低；表达量低；培养成本很高，操作繁琐。培养成本很高，操作繁琐。第六页，讲稿共三十二页哦植物表达系统植物表达系统优越性：优越性：能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质。能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质。易于大规模培养和生产。易于大规模培养和生产。在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势。在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势。缺点：缺点：不易不易提取与纯化提取与纯化第七页，讲稿共三十二页哦Factors in E.coli protein expre
6、ssionVectorStrainGrowth conditions第八页，讲稿共三十二页哦原核表达载体众多，常用的有pET(T7 promoter)、pQE(T5 promoter)、pGEX(GST融合表达)等。各载体适应的菌株也不尽相同pET(BL21(DE3)、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。对于我们来说，最常用和最需掌握的是pET表达系统表达载体表达载体(Vector)第九页，讲稿共三十二页哦Expression plasmid features第十页，讲稿共三十二页哦Lac operon第十一页，讲稿共三十二页哦Induction of expression第十
7、二页，讲稿共三十二页哦原核表达宿主菌原核表达宿主菌名称特征用途抗性DH5带有recA endA突变的克隆菌株，由于DH5具有deoR变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。常用的质粒抽提工程菌株,可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。无BL21lon和ompT蛋白酶缺陷型用于PGEX载体构建质粒的蛋白表达无BL21(DE3)lon和ompT蛋白酶缺陷型，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7 RNA 聚合酶基因用于含有T7的pET系列载体构建质粒的蛋白表达无BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU和proL基因解决了表达富含AT的基因组蛋白密码子偏倚性
8、问题氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU、ileY和leuW tRNA基因解决了表达富含AT的基因组蛋白密码子偏倚性问题氯霉素BL21(DE3)-plysS带有可以与pET共存的、编码T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的质粒。pLysS 菌株在被诱导前T7 RNA聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和活力的重组体在宿主中更稳定。带有pLacI质粒的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白更严格的本底表达控制，适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。氯霉素BL21(DE3)-Roset
9、ta-gami（Rosetta-gami）携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的 表 达 水 平，又 具 有 thioredoxin reductase(trxB)和 glutathione reductase(gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达补充7种稀有密码子，促进蛋白可溶性及表达活性卡那霉素、氯霉素、四环素Rosetta-Blue带有recA endA lacIq突变的克隆菌株,高蛋白表
10、达,补充大肠杆菌缺乏的AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA六种稀有密码子对应的tRNA。补充稀有密码子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平氯霉素第十三页，讲稿共三十二页哦所有 B 型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosetta及Tuner都缺乏纯化过程中降解蛋白的lon蛋白酶及 ompT 外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在这些菌株中的稳定性要高于带有这些蛋白酶的菌株。BL21(DE3)是用得最多的表达菌AD494(DE3)和BL21trxB(DE3)具有trxB 突变，而Origami(DE3)，Origami B(DE3)和Rosetta-gami
11、(DE3)菌株带有trxB 和gor双突变。拥有trxB 和gor突变的菌株比单具 trxB 突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高多数氨基酸有不只一个密码子，而不同的生物使用这61 种密码子的偏好性不同。每种细胞里，tRNA种类和数量直接反映了其mRNA 使用密码子的种类和数量的偏好性。当外源目的基因mRNA 在E.coli里过表达，由于密码子偏爱性不同，会因为缺乏某种或某几种tRNA，直接导致翻译终止或错误。tRNA不足会造成翻译停顿，早期翻译停止，移码突变，和氨基酸错掺等问题。Rosetta菌株是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀
12、有tRNA 水平，这些蛋白的表达会大幅度提高。第十四页，讲稿共三十二页哦 表达条件表达条件培养基抗生素诱导剂诱导温度诱导时机诱导时间第十五页，讲稿共三十二页哦载体对表达的影响载体对表达的影响pET32,BL21(DE3),表达蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD)pET43,BL21(DE3),表达蛋白:Nus-His6-S Tag-EK-IFN(MW78KD)N I I I M I p s p s M N I S PU:Uninduced crude extractI:Crude extract after inducedS:Lysis supertanantP:Lysis p
13、recipitation第十六页，讲稿共三十二页哦0.1mM IPTG,incubate for 16h at 160.1mM IPTG,incubate for 3h at 37 N I S P N I S P表达条件对表达的影响表达条件对表达的影响pET21,BL21(DE3)-RIL,表达的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD)U:Uninduced crude extractI:Crude extract after inducedS:Lysis supertanantP:Lysis precipitation第十七页，讲稿共三十二页哦 增加可溶性和折叠增加可溶性和折叠降低蛋白合
14、成速率。温度。裂解缓冲液的性质。融合标签二硫键第十八页，讲稿共三十二页哦pET载体载体E.coli表达蛋白流程表达蛋白流程制备pET载体制备插入DNA将插入片段插入到pET载体上转化表达宿主菌诱导/优化表达目的蛋白放大实验纯化目的蛋白第十九页，讲稿共三十二页哦蛋白抗体制备蛋白抗体制备第二十页，讲稿共三十二页哦多克隆抗体：多克隆抗体：由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同抗原决定簇的抗体的混合物，即多克隆抗体。单克隆抗体：单克隆抗体：由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术
15、是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。第二十一页，讲稿共三十二页哦据文献及DNAstar软件分析，确定各蛋白最可能抗原区序列，Primer Premier5.0软件设计引物，从基因组，扩增目的基因。克隆至pET28a载体上。转化至DH5a中，经PCR验证重组子。重组子质粒再转化至BL21(DE3)菌株中，进行小量诱导表达，确认最适条件后，进行大量诱导表达，提取大肠杆菌包涵体，溶菌酶处理，添加去垢剂，超声破碎后，溶于8M Urea中
16、，经镍柱层析咪唑洗脱，过夜透析，无菌过滤后，免疫家兔，通过化学发光Western印迹确定多克隆抗血清的效价。第二十二页，讲稿共三十二页哦抗原基因构筑抗原基因构筑：通过设计的抗原序列aa的个数，加上载体上含组氨酸标签序列的42aa，计算是否达到抗体注射免疫家兔的要求（17-25kDa之间）第二十三页，讲稿共三十二页哦诱导表达靶蛋白诱导表达靶蛋白：PCR验证基因产物是否插入载体。转化至DH5a中测序，再转化至BL21中小量诱导表达各蛋白。探索蛋白表达最合适的条件，如温度、诱导时间、IPTG浓度。0h 2h 4h 6h第二十四页，讲稿共三十二页哦大量诱导表达，分离包涵体大量诱导表达，分离包涵体：过夜
17、培养25ml菌液，在5：1 的锥形瓶:培养基中按1：50比例加入过夜菌液，30-35，0.4mM IPTG，按上述优化条件大量诱导表达靶蛋白。5000g,15min,弃上清，加入Binding buffer(-Urea,20mM PBS(pH 7.8),500mM NaCl)悬浮菌液。加入lysozyme（溶菌酶）至终浓度1mg/ml，室温放置30min。加入1%Triton-X-100，冰中放置10min。超声破碎120W，4s，间隔4s,5min。上清另存用于检测。用Binding buffer(-Urea)悬浮洗涤可溶性杂蛋白。上清另存用于检测。沉淀用Binding buffer(+8M
18、 Urea)悬浮。取少量上清检测。其于冻存用于纯化。control第二十五页，讲稿共三十二页哦靶蛋白纯化靶蛋白纯化:0.45um 滤器(whatman)去除细菌蛋白碎片，以利于进行组氨酸标签表达蛋白的镍柱层析纯化。对蛋白进行定量（牛血清白蛋白法）。第二十六页，讲稿共三十二页哦镍柱层析镍柱层析:层析柱（(Poly-Prep Chromatography Column,BIORAD)中加入1.5ml 50%Ni-NTA His Bind Resin，自然沉降，无菌水冲洗，3ml binding buffer(+8M Urea)平衡。（流速10ml/h）6ml（至少3ml）binding buffe
19、r(+8m Urea)洗柱，4ml washing buffer(20mM PBS,pH 6.0,500mM NaCl,8M Urea)洗柱。6ml 10mM(binding buffer+),50mM,100mM,150mM,200mM buffer依次洗柱，洗脱靶蛋白。5ml无菌水冲洗。3 ml Binding buffer(+8M Urea)平衡。保留2ml Binding buffer(+8M Urea)于柱中，保存于4。层析后蛋白样品需经过透析使Urea浓度8M降至2M，和中性条件(pH 7.2,PBS)原理：原理：His标签是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸H
20、HHHHH，其特点是分子量小，基本不改变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性，更重要的是它使蛋白质的纯化变得极为方便，根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，人们可以利金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白，即将含有目的蛋白的裂解液通过固定的二价金属离子（通常是二价Ni离子）填料，带有6*his标签的蛋白质即与填料结合，其它蛋白不与填料结合，最后再用高浓度的咪唑即可将目的蛋白洗脱下来。第二十七页，讲稿共三十二页哦透析透析：处理好的透析袋，装入约10ml层析后蛋白样品(10-15mg)。置于5M Urea PBS(pH 7.2)中，磁力搅拌机上3h，更换至2M,2M Urea
21、PBS(pH 7.2)，各透析3h，透析后分装蛋白样品，0.22um滤器(whatman)过滤，除菌。定量，分装。SDS-Urea-PAGE(15%)检测。原理：原理：透析是利用半透性膜将待纯化蛋白质包裹,沉浸在缓冲液中；由于缓冲液浓度低于膜内部的浓度,因此在半透膜上会发生物质交换；但蛋白质不能通过半透膜,只有盐离子等小分子物质可以通过。第二十八页，讲稿共三十二页哦靶蛋白抗体制备靶蛋白抗体制备：经0.22um滤菌纯化后蛋白样品免疫家兔，前两次注射，15天一次，第三次注射后一周即可测效价。共注射4次.注射剂量 0.5mg/kg rabbit.第二十九页，讲稿共三十二页哦靶蛋白抗体检测靶蛋白抗体检测：对制备的多克隆抗血清进行免疫效价的测定 第三十页，讲稿共三十二页哦Thank you!第三十一页，讲稿共三十二页哦感谢大家观看第三十二页，讲稿共三十二页哦