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1、实验一实验一 细菌形态学检查细菌形态学检查第1页，本讲稿共21页生物安全生物安全n1、进入实验室必须穿白大褂，离室时脱下反折；无菌操作时必须戴口罩。、进入实验室必须穿白大褂，离室时脱下反折；无菌操作时必须戴口罩。n2、不必要物品勿带入实验室，必要的文具、实验指导和笔记本应放在指定的操作区。、不必要物品勿带入实验室，必要的文具、实验指导和笔记本应放在指定的操作区。n3、实验室内禁止带入饮食，抽烟，不得高声谈笑或随便走动。、实验室内禁止带入饮食，抽烟，不得高声谈笑或随便走动。n4、需培养的物品应做好标记放在指定地点。用过的有菌器材必须放在消毒缸内，、需培养的物品应做好标记放在指定地点。用过的有菌器
2、材必须放在消毒缸内，小心处理传染材料、培养物和污染的物品。小心处理传染材料、培养物和污染的物品。n5、避免任何有菌材料的溅出，若不甚污染工作台、手、眼、衣服和地面等处，、避免任何有菌材料的溅出，若不甚污染工作台、手、眼、衣服和地面等处，应立即报告老师及时适当处理。应立即报告老师及时适当处理。n6、实验完毕后物归原处，并清洁桌面；肥皂洗手、消毒液浸泡洗净后，关闭水、电、煤气、实验完毕后物归原处，并清洁桌面；肥皂洗手、消毒液浸泡洗净后，关闭水、电、煤气和门窗方可离开实验室。和门窗方可离开实验室。第2页，本讲稿共21页【实验目的实验目的】n1 掌握临床微生物实验室规则，生物安全及其它注意事项。掌握临
3、床微生物实验室规则，生物安全及其它注意事项。n2 掌握显微镜油镜的使用和保护。掌握显微镜油镜的使用和保护。n3 熟悉显微镜的结构和各部分的功能。熟悉显微镜的结构和各部分的功能。n4 不染色和各种染色标本的显微镜观察。不染色和各种染色标本的显微镜观察。n5 细菌特殊结构的染色与观察。细菌特殊结构的染色与观察。第3页，本讲稿共21页【实验内容实验内容】n光学显微镜的使用光学显微镜的使用n不染色标本的检查不染色标本的检查n革兰氏染色和细菌基本形态观察革兰氏染色和细菌基本形态观察n细菌特殊结构染色和观察细菌特殊结构染色和观察第4页，本讲稿共21页形态学检查的意义形态学检查的意义n细菌鉴定的重要手段，有
4、助于细菌的初步分群细菌鉴定的重要手段，有助于细菌的初步分群n是决定采用何种生化反应的重要提示是决定采用何种生化反应的重要提示n初步诊断初步诊断n结核涂片结核涂片n淋球菌涂片淋球菌涂片 第5页，本讲稿共21页显微镜的使用显微镜的使用n先用低倍镜找出标本位置，再转用油镜先用低倍镜找出标本位置，再转用油镜n粗调粗调+微调微调n香柏油的作用：香柏油的作用：玻片和空气密度不同，使部分光线经空气折射后玻片和空气密度不同，使部分光线经空气折射后不能进入透镜，而香柏油的折光率与玻璃相近，可使进入油镜的不能进入透镜，而香柏油的折光率与玻璃相近，可使进入油镜的光线增多，视野光度增强，物像清晰光线增多，视野光度增强
5、，物像清晰n镜头要保持清洁（可用二甲苯擦拭镜头）镜头要保持清洁（可用二甲苯擦拭镜头）第6页，本讲稿共21页形态学检查的方法形态学检查的方法n不染色标本检查法不染色标本检查法n染色标本检查法染色标本检查法n特殊染色检查法特殊染色检查法第7页，本讲稿共21页不染色标本检查法不染色标本检查法1n压片法（压滴法）压片法（压滴法）1.用接种环分别取细菌用接种环分别取细菌23环，置于洁净载玻片中央环，置于洁净载玻片中央 2.轻轻覆上盖玻片轻轻覆上盖玻片 3.油镜下观察油镜下观察第8页，本讲稿共21页不染色标本检查法不染色标本检查法2n悬滴法悬滴法第9页，本讲稿共21页染色标本检查法染色标本检查法n染色基本
6、步骤：染色基本步骤：n涂片：涂片：n干燥：室温自然干燥干燥：室温自然干燥n固定：固定：杀死细菌杀死细菌;使菌体与玻片粘附使菌体与玻片粘附;菌体蛋白变性易着色菌体蛋白变性易着色n染色：革兰染色染色：革兰染色n镜检镜检第10页，本讲稿共21页革兰染色革兰染色-基本步骤基本步骤a)初染：初染：结晶紫结晶紫 1 min；b)媒染：媒染：碘液碘液 1 min；c)脱色：脱色：95%乙醇乙醇 至无紫色脱落为止；至无紫色脱落为止；d)复复染染：石石碳碳酸酸复复红红 30 s，自然干燥后镜检，自然干燥后镜检第11页，本讲稿共21页革兰染色革兰染色-结果与注意事项结果与注意事项结果判断：结果判断：紫色为革兰阳性
7、菌、红色为革兰阴性菌紫色为革兰阳性菌、红色为革兰阴性菌注意事项：注意事项：n涂片不宜过厚涂片不宜过厚n固定不宜过热固定不宜过热n脱色是关键：脱色不够：革兰阴性菌脱色是关键：脱色不够：革兰阴性菌 革兰阳性菌革兰阳性菌 脱色过度：革兰阳性菌脱色过度：革兰阳性菌 革兰阴性菌革兰阴性菌n1824 h 菌龄最佳菌龄最佳n已知金葡与大肠作为阳性和阴性对照已知金葡与大肠作为阳性和阴性对照第12页，本讲稿共21页特殊染色（示教）特殊染色（示教）n鞭毛染色鞭毛染色n芽胞染色芽胞染色n荚膜染色荚膜染色第13页，本讲稿共21页鞭毛染色鞭毛染色-套组内容及规格套组内容及规格内容内容规格规格主要成分主要成分复红酒精溶液
8、复红酒精溶液(A液液)20 ml品红品红鞣酸水溶液鞣酸水溶液(B液液)20 ml鞣酸鞣酸钾明矾溶液钾明矾溶液(C液液)20 ml钾明矾钾明矾工作液过滤瓶工作液过滤瓶第14页，本讲稿共21页鞭毛染色鞭毛染色-工作液配制工作液配制n根据使用量将根据使用量将A液、液、B液、液、C液等比例混合，并置于工作液过滤液等比例混合，并置于工作液过滤瓶内，混合均匀静置瓶内，混合均匀静置2 h 后方可使用后方可使用n工作液工作液28 约可保存约可保存23天天 第15页，本讲稿共21页鞭毛染色鞭毛染色-玻片的处理玻片的处理n鞭毛染色成功与否，与玻片的洁净度有非常密切的关系鞭毛染色成功与否，与玻片的洁净度有非常密切的
9、关系n取新的载玻片，先用洗洁精清洗干净后，再浸泡在取新的载玻片，先用洗洁精清洗干净后，再浸泡在3%盐盐酸酒精酸酒精2天以上，使用时从酸性酒精中取出，并用纯水冲洗干净，天以上，使用时从酸性酒精中取出，并用纯水冲洗干净，再以干净纱布擦干或自然干燥后使用再以干净纱布擦干或自然干燥后使用第16页，本讲稿共21页鞭毛染色鞭毛染色-涂片的制备涂片的制备n将菌种接种在肉汤管中，经将菌种接种在肉汤管中，经24 h 37孵育后离心，倒掉上清孵育后离心，倒掉上清液，用接种环沾取沉淀物一环置于玻片的一端，并将玻片倾斜，液，用接种环沾取沉淀物一环置于玻片的一端，并将玻片倾斜，使菌液自然流动至玻片的另一端，室温下自然干
10、燥使菌液自然流动至玻片的另一端，室温下自然干燥第17页，本讲稿共21页鞭毛染色鞭毛染色-操作方法操作方法n滴加工作液于玻片上，染色滴加工作液于玻片上，染色1015 minn将玻片微倾斜，用蒸馏水一滴滴冲洗干净将玻片微倾斜，用蒸馏水一滴滴冲洗干净n将玻片直立使水分流尽，自然晾干，镜检将玻片直立使水分流尽，自然晾干，镜检n结果：菌体及鞭毛均为红色结果：菌体及鞭毛均为红色第18页，本讲稿共21页芽胞染色芽胞染色-染液规格染液规格n石碳酸复红液石碳酸复红液 20 ml 碱性品红碱性品红n脱色液脱色液 20 ml 乙醇乙醇n碱性美蓝液碱性美蓝液 20 ml 亚甲蓝亚甲蓝第19页，本讲稿共21页芽胞染色芽
11、胞染色-染色步骤与方法染色步骤与方法n将有芽胞细菌制成涂片，自然干燥后加热固定将有芽胞细菌制成涂片，自然干燥后加热固定n滴加石碳酸复红液于涂片上，并弱火加热，使染液冒蒸滴加石碳酸复红液于涂片上，并弱火加热，使染液冒蒸气约气约5 min，冷后水洗，并用脱色液脱色，冷后水洗，并用脱色液脱色2 min，水洗，水洗n碱性美蓝复染碱性美蓝复染30 s，水洗，干后用油镜镜检，水洗，干后用油镜镜检n结果：芽胞呈红色，菌体呈蓝色结果：芽胞呈红色，菌体呈蓝色第20页，本讲稿共21页实验操作实验操作每组一套菌种：每组一套菌种：n葡萄球菌：革兰阳性球菌葡萄球菌：革兰阳性球菌n大肠埃希菌：革兰阴性杆菌大肠埃希菌：革兰阴性杆菌n真菌：孢子真菌：孢子n变形杆菌：变形杆菌：鞭毛染色（示教）鞭毛染色（示教）n枯草杆菌：枯草杆菌：芽胞染色（示教）芽胞染色（示教）革兰染色革兰染色第21页，本讲稿共21页