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1、关于细胞培养操作规范现在学习的是第1页，共27页一：细胞培养的基本条件：1.无菌环境：无菌环境：细胞培养间消毒细胞培养间消毒a：使用前紫外照射20-30分钟b：使用完75%酒精擦拭台面，紫外照射15分钟。c：每两周用84消毒液擦拭地面、台面一次的方式进行消毒现在学习的是第2页，共27页超净工作台：超净工作台：使用前使用前开启柜内紫外灯照射开启柜内紫外灯照射1530分钟分钟使用时使用时开启鼓风，在台面内操作开启鼓风，在台面内操作使用完毕后使用完毕后要用要用75%酒精将台面和台内四周擦拭干净，紫外照射酒精将台面和台内四周擦拭干净，紫外照射10分钟。分钟。现在学习的是第3页，共27页CO2 培养箱：
2、培养箱：1.设定的条件为37，5CO2。2.使用CO2培养箱应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000毫升，以保持箱内湿度。现在学习的是第4页，共27页控制水盘内污染的方法：1、定期(至少每两周一次)，更换水盘内的无菌蒸馏水或无菌去离子水。2、在水盘内添加适量硫酸铜，预防真菌污染。配制方法：20g无水硫酸铜5ml浓硫酸1L灭菌纯水。3、水盘内添加适量抗生素。4、定期为培养箱（含水盘）进行一次高温灭菌。现在学习的是第5页，共27页2.细胞培养条件细胞培养器皿：细胞培养瓶：25平方厘米（加液量3-5ml
3、）75平方厘米（加液量10-15ml）150平方厘米（加液量40ml）细胞培养板：现在学习的是第6页，共27页n n细胞培养皿35mm（加液量3ml)60mm（加液量5ml)100mm（加液量10ml)150mm(加液量15ml)现在学习的是第7页，共27页n n常用培养基：RPMI1640：适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞的原代培养、传代培养等。尤其适合人白细胞，如H9、HL-60、IM-9和K-562等细胞系的培养。DMEM：DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型（4500mg/L）、除菌过滤灭菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型(1000mg/
4、L)、除菌过滤灭菌】现在学习的是第8页，共27页n n血清：常用血清种类：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清血清的灭活（消除补体活性）56，30分钟。使用浓度：5%-20%，一般10%血清的消毒：过滤除菌血清解冻步骤：20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般用15ml无菌离心管分装。现在学习的是第9页，共27页n n谷氨酰胺：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20保存，临用前加入培养液。现在学习的是第10页，共27页n n消化液：胰蛋白酶溶液：常用浓度：0.25%。消化时间：2-10分钟（显微镜下观察）用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。现在学习的
5、是第11页，共27页EDTA溶液使用浓度：0.02%，与胰蛋白酶配合使用。EDTA不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶。现在学习的是第12页，共27页二：细胞培养前准备工作：1.相关耗材：细胞培养皿（瓶）若干、离心管（细胞培养皿（瓶）若干、离心管（15ml,50ml15ml,50ml）、）、100ml100ml玻璃玻璃瓶瓶4 4个、个、500ml500ml玻璃瓶玻璃瓶4 4个、个、2mL2mL冻存管、冻存管、tiptip头及枪头盒、头及枪头盒、吸管（吸管（10ml10ml刻度）、吹打管、刻度）、吹打管、50ml50ml、10ml10ml、5ml5ml注射器、注射器、一次
6、性针孔过滤器（一次性针孔过滤器（0.22um0.22um）、一次性口罩、帽子、手套、）、一次性口罩、帽子、手套、纱布、牛皮纸、标签纸纱布、牛皮纸、标签纸现在学习的是第13页，共27页2.相关试剂及配制方法：细胞培养的相关试剂配制均在超净工作台上操作，严格按照无菌操作流程！完全培养基完全培养基:基础培养基基础培养基 90%90%血清血清 1010碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0g/L2.0g/L青、链霉素青、链霉素 100U100Umlml过滤除菌过滤除菌44保存保存使用时加入谷氨酰胺（配制方法：谷氨酰胺使用时加入谷氨酰胺（配制方法：谷氨酰胺2.922g2.922g溶于三蒸溶于三蒸水加至水加至100ml
7、100ml即配成即配成200mmol/L200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，过滤除菌，分装小瓶，-20-20保存，使用时可向保存，使用时可向100ml100ml培养培养液中加入液中加入1ml1ml谷氨酰胺溶液。谷氨酰胺溶液。现在学习的是第14页，共27页胰蛋白酶胰蛋白酶-EDTA-EDTA消化液消化液称取称取0.25g0.25g的胰蛋白酶和的胰蛋白酶和0.020.02g g的的EDTAEDTA用无用无Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS缓冲液或缓冲液或D-HanksD-Hanks配制，用滤器配制，用滤器过滤除菌，过滤除菌，-20-
8、20分装保存分装保存。细胞冻存液配制：细胞冻存液配制：90%90%血清和血清和10%DMSO10%DMSO现在学习的是第15页，共27页3 3：常用培养器皿的清洗及消毒：常用培养器皿的清洗及消毒玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 刷洗（自来水）、浸泡（洗衣粉）、冲洗（自来水），烘干刷洗（自来水）、浸泡（洗衣粉）、冲洗（自来水），烘干（5050，恒温干燥箱）酸泡，恒温干燥箱）酸泡（2424小时，至少小时，至少6 6小时）、清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗小时）、清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗1515遍以上），遍以上），5050烘干。烘干。新的橡胶制品洗涤方法新的橡胶制品洗涤方法0.5MNaOH0.5MNaOH煮
9、沸煮沸1515分钟或浸泡过夜，流水冲洗，分钟或浸泡过夜，流水冲洗，0.5MHCl0.5MHCl煮沸煮沸1515分钟或浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水冲洗分钟或浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水冲洗1515次以上，次以上，5050烤干备用烤干备用。现在学习的是第16页，共27页消毒：消毒前常用的包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒包装高压蒸汽消毒：121，维持20-30分钟。现在学习的是第17页，共27页三：细胞培养方法1.细胞复苏方法：从从 液液 氮氮 中中 取取 出出 冷冷 冻冻 管管，迅迅 速速 投投 入入 3737 水浴中，水浴中，甩动冻存管，使其融化（甩动冻存管，使其融化（1 1分钟左右）；分钟左右）；5 5
10、分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的1010倍以上；倍以上；10001000转低速离心转低速离心5 5分钟；分钟；去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。现在学习的是第18页，共27页2.细胞换液方法：换液指针：换液指针：观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色，颜观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊色清亮，无杂质，无浑浊观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，确认无细菌真菌观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，确认无细菌真菌污染污染换液方法：换液方法：将吸管、废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作
11、台紫将吸管、废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒外消毒2020分钟，分钟，开启恒温水浴箱，培养液预热开启恒温水浴箱，培养液预热关闭紫外灯，开启工作台上风机关闭紫外灯，开启工作台上风机吸弃原培养液吸弃原培养液加入新的培养加入新的培养现在学习的是第19页，共27页n n3.细胞传代方法：传代指针：n n观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊n n显微镜观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，铺满培养瓶80%以上，细胞透亮，形态清晰，间隙无杂质，确认无细菌真菌污染现在学习的是第20页，共27页n n传代方法：传代方法：将新的培养皿、吸管、废液缸放入工作台开
12、启细胞培养房及将新的培养皿、吸管、废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒工作台紫外消毒2020分钟，分钟，开启恒温水浴箱，培养液、消化液预热开启恒温水浴箱，培养液、消化液预热关毕紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯关毕紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯吸弃培养基，吸弃培养基，PBSPBS清洗两次清洗两次加入加入2ml2ml消化液晃动培养瓶使消化液覆盖整个细胞界面后消化液晃动培养瓶使消化液覆盖整个细胞界面后吸弃培养液吸弃培养液肉眼观察细胞培养瓶底部出现一层云雾状，轻轻敲打底部有肉眼观察细胞培养瓶底部出现一层云雾状，轻轻敲打底部有块状物脱落，显微镜下观察看到细胞间隙变大，细胞回缩块状物脱落，显微镜下
13、观察看到细胞间隙变大，细胞回缩变圆少量漂浮后加入变圆少量漂浮后加入10ml10ml含血清培养基终止消化，吹打含血清培养基终止消化，吹打管吹打数次管吹打数次将细胞悬液吸至离心管，将细胞悬液吸至离心管，1000rpm1000rpm离心离心5 5分钟分钟吸弃上清，加入吸弃上清，加入PBSPBS吹打混匀，吹打混匀，1000rpm1000rpm再次离心再次离心5 5分钟分钟吸弃上清，加入新鲜培养基，吹打混匀，按比例接种到细胞培吸弃上清，加入新鲜培养基，吹打混匀，按比例接种到细胞培养瓶养瓶现在学习的是第21页，共27页细胞消化时间的控制：细胞消化时间的控制：现在学习的是第22页，共27页n n4:细胞冻存
14、：吸出旧培养液加PBS冲洗两次胰酶消化加培养基中止消化，（以上步骤同细胞传代）细胞计数离心收集细胞，吸弃上清，加入冻存液调整细胞密度至1106个个/ml/ml将细胞移入冻存管，写好标签（细胞种类，冻存时间）将细胞移入冻存管，写好标签（细胞种类，冻存时间）4415-30分钟，-201-2小时，-80保存，或过夜后至液氮罐内保存。现在学习的是第23页，共27页5:细胞计数细胞计数板计数室构造细胞计数板计数室构造数红色边框标记的四个方格内的细胞总数（如有压线则计上不计下，计左不计右）细胞数/ml=（4个大方格细胞总数/4）104稀释倍数现在学习的是第24页，共27页四、细胞培养注意事项 1.1.实验
15、进行前，无菌室及无菌操作台实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)(laminarflow)以紫外灯照射以紫外灯照射20-3020-30分钟灭菌，以分钟灭菌，以75%75%酒精酒精 擦拭无擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转1010分钟后，分钟后，才开始实验操作。才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以完毕后，将实验物品带出工作台，以75%75%酒精擦
16、拭酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转1010分钟以分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作上后，再进行下一个细胞株之操作 现在学习的是第25页，共27页n n2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。容器、培养瓶、培养板和培养皿实验用品以75%酒精擦拭外部后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。切记开启鼓风。缘之非无菌区域操作。切记开启鼓风。n n3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝下放置桌面。现在学习的是第26页，共27页感谢大家观看现在学习的是第27页，共27页