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1、关于紫外可见吸收光关于紫外可见吸收光谱法谱法(2)第一页，讲稿共七十三页哦可见光可见光远紫外远紫外（真空紫外）（真空紫外）紫外光紫外光10 nm 200 nm 400 nm 780 nm 一、紫外一、紫外-可见光可见光第一节第一节 概述概述 第二页，讲稿共七十三页哦1.物质分子对光的吸收物质分子对光的吸收E=Ee+Ev+Er2.分子吸收光谱分子吸收光谱 A（吸光度）（吸光度）-（波长）关系图（波长）关系图Er：0.05 eV带光谱带光谱Ee：1 20 eVEv：0.05 1 eV二、紫外二、紫外二、紫外二、紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱可见吸收光谱可见吸收光谱第三页，讲稿共七十三页哦三、紫外三
2、、紫外三、紫外三、紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱 法法定性分析定性分析定量分析定量分析ABA在一定的实验条件下，在一定的实验条件下，物质在某波长处的吸光物质在某波长处的吸光度与物质的浓度成正比。度与物质的浓度成正比。AC增大吸收光谱的位置吸收光谱的位置(max)和形状和形状第四页，讲稿共七十三页哦1.1.精密度较高精密度较高精密度较高精密度较高3.检出限低检出限低相对误差相对误差 13%2.准确度较高准确度较高DL 10-7 10-8 10-9 g/ml不一定要追求低的检出限4.仪器比较简单仪器比较简单 操作比较简便操作比较简便5.应用广泛应用广泛 选择性一般比较好。条件适当，可不经分离进行单
3、组分或多组分测定。选择性一般比较好。条件适当，可不经分离进行单组分或多组分测定。主要干扰：主要干扰：共存组分与被侧组分的光谱重叠共存组分与被侧组分的光谱重叠RSD1%RSD1%四、紫外四、紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱 法的特点法的特点(定量分析定量分析)n承担承担60%的定量分析任务（无机离子的定量分析任务（无机离子 有机物有机物 生化分析）生化分析）n一些有机物结构分析的辅助方法一些有机物结构分析的辅助方法第五页，讲稿共七十三页哦五、研究工作的现状五、研究工作的现状五、研究工作的现状五、研究工作的现状n n 提高选择性提高选择性提高选择性提高选择性n n 提高灵敏度提高灵敏度提高灵敏度提高
4、灵敏度第六页，讲稿共七十三页哦第二节第二节 吸收光谱法基本原理吸收光谱法基本原理第七页，讲稿共七十三页哦单色光单色光单色光单色光 复合光复合光复合光复合光 光的互补光的互补光的互补光的互补单色光单色光复合光复合光光的互补光的互补单一波长的光单一波长的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光（无色的光），那么就称这两种单色光为互补色白光（无色的光），那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿一、物质对光的选择性吸收一、物质
5、对光的选择性吸收第八页，讲稿共七十三页哦 当溶液中的某种物质选择性地吸收可见光当溶液中的某种物质选择性地吸收可见光当溶液中的某种物质选择性地吸收可见光当溶液中的某种物质选择性地吸收可见光中某种颜色的光时，溶液就会呈现出对应的互中某种颜色的光时，溶液就会呈现出对应的互中某种颜色的光时，溶液就会呈现出对应的互中某种颜色的光时，溶液就会呈现出对应的互补色。补色。补色。补色。物质外观颜色物质外观颜色吸吸 收收 光光吸收光的颜色吸收光的颜色波长范围（波长范围（nmnm）黄绿黄绿黄黄橙橙红红红紫红紫紫紫蓝蓝绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿紫紫蓝蓝绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿绿绿黄绿黄绿黄黄橙橙红红400 450400 450450
6、480450 480480 490480 490490 500490 500500 560500 560560 580560 580580 610580 610610 650610 650650 780650 780黑色-全吸收；白色-全反射；无色-全投射光I0IL第九页，讲稿共七十三页哦二、吸收光谱二、吸收光谱二、吸收光谱二、吸收光谱 如果让不同波长的单色光如果让不同波长的单色光如果让不同波长的单色光如果让不同波长的单色光依次照射某一吸光物质，依次照射某一吸光物质，依次照射某一吸光物质，依次照射某一吸光物质，并测量改物质在每一波长并测量改物质在每一波长并测量改物质在每一波长并测量改物质在每一
7、波长处对光吸收程度的大小处对光吸收程度的大小处对光吸收程度的大小处对光吸收程度的大小（吸光度，（吸光度，（吸光度，（吸光度，A A A A），然后以波），然后以波），然后以波），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐长为横坐标，吸光度为纵坐长为横坐标，吸光度为纵坐长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即得到一条吸光度标作图，即得到一条吸光度标作图，即得到一条吸光度标作图，即得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为随波长变化的曲线，称之为随波长变化的曲线，称之为随波长变化的曲线，称之为吸收曲线谱图也称为吸收光吸收曲线谱图也称为吸收光吸收曲线谱图也称为吸收光吸收曲线谱图也称为吸收光谱。谱。谱。谱。-胡罗卜素胡罗
8、卜素咖啡因咖啡因阿斯匹林阿斯匹林丙酮丙酮第十页，讲稿共七十三页哦末端吸收最强峰肩峰峰谷次强峰 max min A第十一页，讲稿共七十三页哦1.1.吸收峰的形状及所在位置吸收峰的形状及所在位置吸收峰的形状及所在位置吸收峰的形状及所在位置 定性的依据定性的依据定性的依据定性的依据2.2.吸收峰的强度吸收峰的强度吸收峰的强度吸收峰的强度定量的依据定量的依据定量的依据定量的依据 光吸收定律光吸收定律A A紫外可见光谱的特征紫外可见光谱的特征第十二页，讲稿共七十三页哦三、光吸收定律三、光吸收定律透光率透光率 T，透光光强度与入射光强度的比值，透光光强度与入射光强度的比值全部吸收 T=0.0 全部透射 T
9、=100.0%入射光 I0透射光 It（一）朗伯（一）朗伯（一）朗伯（一）朗伯-比尔定律比尔定律比尔定律比尔定律1.1.定律定律吸光度吸光度 A朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 A=Kbc 1）液气固介质均适用液气固介质均适用2 2）入射光是单色光，平行光入射光是单色光，平行光 1730年年 Lamber A b (C固定固定)1852年年 beer A C (b固定固定)3）稀溶液）稀溶液第十三页，讲稿共七十三页哦I0dbbItIx-dIx=k1 Ix adndn=CSdb -dIx=k1 IxaCSdb-dIx/Ix=k CdbdIx2.朗伯-比尔定律推导比尔定律推导S物理意义：当一束平行光垂直
10、通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度A与吸光物质的浓度C及吸收池厚度b成正比（定量分析的依据）adn C第十四页，讲稿共七十三页哦吸光度吸光度 与透光率与透光率与透光率与透光率1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%第十五页，讲稿共七十三页哦3.吸光度的加合性吸光度的加合性A=A1+A2+An各组分之间无相互作用各组分之间无相互作用各组分之间无相互作用各组分之间无相互作用条件：条件：条件：条件：多组分测定及扣除空白方法的理论基础多组分测定及扣除空白方法的理论基础多组分测定及扣除空白方法的理论基础多组分测定及扣除空白方法的理
11、论基础用途：用途：用途：用途：在某一波长处在某一波长处第十六页，讲稿共七十三页哦C:mol/L2)(L mol1 cm-1)C:g/L1)a (L g 1 cm-1)吸光物质定性的特征参数吸光物质定性的特征参数4.4.吸光系数吸光系数吸光系数吸光系数吸光物质定量分析的灵敏度参数吸光物质定量分析的灵敏度参数 物理意义为当吸光物质的浓度为物理意义为当吸光物质的浓度为1mol.L-1，吸收池厚度为，吸收池厚度为1cm时，吸光物质时，吸光物质对某波长光的吸光度对某波长光的吸光度影响因素：入射光的波长影响因素：入射光的波长吸光物质的性质（吸光质点的面积、有效跃迁概率）吸光物质的性质（吸光质点的面积、有效
12、跃迁概率）溶剂溶剂温度等环境因素温度等环境因素第十七页，讲稿共七十三页哦3)检出限与摩尔吸光系数检出限与摩尔吸光系数若可测量的吸光度为若可测量的吸光度为0.001一般一般 103 104；灵敏；灵敏 的的 104；个别的可达；个别的可达 106增大增大 是提高方法灵敏度的重要途径是提高方法灵敏度的重要途径提高跃迁几率提高跃迁几率 增大截面积增大截面积第十八页，讲稿共七十三页哦(二二)导致导致导致导致 A-CA-CA-CA-C 关系偏离朗伯比尔定律的原因关系偏离朗伯比尔定律的原因关系偏离朗伯比尔定律的原因关系偏离朗伯比尔定律的原因1.1.入射光的单色性不好入射光的单色性不好入射光的单色性不好入射
13、光的单色性不好设入射光由设入射光由 1 和和 2 两种波长组成，两种波长组成，对于对于 1总吸光度总吸光度对于对于 2I2I1I02I01偏离偏离偏离偏离 减小校准曲线的线性范围减小校准曲线的线性范围减小校准曲线的线性范围减小校准曲线的线性范围若若 1=2=在一定的在一定的浓浓度范度范围围内内 A=b C第十九页，讲稿共七十三页哦若若 1 2A-C曲曲线线向向浓浓度度轴轴弯曲，偏离弯曲，偏离beer定律，定律，负负偏离偏离*要获得较宽的线性范围要获得较宽的线性范围 1 2 越大，偏离越越大，偏离越严严重重 适当提高入射光的适当提高入射光的单单色性色性 在吸收光在吸收光谱谱的峰的峰值值(maxm
14、ax)处进处进行行测测定定1）一种为）一种为-很小，近似的认为很小，近似的认为 1=22）另外一种为）另外一种为-很大，但在选择的入射光波长附近曲线比较很大，但在选择的入射光波长附近曲线比较平坦，平坦，1=2第二十页，讲稿共七十三页哦2.非平行入射光引起的偏离，光程的变化引起信号的变化非平行入射光引起的偏离，光程的变化引起信号的变化3.介质不均匀引起的偏离，如胶体或浑浊溶液介质不均匀引起的偏离，如胶体或浑浊溶液若不平行，实际光程比吸收池厚度大，产生正偏离产生正偏离吸收和散射等，使检测到的吸光度偏大，产生正偏离第二十一页，讲稿共七十三页哦 浓度增高，吸光物质粒子平均距离减小，相互作用增强，电荷分
15、布改变，浓度增高，吸光物质粒子平均距离减小，相互作用增强，电荷分布改变，改改变。变。减小，向减小，向浓浓度度轴轴偏离；偏离；增大，向吸光度增大，向吸光度轴轴偏离。偏离。4.溶液浓度过高溶液浓度过高 5.溶液中发生了化学反应溶液中发生了化学反应（吸光物质 离解 缔合 异构互变 生成新物质）络合络合-离解离解 CrCr2 2O O7 72-2-+H+H2 2O 2CrOO 2CrO4 42-2-+2H+2H+350 375 Cr2O72-浓度不同浓度不同 离解度不同离解度不同 A-C 关系偏离关系偏离beer定律定律 聚合聚合-离解离解 MR M +R C (1-)C C *加入过量显色剂加入过量
16、显色剂 ，可使，可使 R保持不变，保持不变，为为定定值值，MR才能作才能作为为C的量的量度，度，A=KbC 成立。成立。稀溶液定律稀溶液定律CM的的初始浓度初始浓度MR M的的测测定定浓浓度度恒定恒定MR才能作才能作为为C的量度的量度第二十二页，讲稿共七十三页哦一、有机物的紫外可见吸收光谱一、有机物的紫外可见吸收光谱一、有机物的紫外可见吸收光谱一、有机物的紫外可见吸收光谱E E E E E E n E E *E E *（一）电子跃迁类型（一）电子跃迁类型 *E *n 第三节第三节 紫外可见吸收光谱紫外可见吸收光谱第二十三页，讲稿共七十三页哦跃迁类型跃迁类型 E max 结构特征结构特征 max
17、*最高最高 150 饱和化合物饱和化合物 104 中心离子和配位体之间，一方的电子向另一方轨道转移跃迁，所产生的吸收光中心离子和配位体之间，一方的电子向另一方轨道转移跃迁，所产生的吸收光谱称为荷移光谱。谱称为荷移光谱。第三十页，讲稿共七十三页哦3.3.中心离子影响下配位体中心离子影响下配位体中心离子影响下配位体中心离子影响下配位体 的的的的 -*跃迁跃迁跃迁跃迁 当金属离子与含有生色团及助色团的配位体配合后，受到金属离子的作用，配位体所含的共轭结构发生了变化，导致其吸收光谱蓝移或红移。*E 改变 E 蓝移 ；E 红移例：茜素磺酸钠在pH45时与Al3+的显色反应 Al3+/3max=420 n
18、mmax=475 nm茜素磺酸钠E 红移显色反应显色反应 反衬度反衬度 =显显-配配 60nm第三十一页，讲稿共七十三页哦一、比色法一、比色法1.1.目视比色法目视比色法目视比色法目视比色法 用眼睛观察比较溶液颜色以确定物质含量用眼睛观察比较溶液颜色以确定物质含量原理原理：间接应用比尔定律（观测吸收光的互补色光）间接应用比尔定律（观测吸收光的互补色光）仪器仪器：比色管：比色管方法方法：标准系列法：标准系列法特点特点：简单：简单 准确度不高准确度不高第四节第四节 紫外紫外-可见分光光度法及仪器可见分光光度法及仪器 第三十二页，讲稿共七十三页哦2.2.光电比色法光电比色法光电比色法光电比色法 用仪
19、器比较溶液颜色以确定物质含量用仪器比较溶液颜色以确定物质含量原理原理：朗伯朗伯-比尔定律（测定吸光度）比尔定律（测定吸光度）仪器仪器：比色计：比色计 方法方法：标准曲线法：标准曲线法 特点特点：单色光（纯度较差）：单色光（纯度较差）灵敏度和准确度较高灵敏度和准确度较高 使用参比溶液，一定选择性使用参比溶液，一定选择性 利用吸光度加和性，可做多组分测定利用吸光度加和性，可做多组分测定第三十三页，讲稿共七十三页哦二、分光光度法二、分光光度法 用仪器测定溶液吸光度以确定物质含量用仪器测定溶液吸光度以确定物质含量原理原理：朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 仪器仪器：分光光度计：分光光度计 方法方法：标准曲线
20、法：标准曲线法 特点特点：单色光（纯度高）：单色光（纯度高）灵敏度和准确度高灵敏度和准确度高 选择性好选择性好 利用吸光度加和性，可做多组分测定利用吸光度加和性，可做多组分测定 扩大波长范围，可测紫外、红外吸收扩大波长范围，可测紫外、红外吸收第三十四页，讲稿共七十三页哦0.575三、分光光度计基本部件三、分光光度计基本部件 光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器信号处理信号处理及输出及输出第三十五页，讲稿共七十三页哦1.光源光源基本要求：强 稳定 光谱区域宽 能量分布均匀 可见光源 卤钨灯 250 2000 nm紫外光源 氢灯 氘灯 185 350 nm 2.单色器单色器作用：从复合光中
21、获取单色光棱镜光栅玻璃，350 2500 nm,石英，185 4500 nm 透射光栅 反射光栅；平面光栅 凹面光栅玻璃，光学玻璃，石英多道多道：二极管阵列二极管阵列 电荷耦合器件（电荷耦合器件（CCD）电荷转移器件（）电荷转移器件（CID）狭缝 色散元件3.样品池样品池4.检测器检测器5.信号处理及输出信号处理及输出 表头、记录仪、屏幕、数字显示作用：将光信号转换为电信号，并放大单道单道：光电管光电管，光电倍增管；光电倍增管；第三十六页，讲稿共七十三页哦光电倍增管（光电倍增管（PMT）有暗电流电压要稳定放大倍数104107第三十七页，讲稿共七十三页哦0.575光源单色器吸收池检测器显示1.1
22、.工作原理工作原理工作原理工作原理 参比溶液参比溶液参比溶液参比溶液 I I0 0 调调调调 T=100%A=0 T=100%A=0；试液；试液；试液；试液 I I 补偿吸收池对光的吸收、反射，溶剂对光的吸收、散射，使补偿吸收池对光的吸收、反射，溶剂对光的吸收、散射，使I0成为真正只与被测物质有关的成为真正只与被测物质有关的I02.2.特点特点特点特点（一）单波长单光束分光光度计（一）单波长单光束分光光度计（一）单波长单光束分光光度计（一）单波长单光束分光光度计四、分光光度计构造原理四、分光光度计构造原理四、分光光度计构造原理四、分光光度计构造原理不能进行吸收光谱的自动扫描（不易绘制吸收光谱）
23、不能进行吸收光谱的自动扫描（不易绘制吸收光谱）不能进行吸收光谱的自动扫描（不易绘制吸收光谱）不能进行吸收光谱的自动扫描（不易绘制吸收光谱）精密度不高精密度不高精密度不高精密度不高(参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果)简单，廉价，适用于常规分析简单，廉价，适用于常规分析简单，廉价，适用于常规分析简单，廉价，适用于常规分析第三十八页，讲稿共七十三页哦（二）双光束分光光度计（二）双光束分光光度计（二）双光束分光光度计（二
24、）双光束分光光度计比值光束分裂器1.1.1.1.工作原理工作原理工作原理工作原理 精密度好（精密度好（精密度好（精密度好（I I I I0 0 0 0 和和和和 I I I I 变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）可进行吸收光谱的自动扫描（绘制吸收曲线）可进行吸收光谱的自动扫描（绘制吸收曲线）仪器复杂仪器复杂 较昂贵较昂贵2.2.特点特点特点特点I I0 0 和和和和 I I 同时（或交替）测量，统计处理。同时（或交替）测量，统计处理。同时（或交替）测量，统计处理。同时（或交替）测量，统
25、计处理。第三十九页，讲稿共七十三页哦仪器实物仪器实物第四十页，讲稿共七十三页哦仪器实物仪器实物1第四十一页，讲稿共七十三页哦第五节第五节 分析条件的选择分析条件的选择一、显色反应条件的选择一、显色反应条件的选择一、显色反应条件的选择一、显色反应条件的选择（一）显色反应及其类型（一）显色反应及其类型（一）显色反应及其类型（一）显色反应及其类型 无机阳离子的显色反应绝大多数都属于络合反应，其中三元络合物体系在光度分析中发展较无机阳离子的显色反应绝大多数都属于络合反应，其中三元络合物体系在光度分析中发展较快、应用较为普遍。重要的三元络合物体系主要由以下几种类型：快、应用较为普遍。重要的三元络合物体系
26、主要由以下几种类型：1 1混配型络合物体系混配型络合物体系混配型络合物体系混配型络合物体系 例如例如,V(V),V(V)可与可与H H2 2O O2 2和吡啶偶氮间苯二酚（和吡啶偶氮间苯二酚（PARPAR）形成）形成1 1：1 1：1 1的有色络合物。的有色络合物。2离子缔合物体系离子缔合物体系 例如，Ag+与邻二氮菲形成配阳离子，再与溴邻苯三酚红的阴离子作用形成深蓝色的离子缔合物。3.金属离子金属离子-配体配体-表面活性剂体系表面活性剂体系 如在Au-KI-丁基罗丹明B体系中加入曲通-100，水溶液中即可测定，值高达1.2 106。第四十二页，讲稿共七十三页哦显色反应基本要求显色反应基本要求
27、 1.1.选择性好选择性好选择性好选择性好 显色剂显色剂显色剂显色剂 R R不与共存组分显色或显色但不产生干不与共存组分显色或显色但不产生干不与共存组分显色或显色但不产生干不与共存组分显色或显色但不产生干扰扰扰扰=显显-配配 60nm2.2.灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 MRn MRn max max 大大大大3.3.精密度高精密度高精密度高精密度高 MRn MRn 稳定，组成恒定稳定，组成恒定稳定，组成恒定稳定，组成恒定4.4.显色反应条件易于控制显色反应条件易于控制显色反应条件易于控制显色反应条件易于控制第四十三页，讲稿共七十三页哦（二）（二）显色显色显色显色条件的选择条件的选择条件的
28、选择条件的选择1.1.显色剂的用量显色剂的用量显色剂的用量显色剂的用量M +nR =MRnM +nR =MRnn n 过量过量过量过量 定量定量定量定量n n 实际工作中，作实际工作中，作实际工作中，作实际工作中，作 A A C CR R 曲线，寻找适宜曲线，寻找适宜曲线，寻找适宜曲线，寻找适宜 C CR R 范围。范围。范围。范围。ACRA-CA-CR R曲线曲线曲线曲线第四十四页，讲稿共七十三页哦RH =R-+H+例：磺基水杨酸 Fe 3+紫红色pH=2 3FeRpH=4 7FeR2橙色pH=8 10FeR3黄色2.2.酸度酸度n 影响显色产物的组成影响显色产物的组成n 低酸度下一些金属离
29、子水解低酸度下一些金属离子水解实际工作中，作实际工作中，作 A pH 曲线，曲线，寻找适宜寻找适宜 pH 范围范围。n 影响显色剂的离解度影响显色剂的离解度ApHA-pH曲线第四十五页，讲稿共七十三页哦3.3.显色温度显色温度显色温度显色温度A T 曲线AT4.显色反应时间显色反应时间 作作 A t 曲线，寻找适宜曲线，寻找适宜 反应时间。反应时间。显色反应在一定温度下才能较快显色反应在一定温度下才能较快显色反应在一定温度下才能较快显色反应在一定温度下才能较快地进行地进行地进行地进行,一般室温即可一般室温即可一般室温即可一般室温即可 ,若需加热则须若需加热则须若需加热则须若需加热则须控制温度。
30、控制温度。控制温度。控制温度。显色显色反应完成需要一定的时间反应完成需要一定的时间；生成的配合物在一定的时间范围内稳定生成的配合物在一定的时间范围内稳定5.有机溶剂和表面活性剂有机溶剂和表面活性剂表面活性剂：胶束增溶，增稳；形成多元配合物表面活性剂：胶束增溶，增稳；形成多元配合物有有 机机 溶溶 剂：剂：提高显色灵敏度提高显色灵敏度第四十六页，讲稿共七十三页哦（二）测量条件的选择（二）测量条件的选择（二）测量条件的选择（二）测量条件的选择1.测量波长测量波长无干扰：选择 max有干扰：选择不重叠的较高峰AA最大吸收原则最大吸收原则吸收较大、干扰最小原则吸收较大、干扰最小原则第四十七页，讲稿共七
31、十三页哦当当T=0.368=36.8%时，仪器测量误差最小时，仪器测量误差最小此时此时，A=0.434A 0.15 0.8T 70 15%光源及检测器的不稳定性；吸收池状态位置的不确定性；读数的不确定性光源及检测器的不稳定性；吸收池状态位置的不确定性；读数的不确定性 2.吸光度范围的控制吸光度范围的控制改变测量波长改变测量波长 调节试液浓度调节试液浓度第四十八页，讲稿共七十三页哦3.参比液的选择参比液的选择参比液的选择参比液的选择作用作用 调节仪器零点，消除器皿及溶剂的吸收调节仪器零点，消除器皿及溶剂的吸收 扣除共存组分、显色剂及其他无关的吸收扣除共存组分、显色剂及其他无关的吸收无吸收无吸收
32、不显色不显色无吸收无吸收溶剂溶剂吸收吸收 不显色不显色无吸收无吸收不加显色剂的试液不加显色剂的试液无吸收无吸收 不显色不显色吸收吸收显色剂溶液显色剂溶液显色显色 吸收吸收吸收吸收掩蔽待测组分后加显色掩蔽待测组分后加显色剂剂 的试液的试液 A 试液试液=A 共存组分共存组分+A其他其他+A 待测吸光物质待测吸光物质 A 参比参比=A共存组分共存组分+A其他其他 显色剂 共存组分 参比溶液例：铬天箐测例：铬天箐测Al 3+，Cr 3+Ni2+干扰。用干扰。用F-掩蔽掩蔽Al3+作参比作参比第四十九页，讲稿共七十三页哦第六节第六节 吸光光度法的应用吸光光度法的应用一、定性分析一、定性分析（一）化合物
33、鉴定（一）化合物鉴定（二）有机物结构分析（二）有机物结构分析比较未知物和标准物的吸收光谱比较未知物和标准物的吸收光谱根据吸收曲线的特征推断化合物结构中的官能团和共根据吸收曲线的特征推断化合物结构中的官能团和共轭体系轭体系1 1比较光谱法，比较光谱法，2 2制作试样的吸收曲线并与标准紫外光谱对照；制作试样的吸收曲线并与标准紫外光谱对照；3 3利用利用Woodward-FieserWoodward-Fieser经验规则求最大吸收波长。经验规则求最大吸收波长。第五十页，讲稿共七十三页哦二、定量分析二、定量分析.（一）单组分的测定（一）单组分的测定1.校准曲线法校准曲线法 在确定的最佳显色反应条件和最
34、佳测量条件下分别测量一系列不同含量的标准溶液的吸光度,以标准溶液中被测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制A-c曲线，此即校准曲线。现代分析中大多要求以最小二乘法处理制作校准曲线的实验数据，得到一元线性回归方程。A=bC 第五十一页，讲稿共七十三页哦例：例：n n人血清中总蛋白的测定。在碱性溶液中，蛋白质分子中多肽的肽人血清中总蛋白的测定。在碱性溶液中，蛋白质分子中多肽的肽键可与铜离子作用生成紫红色络合物。在键可与铜离子作用生成紫红色络合物。在3737下，反应下，反应15min15min，一，一个铜离子可与个铜离子可与6 6个肽键形成配位键，不同种类蛋白的显色能力相似。个肽键形成配位键，不
35、同种类蛋白的显色能力相似。在在540 nm540 nm测定所形成络合物的吸光度，可以对人血清中总蛋白含测定所形成络合物的吸光度，可以对人血清中总蛋白含量进行测定。量进行测定。n n 葡萄糖在葡萄糖氧化酶葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD(GOD）作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢）作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢,后后者与酚及者与酚及4-4-氨基安替吡啉在过氧化物酶氨基安替吡啉在过氧化物酶(POD)(POD)作用下生成红色醌类作用下生成红色醌类染料化合物，在染料化合物，在500 nm 500 nm 波长处检测，可测定人血清或血浆中的葡波长处检测，可测定人血清或血浆中的葡萄糖含量。萄糖含量。H H2 2OO2
36、2+4-+4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉 +对氯苯酚对氯苯酚 过氧化物酶过氧化物酶 醌染料醌染料 +H+H2 2OO第五十二页，讲稿共七十三页哦甘油三脂的测定：甘油三脂的测定：甘油三脂甘油三脂 +H2O+H2O 脂肪酶脂肪酶 甘油甘油 +脂肪酸脂肪酸甘油甘油 +ATP+ATP 甘油激酶甘油激酶 甘油甘油-3-3-磷酸磷酸 +ADP+ADP甘油甘油-3-3-磷酸磷酸 +O+O2 2 甘油磷酸氧化酶甘油磷酸氧化酶 磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮 +H+H2 2OO2 2 HH2 2OO2 2+4-+4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉 +对氯苯酚对氯苯酚 过氧化物酶过氧化物酶 醌染料醌染料 +H+H2 2OO在在
37、500 nm 500 nm 波长处检测，可测定人血清中的甘油三脂含量波长处检测，可测定人血清中的甘油三脂含量 第五十三页，讲稿共七十三页哦2.双波长法双波长法光源单色器单色器检测器切光器12)原理原理对于对于 1：对于对于 2：选择合适的选择合适的 1 2 使使Ab1=Ab21）仪器）仪器A=Aa+Ab则则 A=A1-A2=Aa1-Aa2=KC3）波长组合的选择）波长组合的选择被测组分的被测组分的A 最大；干扰组分的最大；干扰组分的A=0A=02aAb Aa1=K1bCAa2=K2bC1 12 2第五十四页，讲稿共七十三页哦3.3.示差光度法示差光度法示差光度法示差光度法常规常规方法：方法：A
38、（0.150.80）；）；T（70%15%）以空白溶液为参比以空白溶液为参比示差法以浓度为以浓度为 Cs 的标准溶液为的标准溶液为参比参比ACCxA（Cs Cx）若样品浓度较大若样品浓度较大 T15%第五十五页，讲稿共七十三页哦*示差法提高准确度的实质示差法提高准确度的实质常规法常规法TxT0 5 1050100 落在测量落在测量误差误差较较 大大 的范围的范围示差法示差法T0 5 1050100TxTsTs 落在测量落在测量误差误差较较 小小 的范围的范围结论结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度假设假设 T=5%第五十六页，讲稿共七
39、十三页哦（二）多组分的测定（二）多组分的测定AXY 1 2解联立方程，可求得解联立方程，可求得Cx,Cy 为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得。为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得。1.若各组分吸收曲线不重叠若各组分吸收曲线不重叠 各自各自 进行测定进行测定2.若各组分吸收曲线重叠若各组分吸收曲线重叠联立方程组联立方程组联立方程组联立方程组第五十七页，讲稿共七十三页哦三、三、三、三、络合物的组成的测定络合物的组成的测定络合物的组成的测定络合物的组成的测定1.摩尔比法（饱和法）M +nR =MRnCM,固定；CR,从 0 开始增大CMRnCR在特定波长测定ACR/CMn第五十八页，讲稿共
40、七十三页哦M +nR =MRn保持 CM+CR=常数CM/C 从 0 1连续改变在特定波长测定A作图00.51.0ACM/C0.33n=1,CM/C=0.5n=2,CM/C=0.332.等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法第五十九页，讲稿共七十三页哦四、络合物条件稳定常数的测定四、络合物条件稳定常数的测定四、络合物条件稳定常数的测定四、络合物条件稳定常数的测定00.51.0ACM/CAA A由于络合物离解引起离解度MR =R +M总浓度 C平衡浓度C(1-a)CaCa将代入上式便可求出络合物的条件稳定常数第六十页，讲稿共七十三页哦五五五五.弱酸弱碱离解常数的测定弱酸弱碱离解常数的测定弱酸弱碱离解常
41、数的测定弱酸弱碱离解常数的测定HR =H+R-HR用光度法可以测定其离解常数 RAHRR HR R用吸光值表征，相对于pH作图，可求得pKa或第六十一页，讲稿共七十三页哦E=Ee+Ev+Er带光谱带光谱一、紫外一、紫外一、紫外一、紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱可见吸收光谱可见吸收光谱二、朗伯二、朗伯-比尔定律比尔定律 A=KbC1.液、气、固介质均适用液、气、固介质均适用2.2.入射光是单色光，平行光；稀溶液入射光是单色光，平行光；稀溶液 A=A1+A2+AnC:mol/L三、摩尔吸光系数三、摩尔吸光系数(L mol1 cm-1)吸光物质结构的特征参数吸光物质结构的特征参数;提高跃迁几率提高跃
42、迁几率 增大截面积增大截面积吸光物质定量分析的灵敏度参数吸光物质定量分析的灵敏度参数吸光度的加合性吸光度的加合性吸光度的加合性吸光度的加合性吸收曲线吸收曲线（A-曲线曲线）max 1/2小结小结小结小结第六十二页，讲稿共七十三页哦四、导致四、导致四、导致四、导致A-CA-C关系偏离朗伯比尔定律的原因关系偏离朗伯比尔定律的原因关系偏离朗伯比尔定律的原因关系偏离朗伯比尔定律的原因1.1.入射光的单色性不好入射光的单色性不好入射光的单色性不好入射光的单色性不好*要获得较宽的线性范围要获得较宽的线性范围 越大，偏离越越大，偏离越严严重重 适当提高入射光的适当提高入射光的单单色性色性 在吸收光在吸收光谱
43、谱的峰的峰值值(maxmax)处进处进行行测测定定 2.溶液浓度过高溶液浓度过高 3.溶液中发生了化学反应溶液中发生了化学反应单色光单色光 稀溶液稀溶液 显色剂过量显色剂过量第六十三页，讲稿共七十三页哦五、五、五、五、分析条件的选择分析条件的选择分析条件的选择分析条件的选择1.1.显色反应条件的选择显色反应条件的选择显色反应条件的选择显色反应条件的选择 基本要求基本要求基本要求基本要求1)1)选择性好选择性好选择性好选择性好 显色剂不与共存组分显色或显色但不产生干扰显色剂不与共存组分显色或显色但不产生干扰显色剂不与共存组分显色或显色但不产生干扰显色剂不与共存组分显色或显色但不产生干扰2)2)灵
44、敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 MRn MRn maxmax大大大大3)3)精密度高精密度高精密度高精密度高 MRn MRn 稳定，组成恒定稳定，组成恒定稳定，组成恒定稳定，组成恒定4)4)显色反应条件易于控制显色反应条件易于控制显色反应条件易于控制显色反应条件易于控制1.1.显色剂的用量显色剂的用量显色剂的用量显色剂的用量 过量过量过量过量 定量定量定量定量2.2.酸度酸度酸度酸度3.3.显色温度显色温度显色温度显色温度4.显色反应时间显色反应时间5.有机溶剂和表面活性剂有机溶剂和表面活性剂n n 条件的选择条件的选择条件的选择条件的选择第六十四页，讲稿共七十三页哦六、测量条件的选择（减小测
45、量误差六、测量条件的选择（减小测量误差）1.1.测量波长测量波长2.2.吸光度吸光度3.3.参比液参比液扣除共存组分、显色剂及其他无关的的吸收扣除共存组分、显色剂及其他无关的的吸收第六十五页，讲稿共七十三页哦0.575光源单色器吸收池检测器显示1.1.工作原理工作原理工作原理工作原理 参比溶液参比溶液参比溶液参比溶液 I I0 0 调调调调 T=100%A=0 T=100%A=0；试液；试液；试液；试液 I I 补偿吸收池对光的吸收、反射，溶剂对光的吸收、散射，使补偿吸收池对光的吸收、反射，溶剂对光的吸收、散射，使I0成为真正只与被成为真正只与被测物质有关的测物质有关的I02.2.特点特点特点
46、特点（一）单波长单光束分光光度计（一）单波长单光束分光光度计（一）单波长单光束分光光度计（一）单波长单光束分光光度计七、分光光度计七、分光光度计七、分光光度计七、分光光度计不能进行波长扫描，不能绘制吸收光谱不能进行波长扫描，不能绘制吸收光谱不能进行波长扫描，不能绘制吸收光谱不能进行波长扫描，不能绘制吸收光谱 精密度不高精密度不高精密度不高精密度不高(参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果参比溶液和试液不在同一时间测量，光源的波动影响测量结果)简单，廉价，适用于常规分析简单
47、，廉价，适用于常规分析简单，廉价，适用于常规分析简单，廉价，适用于常规分析第六十六页，讲稿共七十三页哦（二）双光束分光光度计（二）双光束分光光度计（二）双光束分光光度计（二）双光束分光光度计比值光束分裂器1.1.1.1.工作原理工作原理工作原理工作原理 精密度好（精密度好（精密度好（精密度好（I I I I0 0 0 0 和和和和 I I I I 变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）变化的幅度一致，补偿仪器的不稳定性）可绘制吸收曲线可绘制吸收曲线 仪器复杂仪器复杂 昂贵昂贵2.2.特点特点特点特点I I0 0 和和和和 I
48、 I 同时（或交替）测量，统计处理。同时（或交替）测量，统计处理。同时（或交替）测量，统计处理。同时（或交替）测量，统计处理。第六十七页，讲稿共七十三页哦波长组合的选择波长组合的选择 被测组分的被测组分的A A 最大；干扰组分最大；干扰组分的的A=0A=012aAb.（一）单组分的测定（一）单组分的测定有共存组分物质的光谱干扰有共存组分物质的光谱干扰（二）多组分的测定（二）多组分的测定联立方程组法联立方程组法联立方程组法联立方程组法 示差光度法示差光度法示差光度法示差光度法以浓度为以浓度为 Cs 的标准溶液为参比的标准溶液为参比双波长法双波长法.八、定量分析八、定量分析校准曲线法校准曲线法 标
49、准加入法标准加入法 常规法常规法T0 5 1050100 落在测量落在测量误差误差较较 大大 的范围的范围示差法示差法T0 5 1050100 落在测量落在测量误差误差较较 小小 的范围的范围第六十八页，讲稿共七十三页哦九、定性分析九、定性分析（一）化合物鉴定（一）化合物鉴定（二）有机物结构分析（二）有机物结构分析比较未知物和标准物的吸收光谱比较未知物和标准物的吸收光谱 根据吸收曲线的特征推断化合物结构中的官能团和共轭根据吸收曲线的特征推断化合物结构中的官能团和共轭体系体系第六十九页，讲稿共七十三页哦练习与思考作业题练习与思考作业题1.P137:21.P137:2，3 3，6 6，7 7，9
50、9，1010，11112.2.简述朗伯简述朗伯简述朗伯简述朗伯比尔定律成立的前提条件及物理意义比尔定律成立的前提条件及物理意义比尔定律成立的前提条件及物理意义比尔定律成立的前提条件及物理意义,写出其数学表达式。写出其数学表达式。写出其数学表达式。写出其数学表达式。3.3.摩尔吸收系数摩尔吸收系数摩尔吸收系数摩尔吸收系数 在光度分析中有什么意义在光度分析中有什么意义在光度分析中有什么意义在光度分析中有什么意义?如何求出如何求出如何求出如何求出 值？值？值？值？值受哪些因素的影响？值受哪些因素的影响？值受哪些因素的影响？值受哪些因素的影响？4.4.在光度法测定中引起偏离朗伯在光度法测定中引起偏离朗