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1、绝对定量和相对定量第1页，此课件共38页哦提纲：提纲：n实时荧光定量PCR原理 数学原理 化学原理n实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量n定量PCR的实验要素n平台定量PCR仪器介绍第2页，此课件共38页哦实时荧光定量PCR定义定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。第3页，此课件共38页哦与普通与普通PCR的区别的区别n普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。n实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。第4页，此课件共38页哦第5页，此课件共38页哦第6页，此课
2、件共38页哦第7页，此课件共38页哦n荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。n每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）。第8页，此课件共38页哦第9页，此课件共38页哦定量PCR的数学原理第10页，此课件共38页哦第11页，此课件共38页哦斜率与扩增效率第12页，此课件共38页哦第13页，此课件共38页哦荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan第14页，此课件
3、共38页哦1、SYBR Green 法第15页，此课件共38页哦SYBR Green 熔解曲线分析第16页，此课件共38页哦SYBR Green法优缺点n优点:n对DNA模板没有选择性n适用于任何DNAn使用方便-不必设计复杂探针n非常灵敏n便宜第17页，此课件共38页哦2、TaqMan探针法第18页，此课件共38页哦TaqMan作用机理第19页，此课件共38页哦TaqMan法优缺点第20页，此课件共38页哦 Real-time PCR 方法应用方法应用第21页，此课件共38页哦n绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究n相对定量
4、(Relative Quantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究第22页，此课件共38页哦绝对定量与相对定量的定义第23页，此课件共38页哦绝对定量通过标准品定量n绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：n含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒n含有和待测样品相同扩增片段的cDNAnPCR的产物第24页，此课件共38页哦绝对定量：从荧光到拷贝数第25页，此课件共38页哦相对定量通过内标定量n内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，
5、受环境因素影响小n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量第26页，此课件共38页哦相对定量：参照因子Calibrator 第27页，此课件共38页哦相对定量分析方法1 -Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：CT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)CT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值：CT=CT（test)-CT（calibrator)3、计算表达水平比率：2 CT=
6、表达量的比值第28页，此课件共38页哦相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F=对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度第29页，此课件共38页哦 定量PCR的实验要素第30页，此课件共38页哦样品DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL第31页，此课件共38页哦标准品第32页，此课件共38页哦标准品梯度稀释方法第33页，此课件共38页哦复管测试样品和标准品都要重复重复次数须遵循统计学要求第34页，此课件共38页哦平台PCR仪介绍ABI 7500 fast第35页，此课件共38页哦Rotor gene 6500HRM第36页，此课件共38页哦MJ Opticon 2第37页，此课件共38页哦 谢谢！第38页，此课件共38页哦