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1、基因工程第三章第1页，本讲稿共67页3.1.1分子杂交与印渍技术的原理分子杂交与印渍技术的原理分分子子杂杂交交：不不同同来来源源的的单单链链核核酸酸（DNA或或RNA），只只要要它它们们具具有有大大致致相相同同的的碱碱基基序序列列，经经过过退退火火处处理理，就就能能重重新新形形成成杂杂种种双双螺螺旋旋，这这一一现现象象称称为为分分子子杂杂交交（molecular hybridization）。）。3.1分子杂交与印渍技术分子杂交与印渍技术第2页，本讲稿共67页v0复性复性RNADNA第3页，本讲稿共67页v利利用用这这一一原原理理，就就可可以以使使用用已已知知序序列列的的单单链链核核酸酸片片段
2、段作作为为探探针针，去去查查找找各各种种不不同同来来源源的的基基因因组组DNA分分子子中中的的同同源源基基因因或同源序列。或同源序列。第4页，本讲稿共67页印渍技术：印渍技术：Blottingv印印渍渍技技术术的的原原理理首首先先由由Edwen Southern在在1975年提出。年提出。第5页，本讲稿共67页v其基本操作过程是：其基本操作过程是：v将将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳分离后，置片段在琼脂糖凝胶中电泳分离后，置NaOH液中液中浸泡，从而将凝胶中的浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链；变性为单链；v然后将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，上面放上大量吸水纸然后将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，
3、上面放上大量吸水纸巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单链巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单链DNA从凝胶中转移从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置到硝酸纤维素膜上，再将膜置80烘干并使单链烘干并使单链DNA分子固定在膜上，再用于分子杂交分析。分子固定在膜上，再用于分子杂交分析。第6页，本讲稿共67页分子杂交实验分子杂交实验第7页，本讲稿共67页SouthernBlotting第8页，本讲稿共67页印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用1、DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。2、RNA印迹技术印迹
4、技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。3、蛋白质的印迹分析、蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第9页，本讲稿共67页三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较第10页，本讲稿共67页探针技术：探针技术：v将将已已知知序序列列的的核核酸酸片片段段用用放放射射性性同同位位素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料进进行行标标记记，然然后后用用于于分分子子杂杂交交，杂杂交交后后通通过过放放射射自自显显影影、荧荧光光检检测测或或显显色色技技术术，使使杂杂交交区区带带显显现现出出
5、来。来。第11页，本讲稿共67页3.2PCR技术PCR：聚合酶链式反应：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），），是指利用耐热是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，聚合酶的反复作用，通过变性通过变性-复性复性-延伸的循环操作，在体外迅速将延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。模板扩增数百万倍的一种操作技术。第12页，本讲稿共67页PCR基本原理：变性基本原理：变性-复性复性-延伸延伸1变性：通常采用加热变性，即将模板变性：通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后的或延伸后的双链双链DNA加热到加热到940C，使双螺旋，使双螺旋DNA解开成为
6、单链。解开成为单链。2复复性性：通通过过降降低低反反应应温温度度至至500C-650C，使使两两种种引引物物能能与与两两条条解解开开的的DNA互互补补链链的的3端端粘粘合合，以以提提供供DNA聚聚合合酶催化聚合所需的酶催化聚合所需的3-OH。3延延伸伸：将将反反应应温温度度提提高高到到约约720C，在在耐耐热热DNA聚聚合合酶酶的的催催化化下下，根根据据模模板板DNA提提供供的的碱碱基基顺顺序序，合合成成两两条条互互补补链，从而使模板链，从而使模板DNA扩增一倍。扩增一倍。第13页，本讲稿共67页PCR技术特点技术特点1、高度的敏感性。、高度的敏感性。2、高度的特异性。、高度的特异性。3、操作
7、简便快速。、操作简便快速。4、样品适用广泛。、样品适用广泛。5、有一定程度的单核苷酸错误掺入。、有一定程度的单核苷酸错误掺入。第14页，本讲稿共67页引物引物 要扩增模板要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核序列互补的寡核苷酸片段苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度；两引物的，两引物间距离决定扩增片段的长度；两引物的5端决定扩增产物的两个端决定扩增产物的两个5末端位置。由此可见，引物是末端位置。由此可见，引物是决定决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也扩
8、增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。就更为重要。第15页，本讲稿共67页引物的设计：引物的设计：引物设计的必要条件是与引引物设计的必要条件是与引物互补的靶物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚，这两段已知序列物之间的序列未必清楚，这两段已知序列一般为一般为1821个碱基，可以用个碱基，可以用DNA合成仪合成仪合成与其对应互补的二条引物。合成与其对应互补的二条引物。第16页，本讲稿共67页（1）引物长度：）引物长度：18-21bp 18-21bp （2）（G+C）%含含量量：引引物物的的组组成成应应均均匀匀，尽尽量量避避免免含含有有相相同
9、同的的碱碱基基多多聚聚体体。两两个个引引物物中中（G+C）%含含量量一一般般以以40%60%为佳。为佳。（3）引物的结构：无明显的次级结构）引物的结构：无明显的次级结构（4）引物之间：不应发生互补）引物之间：不应发生互补(5(5）引物）引物3端配对精确和严格端配对精确和严格第17页，本讲稿共67页引物引物3555基因组基因组引物第18页，本讲稿共67页PCR的的反反应应原原理理第19页，本讲稿共67页PCR技术的基本过程TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板模板模板DNA
10、DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer循环循环仪仪9494o oC5949455 55 72 72 第20页，本讲稿共67页1 1、dNTP:PCR常常用用的的浓浓度度为为50200mol/L，不不能能低低于于1015mol/L。四四种种dNTP的的浓浓度度应应相相同。同。2 2、缓缓冲冲液液：10 mM Tris.HCl pH 8.3,50 mM KCl,1.5 mM MgCl2。3 3、模板、模板DNA：纯纯度与含量。度与含量。4、反、反应应参数。参数。PCR的影响因素的影响因素第21页，本讲稿共67页（1）变性变性-考虑酶的失活问题。一般为反应开始时用考虑酶
11、的失活问题。一般为反应开始时用95oC2-5 min，在后续循环中设为，在后续循环中设为94oC 30 s-1 min;（2）退火退火-退火温度取决于引物的碱基组成、长度及引退火温度取决于引物的碱基组成、长度及引物与模板的匹配程度，一般在物与模板的匹配程度，一般在Tm 20-25oC左右；时间一左右；时间一般为般为30 s-2 min；（3）延伸延伸温度一般为温度一般为72oC；时间取决于待扩增片段的长度。；时间取决于待扩增片段的长度。在通常情况下，在通常情况下，Taq酶的延伸速率约为酶的延伸速率约为2 kb/min，而，而pfu为为1 kb/min。（4）在最后一个循环结束后，需再在在最后一
12、个循环结束后，需再在72oC下延伸下延伸10 min，以产物完整。，以产物完整。第22页，本讲稿共67页 单单、双双链链DNA或或RNA都都可可以以作作为为PCR的的样样品品。若若起起始材料是始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条，须先通过逆转录得到第一条cDNA。为了保证反应的特异性，还应用为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆级的克隆DNA，g水平的单拷贝染色体水平的单拷贝染色体DNA或或102-105拷贝的待扩增片拷贝的待扩增片段作为起始材料。段作为起始材料。模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及结合
13、在聚合酶抑制剂以及结合在DNA上上的蛋白。的蛋白。第23页，本讲稿共67页模板的纯度、含量测定模板的纯度、含量测定260nm1OD 双链双链DNA 50g/ml 单链单链DNA 40g/ml OD 260nm/OD280nm1.8第24页，本讲稿共67页ddH2O37.60L10Buffer5LdNTPmixture(2.5mM)4L引物上引物上(20pmol/L)1L引物下引物下(20pmol/L)1LMgCl2(25mM)4L模板模板(102-105拷贝拷贝)0.5LDNAPolymerase0.4L总体积总体积50L第25页，本讲稿共67页95变性处理变性处理3min9430S5630S
14、721min30个循环个循环72延伸延伸7min第26页，本讲稿共67页第27页，本讲稿共67页PCR产物纯化 从从凝凝胶胶上上尽尽量量小小的的切切下下目目的的片片段段,放放在在一一个个干干净净的的EP管管中中，称称取取凝凝胶胶的的重重量量，并并加加入入3倍倍体体积积的的BufferS1(即即100mg胶胶加加300LBufferS1)；盛盛胶胶EP管管于于50水水浴浴10min，每每2-3min摇摇动动一一次次，至至胶胶彻彻底底融融化化；溶溶液液加加入入到到吸吸附附柱柱内内，13000rpm离离心心1min，弃弃去去收收集集管管中中的液体；的液体；第28页，本讲稿共67页加加入入0.5mL的
15、的Buffer W1洗洗涤涤DNA，13000rpm离离心心15sec；弃弃去去收收集集管管中中的的液液体体，再再加加入入0.5mL的的W1Buffer，静静置置1min，13000rpm离离心心15sec；弃弃去去收收集集管管中中的的液液体体，13000rpm离离心心1min；把把吸吸附附柱柱放放在在一一个个干干净净的的EP管管内内，在在柱柱子子膜膜中中央央加加入入30LBufferT1,室温放置室温放置1min,13000rpm离心离心1min。凝凝胶胶回回收收后后的的目目的的基基因因，各各取取5L电电泳泳检检测测，并并测测定定浓度以确定连接体系（此步必做）浓度以确定连接体系（此步必做）。
16、第29页，本讲稿共67页第30页，本讲稿共67页第31页，本讲稿共67页第32页，本讲稿共67页PCR的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆：（一）目的基因的克隆：vPCR技技术术是是迅迅速速获获得得一一定定量量的的目目的的基基因因以以用用于于基基因因克克隆的有效方法之一。隆的有效方法之一。v主主要要采采用用的的方方法法有有：利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因组因组DNA为模板，获得已知的目的基因；为模板，获得已知的目的基因；第33页，本讲稿共67页v利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中获得具有同源性的中获得具有同源性的DNA片段；片段；v利
17、利用用随随机机引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中随机获得目的基因。中随机获得目的基因。第34页，本讲稿共67页（二）基因的体外突变：（二）基因的体外突变：v采采用用随随意意设设计计的的引引物物，在在体体外外对对基基因因进进行嵌合、缺失、点突变等改造。行嵌合、缺失、点突变等改造。（三）（三）DNA的微量分析：的微量分析：v由由于于PCR技技术术具具有有高高度度敏敏感感性性，故故可可用用于微量于微量DNA的分析检测。的分析检测。第35页，本讲稿共67页v3.3 3.3 生物芯片生物芯片v生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）的概念）的概念指采用光导原位合成或微量点样
18、等方法，将大量指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品细胞等生物样品有序地固化有序地固化于支持物的表面，组于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。而判断样品中靶分子的数量。第36页，本讲稿共67页v根据生物分子之间特异性相互作用的原理，根据
19、生物分子之间特异性相互作用的原理，如如DNA-DNADNA-DNA、DNA-RNADNA-RNA、抗原、抗原-抗体、受体抗体、受体-配体之间可发生的复性与特异性结合，设配体之间可发生的复性与特异性结合，设计一方为探针，并固定在微小的载体表面，计一方为探针，并固定在微小的载体表面，通过分子之间的特性性反应，检测另外一通过分子之间的特性性反应，检测另外一方有无、多少或者结构改变等方有无、多少或者结构改变等第37页，本讲稿共67页v生生物物芯芯片片（BiochipBiochip或或BioarrayBioarray）是是指指包包被被在在固固相相载载体体上上的的高高密密度度DNADNA、抗抗原原、抗抗体
20、、细胞或组织的微点阵体、细胞或组织的微点阵(microarray(microarray）。）。v未来十年最具发展潜力的技术。未来十年最具发展潜力的技术。第38页，本讲稿共67页v生物芯片的主要特点：生物芯片的主要特点：高通量、微型化和自动化高通量、微型化和自动化v常用的生物芯片的分类：常用的生物芯片的分类：基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室第39页，本讲稿共67页基因芯片（基因芯片（GenechipGenechip）又称又称DNADNA芯片芯片,是根据核酸杂交的原理，将大是根据核酸杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品量探针分子固定于支持物上，
21、然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。行分析。第40页，本讲稿共67页2.2.蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)(proteinchip)利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。第41页，本讲稿共67页芯片实验室芯片实验室(labs-on-chip)(labs-on-chip)高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标
22、记高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统。及检测为一体的便携式生物分析系统。实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。第42页，本讲稿共67页3.4基因文库的构建第43页，本讲稿共67页基因基因文库文库基因基因组文组文库库第44页，本讲稿共67页第45页，本讲稿共67页第46页，本讲稿共67页基因文库限制性限制性内切酶内切酶克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培
23、养、鉴定基因组基因组DNADNA基因文库基因文库第47页，本讲稿共67页基因组DNA文库基因组DNA限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装第48页，本讲稿共67页cDNA文库的组建：基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAcDNA第49页，本讲稿共67页如何从基因文库中找到所需要的基因v根据目的基因的有关信息根据目的基因的有关信息v基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列v基因的功能基因的功能v基因在染色体上位置基因在染色体上位置v基因的转录产物基因的转录产物mRNAv基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质第50页，本讲稿共67页3.6酵母双杂交
24、系统酵母双杂交技术是酵母双杂交技术是1989年由年由Fields等最先应的。与其等最先应的。与其他技术相比，它省去了耗时耗力的蛋白表达纯化以及抗体他技术相比，它省去了耗时耗力的蛋白表达纯化以及抗体制备步骤，并且可以用于高通量的筛选，因此以其简便、制备步骤，并且可以用于高通量的筛选，因此以其简便、快捷与廉价的优点迅速发展成为一种常用的研究蛋白质相快捷与廉价的优点迅速发展成为一种常用的研究蛋白质相互作用的方法。根据对文献的统计，目前已知的蛋白质相互作用的方法。根据对文献的统计，目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。第51页，本讲稿
25、共67页v原理原理v转录激活因子在结构上是转录激活因子在结构上是组件式组件式的的(modular),即这些因即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中其中有有DNA结合结构域结合结构域(DNAbindingdomain,简称为简称为DB)和转录激活结构域和转录激活结构域(activationdomain,简称为简称为AD),它它们是转录激活因子发挥功能所必需的。们是转录激活因子发挥功能所必需的。v单独的单独的DB虽然能和启动子结合虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。但是不能激活转录。而而不同转录激活因子的不同转录激活因子的DB和和AD形
26、成的杂合蛋白仍然具有正形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。常的激活转录的功能。第52页，本讲稿共67页v酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。蛋白的相互作用。主要结构由含有主要结构由含有DNA结合域和结合域和DNA转录激转录激活域二类载体以及酵母报告株构成。活域二类载体以及酵母报告株构成。v将将DNABD与已知的诱饵蛋白质与已知的诱饵蛋白质X融融合合,构建出构建出BD-X质粒载体质粒载体;将将AD基因与基因与cDNA文库文库,基因片段或基因突变体基因片段或基因突变体(以以Y表示表示)融合融合,构建
27、出构建出AD-Y质粒载体。质粒载体。第53页，本讲稿共67页第54页，本讲稿共67页酵母双杂交系统的实验基本过程酵母双杂交系统的实验基本过程第55页，本讲稿共67页3.7DNA碱基序列测定碱基序列测定vDNA碱基序列测定即碱基序列测定即DNA一级结构的测定，目前常用一级结构的测定，目前常用的方法为的方法为Maxam-Gilbert建立的建立的化学裂解法化学裂解法和和Sanger建立的建立的双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法。第56页，本讲稿共67页双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：1获得待测获得待测DNA片段的单链模板：片段的单链模板：v一一般般采采用用基基因因
28、工工程程的的方方法法以以获获取取一一定定数数量量的的单单链链待待测测DNA模模板板。可可将将待待测测DNA片片段段与与噬噬菌菌体体M13DNA进进行行重重组组，然然后后将将其其导导入入大大肠肠杆杆菌菌进进行行增增殖殖，M13噬噬菌菌体体一一般般以以单单链链DNA形形式式透透出出细细胞胞再再感感染染新新的的细细菌菌，故故此此可可获获得单链得单链DNA模板。模板。第57页，本讲稿共67页2合成寡核苷酸引物：合成寡核苷酸引物：v在在待待测测DNA片片段段的的3-端端合合成成一一段段互互补补的的寡寡核核苷苷酸酸引引物物，其其顺顺序序可可为为待待测测DNA片片段段3-端端的的一一段段已已知知顺顺序序，也
29、也可可为为一一段段M13噬噬菌菌体体的的顺顺序序。可可利利用用DNA合成仪自动合成。合成仪自动合成。3模板模板-引物杂交：引物杂交：v将将待待测测单单链链DNA模模板板与与寡寡核核苷苷酸酸引引物物混混合合，并并在在适适当当温温度度条条件件下下进进行行保保温温处处理理，使使引引物物与与DNA单单链模板的链模板的3-端进行杂交。端进行杂交。第58页，本讲稿共67页4互补链的延长和终止：互补链的延长和终止：v将将上上述述杂杂交交混混合合液液分分为为四四份份，每每份份混混合合液液中中均均加加入入DNA聚聚合合酶酶，四四种种dNTPS，一一种种带带放放射射性性同同位位素素标记的脱氧核糖核酸（如标记的脱氧
30、核糖核酸（如-32P-dATP）。）。v此此外外，还还需需分分别别加加入入一一种种双双脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或或ddTTP）。然然后后在在适适当当温温度度条条件件下下延延伸伸互互补补链链，就就可可得得到到四四组组分分别别以以A、G、C、T，终终止止的的长长短短不不一一的的互互补补链链的的混混合合物物。因因在在互互补补链链合合成成时时，如如掺掺入入的的是是双双脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸，由由于于缺缺乏乏3-和和2-OH，故可导致互补链合成终止。，故可导致互补链合成终止。第59页，本讲稿共67页5电泳分离：电泳分离：v将将四四组组含含有有长长短短不不等等的的反反
31、应应混混合合物物在在同同一一聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶板板上上进进行行电电泳泳，即即可可将将只只相相差差一一个个核核苷苷酸的寡核苷酸链分离开。酸的寡核苷酸链分离开。6放射自显影：放射自显影：v将将电电泳泳凝凝胶胶与与X光光胶胶片片压压在在一一起起，于于低低温温下下自自显显影影数数天天，即即可可得得到到放放射射自自显显图图谱谱，通通过过该该图图谱谱即即可可直直接接读出核苷酸的排列顺序。读出核苷酸的排列顺序。第60页，本讲稿共67页第61页，本讲稿共67页第62页，本讲稿共67页Maxam-Gilbert化学修饰法化学修饰法(哈佛大学哈佛大学)该方法的基本原理是用化学试剂处理具该方法的基本原理是
32、用化学试剂处理具有末端放射性标记的有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测自显影之后，可直接读出待测DNA片段的片段的核苷酸序列。核苷酸序列。第63页，本讲稿共67页该反应的关键在于使该反应的关键在于使DNA的的4种核苷酸中，只有种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应：种发生特异性的化学切割反应：碱基的特异性修饰；碱基的特异性修饰；被修饰的碱基从核糖环上转移；被修饰的碱基从核糖环上转移；失去碱基的糖环部位发
33、生失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。链断裂。专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼和肼(hydrazine)。第64页，本讲稿共67页v硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使DNA链中链中鸟嘌呤的鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的和腺嘌呤的N6位发生甲基化，在位发生甲基化，在中性中性PH环境中就能使糖苷键发生水解，并引环境中就能使糖苷键发生水解，并引起起DNA链的断裂。在碱性条件下，肼能特异链的断裂。在碱性条件下，肼能特异性切割性切割C和和T。如果加入。如果加入1mol/L的的Nacl，那，那么，只有么，只有C被特异性切割。被特异性切割。第65页，本讲稿共67页第66页，本讲稿共67页第67页，本讲稿共67页