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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。二甲基亚砜诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化-二甲基亚砜诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化伴随凋亡现象的研究王秀丽虞星炬马小军中国科学院大连化学物理研究所1802组摘要目的：以小鼠胚胎干细胞系（ES-D3）为研究模型，应用诱导剂二甲基亚砜（DMSO）促进ES-D3向心肌细胞方向分化，明确其最佳诱导剂量及应用时间，旨在进一步标准化高效获得ES源心肌细胞的实验方法。同时探讨诱导剂量的DMSO在诱导ES-D3走向分化的同时，是否伴随有细胞凋亡现象的发生。方法：MTT法首先确定DMSO的应用剂量范围，然后设计不同条件培养基
2、对ES-D3进行诱导分化，并在形态学，蛋白质及基因水平对ES源心肌细胞进行鉴定。此外，利用形态学、流式细胞仪等技术对DMSO诱导细胞凋亡进行定性及定量分析。结果：DMSO的低细胞毒性参考剂量为1%，能够高效诱导ES-D3分化为心肌细胞（与阴性对照组比较，p0.01），诱导分化率可达96.7%。ES源心肌细胞不但能够表达多种心肌蛋白，而且其肌小节结构发育成熟。RT-PCR结果提示DMSO的促分化效应可能与心肌转录因子GATA-4的表达有关。此外，1%DMSO作用24h后即可诱导ES-D3细胞部分发生凋亡，并且随时间的延长而不断增强，分析该作用可能与凋亡相关基因p53的表达增高有关，而与抗凋亡基因
3、bcl-2无明显相关性。结论：1%DMSO不但能够高效诱导ES-D3分化为心肌细胞，而且还能够以时间依赖的方式诱导ES-D3细胞部分走向凋亡。即：诱导分化与促进凋亡并存于DMSO对ES-D3的作用体系。关键词胚胎干细胞二甲基亚砜心肌细胞分化凋亡一.引言胚胎干细胞（embryonicstemcell,ESC）是一类来自胚胎囊胚期内细胞团的多潜能细胞群，兼具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力。1981年，小鼠ES细胞系的成功建立成为干细胞研究领域的重要里程碑1。继之，ESC定向诱导分化的研究成为该领域的热点和难点课题。其中研究的较早也较为深入的是ESC向心肌细胞方面分化的研究2,3。这不但为发育
4、生物学提供了宝贵的体外研究模型，而且还为心肌损伤后的细胞治疗提供了理想的种子细胞。但是，因ESC自发性分化为心肌细胞的比率很低(95%），低毒剂量为%（生长率70-80%），故选择其低毒剂量为诱导分化的最大参考剂量。图1.DMSO对ES-D3的细胞毒性曲线1.2ES-D3的诱导分化及ES源心肌细胞的鉴定.1DMSO对ES-D3细胞的诱导分化效应诱导分化至第9d（贴壁诱导第2d），即可在相差显微镜下观察到跳动的心肌合胞体，其初始收缩频率为47-60beats/min，2-3天后增至80-102beast/min。维持培养过程中细胞体积逐渐增加，且观察到心肌细胞彼此相连成条索状规律收缩。细胞克隆可
5、维持跳动最长达70d。本实验设计不同浓度DMSO条件培养基，以摸索其最佳诱导应用剂量。结果表明：与不加任何诱导剂的对照组比较，1%DMSO能显著提高ES-D3向心肌细胞的诱导分化率(p0.01)，其最高可达96.7%，且该诱导作用具有一定的剂量依赖性。但当DMSO浓度达到2%时，其对于ES-D3的细胞毒性已明显表现出来，培养基中可见大量死亡细胞。具体见Table2：表2不同浓度DMSO对ES-D3分化为心肌细胞的影响DMSO浓度(%)接种Ebs(个)跳动EBs(个)跳动分化百分率(%)0402.01.05.00.54014.03.6*35.00.84028.34.0*70.81.04038.7
6、1.596.72.0408.33.1#20.8分别与对照组比较：p0.01,*p0.01，#p0.05,(s,n=3).2ES源心肌细胞的鉴定.1免疫组化检测心肌蛋白的表达及电镜观察源于ES-D3的跳动细胞克隆均不同程度的表达心肌蛋白desmin，cTnT。激光共聚焦图像同时显示心肌a-actin和a-actinin（+），肌小节结构发育成熟，与阳性对照正常新生小鼠心肌细胞无明显区别（图2，图3）。cba图2由ES-D3分化而来的心肌细胞表达心肌蛋白desmin(a)和cTnT(b)，（c）为PBS代替一抗的阴性对照（石蜡切片免疫组化DAB染色，100）cba图3.1%DMSO诱导ES-D3分
7、化的心肌细胞表达心肌a-acitin和a-acitinin的免疫荧光检测(激光共聚焦显微镜，红色代表a-acitin，绿色代表a-acitinin，hoechst33258复染细胞核，1000).2RT-PCR检测GATA-4，MLC-2vmRNA的表达RT-PCR产物的电泳结果见图4，可见自发性分化的ES-D3细胞在分化第6d开始少量表达心肌转录因子GATA-4；而经1%DMSO作用24h后，即诱导分化第4天，即可检测到GATA-4mRNA的表达，且伴随作用时间的延长（48h，72h），其表达量不断增加。检测经诱导分化至第20天的RT-PCR产物，其心室特异性基因肌球蛋白轻链MLC-2vmR
8、NA表达（+）。2 DMSO诱导部分ES-D3细胞凋亡2.1ES-D3细胞凋亡的形态学改变及特征性DNA“ladder”ES-D3细胞经DMSO诱导作用24h后，在倒置显微镜下可观察到部分细胞皱缩变圆，体积缩小，随着作用时间的延长，细胞表面逐渐凸起小膜泡，细胞核浓缩边集，不断脱落悬浮于培养集中。提取不同时间的细胞基因组DNA，通过agrose电泳显示以180-200bp为单位的DNA“ladder”。随着DMSO作用时间的延长，该凋亡效应不断增强。图5.(a)1%DMSO诱导ES-D3细胞在分化过程中表达心肌细胞转录因子GATA-4。1:DL2000marker(TaKaRa);lane，2:
9、阴性对照（EBsd6，0%DMSO），3,4,5分别为EBsd4,d5,d6(1%DMSO).-actin为内参照基因。(b)AlphaImager2002软件对RT-PCR结果的半定量分析(*p0.01,*p0.05)。(b)为1%DMSO诱导部分ES-D3细胞表达心室肌细胞的特异性基因MLC-2v,1,3为内参照基因-actin，2为自发性分化的阴性对照组，4为1%DMSO诱导组。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp54321GATA-4275bp(a)54321-actin568bp(b)*12345-actin568bpMLC-2v500bp(c)87654
10、321300bp图6-1.1%DMSO作用72h后部分ES-D3细胞悬浮于培养集中，形态皱缩变圆，细胞核浓缩边集。图6-2.DMSO作用后部分ES-D3细胞发生凋亡的DNA“ladder”（1为自发性分化第6天的阴性对照组；2，4，6分别为1%DMSO作用24h，48h，72h；3，5，7分别为2%DMSO作用24h，48h，72h;8位100bpmarker.FCM定量检测ES-D3细胞凋亡采用FCM及其所携带软件计算细胞凋亡率，结果表明：在自发性分化的过程中（分化培养第d）即有少量细胞发生凋亡，其调亡率为1.94%；但经1%DMSO作用不同时间后，其细胞凋亡率显著增加（图7，*p0.01,
11、n=3），由此表明DMSO对细胞的促凋亡效应。2.3RT-PCR检测凋亡相关基因p53，bcl-2mRNA的表达ES-D3细胞经DMSO作用后，凋亡相关基因表达水平上调，伴随作用时间的延长，其表达量不断增加；而bcl-2mRNA的表达一直处于较低水平，过程中未见显著改变（图9）Apoptosis:1.94%0.22%Apoptosis:1.76%0.24%*Apoptosis:7.32%0.96%*Apoptosis:14.87%1.13%图7.FCM定量检测1%DMSO作用不同时间后部分细胞ES-D3发生凋亡的亚二倍体峰。（R-2，R-3，R-4分别为1%DMSO作用24h，48h，72h，
12、自发性分化第6天为对照组）2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp54321Figure9.图1%DMSO作用不同时间后，ES-D3细胞p53及bcl-2mRAN表达变化（3，4，5分别为1%DMSO作用24h，48h，72h；2为自发性分化第6天的阴性对照组；1为DL2000marker。(c)AlphaImager2002软件对RT-PCR结果的半定量分析(*p0.01,*p0.05l).p53479bp(a)54321Bcl-2304bp(b)54321-actin568bp*(c)四.讨论胚胎干细胞ES-D3来源于小鼠4d胎龄囊胚的内细胞团，因其具有分化全能性和
13、无限增殖的能力而在干细胞研究中广泛应用6，7。本实验基于前人的研究工作，以化学诱导剂DMSO作用于ES-D3细胞，旨在摸索其最佳诱导条件以标准化获得ES源心肌细胞的方法。结果表明：以自发性分化的阴性对照组比较，DMSO（分化第3d始加入）能够以剂量依赖的方式显著促进ES-D3细胞向心肌细胞的分化。其最佳诱导剂量为1%，诱导分化率最高可达96.7%，且该方法具有相当理想的可重复性。在此基础上，我们还分别利用免疫组织化学技术和RT-PCR方法对跳动的细胞克隆进行了蛋白表达及基因水平的鉴定。结果表明：这些细胞克隆均可不同程度的表达多种心肌蛋白，肌球蛋白轻链MLC-2vmRNA表达阳性。在胚胎发育过程
14、中，基因MLC-2v最早表达于胚胎第8d心管的心室肌细胞，其心室肌特异性远高于肌球蛋白重链基因（MHC），因此成为心肌发育过程中的重要分子标志之一14。由此我们可以认为：这些细胞克隆均为由ES-D3分化而来的心肌细胞；且激光共聚焦图像提示：这些ES源心肌细胞的肌小节结构已经发育得相当成熟，几近于阳性对照新生鼠心肌细胞的结构15。诸多因素可以影响ES细胞向心肌细胞的诱导分化率及分化成熟程度。Wobus等16认为：包括：细胞种类及未分化状态；EB形成的质量、贴壁时间及种植密度；所选用的培养基及诱导剂的添加等。本研究在诱导分化过程中对上述因素分别加以标定，使得应用1%DMSO显著提高了ES向心肌细胞
15、的分化率。DMSO是一种非质子型溶剂，因其对多种物质及化学反应都具有特殊的溶媒效应而广泛应用于生物学及生物化学研究，但DMSO本身的生物学效应至今仍未完全阐明。20世纪70年代，人们先后发现DMSO对白血病细胞株K562、HL60等具有不同程度的诱导分化和促进凋亡效应。McBurney等4（1982年）以胚胎瘤细胞系P19为研究模型，首次证明DMSO能够促进ES细胞向包括心肌细胞在内的中胚层发育，但对其相关机制未做深入探讨。此后的研究对机制方面的报道也较少，且所用细胞模型及具体诱导方法不一。本实验在标准化DMSO诱导应用的剂量和时间流程基础上，还利用RT-PCR方法初步探讨了DMSO诱导分化与
16、心肌转录因子GATA-4的相关性。GATA-4是一种心肌特异性的锌指结构转录因子，在心脏发育早期即有表达且持续至整个心脏发育过程。研究表明：GATA-4是多种心肌特异性基因的转录激活剂及关键调节子。Grepin等17利用反义核苷酸抑制GATA-4的表达，发现P19细胞向心肌细胞的发育被阻断且有部分细胞走向凋亡。本研究结果表明：ES-D3自发性分化的第6d开始表达转录因子GATA-4，该结论与国外报道一致18。而经1%DMSO作用后，GATA-4的表达提前至第4d，且其表达水平随着DMSO作用时间的延长而不断增加。由此提示：DMSO促进ES-D3细胞向心肌细胞方向分化可能是首先作用于GATA-4
17、,使该基因提前开放表达的同时上调其表达水平，从而实现其促进心肌细胞分化的作用。而目前国内外对此并无详细报道。但关于DMSO究竟是如何作用于GATA-4；GATA-4的表达与心肌细胞的分化这一时相过程又有怎样的分子生物事件发生-这些问题目前尚未明确。此外，上述我们已经提及：在细胞生物学研究中，DMSO不但可以促进细胞分化，而且还具有诱导肿瘤细胞凋亡的效应。但对于DMSO是否在促进ES-D3细胞分化的同时也能够诱导部分细胞走向凋亡？对此，国内外尚无报道。而我们在上述ES-D3细胞诱导分化的研究过程中，每次换液时都发现培养基中存在一定量的悬浮死亡细胞。由此我们想及：是否DMSO在诱导ES-D3部分细
18、胞走向心肌分化的同时也使部分细胞走向了凋亡？检测结果证实了我们上述的假设：1%DMSO作用24h，在分化的同时即有部分细胞发生典型的凋亡形态学改变，呈现DNA“ladder”；FCM检测其凋亡率为1.76%，且该效应具有一定的剂量依赖性和时间依赖性。由此初步证明DMSO能够诱导部分ES-D3细胞产生凋亡。素有“万能溶媒”之称的DMSO自介入细胞生物学领域以来，其复杂的生物学效应正逐步为国内外学者所认识。既往研究表明：对于不同的细胞株，DMSO具有不同的生物学作用。除了诱导分化19、抵抗凋亡刺激信号，还可导致细胞周期停滞并发生细胞凋亡6，7。但相关机制的探讨却是众说纷纭：DMSO能功能修饰p53
19、或上调bcl-2表达水平以诱导永生化细胞走向凋亡；也可通过CSF-1干扰自分泌生存环诱导巨噬细胞系发生凋亡；而在U937细胞系中，DMSO诱导凋亡可能与不确定的某种酪氨酸激酶有关20；在RPMI-8402胸腺淋巴瘤细胞系所诱导可因PKC的激活而增强。本研究证明：1%DMSO在促进ES-D3细胞分化的同时也能够诱导部分细胞产生凋亡，而后者与凋亡相关基因p53表达水平存在一定的相关性，而与抗凋亡基因bcl-2的表达无明显相关。此外，我们近期的免疫组化结果表明：该过程中Fas，Fas-L，BCL-2蛋白均低水平表达，但P53及BAX蛋白呈现强阳性（本文未提供，尚在整理中）。提示P53及BAX可能在蛋
20、白及基因水平参与了由DMSO引发的胚胎干细胞凋亡途径。综上，我们知道，在组织、器官乃至整个胚胎有机体发育的过程中，细胞增殖、分化及凋亡等生物学现象组成一个复杂的动态平衡系统。它们之间的对立与统一才构成完整的生命运动。我们的研究发现ES-D3在自发性分化的过程中也伴随着凋亡现象的发生。这不但进一步为上述结论提供了有力的论据，而且也充分说明ES细胞是模拟胚胎体内发育过程的理想体外模型。此外，我们还证明：DMSO不但能够诱导ES-D3向心肌细胞的分化，而且还能促进部分细胞走向凋亡。如果从发育生物学的宏观角度来解释，这是生命运动辩证统一的体现，是对生命现象的一种诠释。当然，对于这其中复杂的信号转导机制
21、的阐明尚需大量深入的研究。参考文献1. EvansMJ,KaufmanMH.Establishmentincultureofpluripotentialcellsfrommouseembryos.Nature,1981,292(5819):154-1562. DoetschmanTC,EistetterH,KatzM,etal.Theinvitrodevelopmentofblastocyst-derivedembryonicstemcelllines:formationofvisceralyolksac,bloodislandandmyocardian.JEmbryolExpMorph,19
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32、ysicsAbstract：ObjectiveTooptimizethehighefficiencyofDimethylsulfoxide(DMSO)inthegenerationofcardiomyocytesderivedfrommouseembryonicstem(ES)cells.Inaddition,toinvestigatewhethertheapoptoticeffectalsohappenedwhen1%DMSOwasadministratedtoinducethedifferentiationofEScellline.MethodsAsaclassicalmorphogen,
33、DMSOwasappliedtopromotethedifferentiationofES-D3cells.TheES-derivedcardiomyocyteswereidentifiedbytheimmunocytochemicalanalysis.AndtheexpressionofGATA-4gene,cardiacspecifictranscriptfactor,wasalsodetectedbyRT-PCR.ApoptoticeffectwascharacterizedbythemorphologicalchangeandthegenomeDNAelectrophoresis.Ap
34、optoticsub-G1peakwasanalyzedbyflow-cytometer.Andtherelatedapoptoticgenesincludingp53andbcl-2weredetectedbyRT-PCR.ResultsES-D3cellssuccessfullydifferentiatedintocardiomyocyteswhen1%DMSOwasmixedintheculturemediumandadministratedfromday3.TheES-derivedcardiomyocyteswerecharacterizedbytheexpressionsofcar
35、diacproteinsandtheventricularspecificgeneMyosinLightChain-2v.1%DMSOmightup-regulateGATA-4expression.Inaddition,DMSOwasalsodiscoveredtoinduceapoptoticchangeintheES-D3celllineatcertainconcentrations.After24hours,1%DMSOwasfoundtoinducesub-G1peakandnucleosomalladderformation.Itwasalsofoundthattheup-regu
36、lationofp53mRNAoccurredfollowing1%DMSOtreatmentforover24hour,butnoobviouschangewasnoticedwiththeexpressionofbcl-2mRNA.ConclusionTheadministrationof1%DMSOmightinducedifferentiationintocardiomyocytes,alsoinducethecellsapoptosisinthemouseembryonicstemcellline.KeyWords：embryonicstemcell;dimethylsulphoxide;cardiomyocyte;differentiation;apoptosis-