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1、基因工程第三章基因工程的载体2022/10/9苏州科技学院生物系 叶亚新第1页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新发展概况发展概况 1.1.第一阶段（第一阶段（19771977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313pSC101,colE1,pCR,pBR313和和pBR322(1977,Bolivar pBR322(1977,Bolivar et et alal)2.2.第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），
2、建立多克隆位增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如点区和新的遗传标记基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。3.3.第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表达启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。型载体及各种探针型载体。第2页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新第三章 基因工程的载体n作为基因工程
3、载体的基本功能基本功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件第3页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第三章 基因工程的载体n作为基因工程载体必须具备的基本条件基本条件1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记第4页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系
4、苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新遗传标记基因遗传标记基因 1.1.标记基因的作用标记基因的作用 1 1）指示外源）指示外源DNADNA分子（载体或重组分子）分子（载体或重组分子）是否进入宿主细是否进入宿主细胞胞 这种指示可以是选择性的（这种指示可以是选择性的（ApApr r ，TcTcr r ，KanKanr r），也可以是非选择性），也可以是非选择性的（如的（如lacZlacZ）2 2）指示外源指示外源DNADNA分子分子是否插入载体分子是否插入载体分子形成了重组子。形成了重组子。*这种指示也可以是这种指示也可以是选择性选择性的（如的（如TcTcS S），也可以是），也可以是非选
5、择性非选择性的的（如（如TcTcS S，lacZ,GUSlacZ,GUS），绝大多数为后者。），绝大多数为后者。*有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的非选择性的检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZlacZ，GUSGUS等）。等）。第5页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系
6、叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新2.2.标记基因的种类标记基因的种类 1 1）抗性标记基因抗性标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子）a.a.抗生素抗性基因抗生素抗性基因:Ap:Apr r ，TcTcr r ，CmCmr r，KanKanr r，G418G418r r，HygHygr r，NeoNeor r b.b.重金属抗性基因重金属抗性基因:Cu:Cur r ，ZnZnr r ，Cd Cd r r c.c.代谢抗性基因代谢抗性基因:TK:TK，抗除草剂基因，抗除草剂基因 2 2）营养标记基因营养标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必
7、需营养物合成酶类的基因，主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类这类基因在酵母转化中使用最频繁，如基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1TRP1，URA3URA3，LEU2LEU2，HIS4HIS4等。等。3 3）生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ,GUS,CATlacZ,GUS,CAT 4 4）噬菌斑噬菌斑 第6页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新3.3.使用标记基因注意要点使用标记基因注意要点
8、1 1）标记基因与宿主细胞）标记基因与宿主细胞 2 2）标记基因产物的作用机制）标记基因产物的作用机制:Ap:Apr r 3 3）标记基因的结构与适用范围）标记基因的结构与适用范围:基因启动子基因启动子,翻译起翻译起始序列始序列,密码子偏爱性密码子偏爱性 4 4）标记基因的结构变化对功能的影响）标记基因的结构变化对功能的影响:LacZ,GUS:LacZ,GUS 4.4.常用的遗传标记基因常用的遗传标记基因 1)1)四环素抗性基因四环素抗性基因（TcTcr r）Tetracycline Tetracycline 可结合在核糖体可结合在核糖体30s30s亚基中的一种蛋白质分子上，亚基中的一种蛋白质
9、分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs399 AAs蛋白质，与蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。第7页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新2)2)氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（ApApr r）AmpicillinAmpicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。ApApr r抗性基因编抗性基因编码一种
10、分泌到细菌细胞周间质的酶，催化码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺环的内酰胺环的水解水解，使氨苄青霉素失，使氨苄青霉素失活。活。3)3)氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（CmCmr r）ChlorophenicolChlorophenicol可结合在核糖体可结合在核糖体50 S50 S亚基上，阻止蛋白质合成。亚基上，阻止蛋白质合成。CmCmr r基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。在核糖体上。4)4)卡那霉素卡那霉素(Kan(Kanr r),),新霉素新霉素(Neo(Neor r)
11、和和G418G418抗性抗性(G418(G418r r)基因基因 KanamycinKanamycin，NeomycinNeomycin和和G418G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr r抗性基因均可使这类抗生素抗性基因均可使这类抗生素磷酸化磷酸化，使之不能进入细胞内。，使之不能进入细胞内。第8页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶
12、亚新叶亚新叶亚新5 5）半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ lacZ 和和lacZlacZ）半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs1021 AAs，基因产物不具酶活性，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链和链。链。前者负责四聚体装配，后者具前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用互补作用。这两个部分可独立存在，。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为分别由两个基因编
13、码。为链编码的基因称之为链编码的基因称之为lacZlacZ(编码编码145 AAs)145 AAs)。这两个。这两个基因（基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作为标记基因。）均可作为标记基因。半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点:a.a.酶催化酶催化X-GalX-Gal水解为兰色产物，检测直观水解为兰色产物，检测直观 b.lacZ b.lacZ编码编码5-5-端可容许很大的变化而不影响酶活性端可容许很大的变化而不影响酶活性 c.lacZ c.lacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大第9页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系
14、苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新6 6）葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUSGUS）该基因编码一种可分解各种该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述该标记基因除具有上述lacZlacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。因为许多生物中没有这种基因。7 7）荧光素酶基因荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在
15、反应中加入在反应中加入CoACoA，可使灵敏度提高，可使灵敏度提高1010倍；或由发光细菌（倍；或由发光细菌（Photobacterium Photobacterium fischerifischeri）产生的荧光素酶，它与）产生的荧光素酶，它与FMN-FMN-氧化还原酶联用，通过氧化还原酶联用，通过NAD(P)HNAD(P)H的的变化测定酶活变化测定酶活。8 8）发光蛋白质基因发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。菌菌落呈蓝色。第10页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院
16、生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新 分子克隆载体的复制起点与种类分子克隆载体的复制起点与种类1.1.复制起点的种类复制起点的种类 1)1)核内复制起点核内复制起点 a.a.染色体复制起点染色体复制起点原核生物原核生物(环状环状)和真核生物和真核生物(线状线状)染色体染色体 b.b.染色体外复制起点染色体外复制起点 i.i.质粒质粒DNA,RNA,DNA,RNA,线状线状,环状环状,单链单链,双链双链 ii.ii.病毒病毒同上同上,细胞内和病毒颗粒内细胞内和病毒颗粒内 2)2)核外复制起点核外复制起点 a.a.线粒体线粒体所有真核细胞所有真核细
17、胞 b.b.叶绿体叶绿体所有绿色植物细胞所有绿色植物细胞 原核与真核生物原核与真核生物两种质体中亦可能含有质粒两种质体中亦可能含有质粒第11页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新3.3.按复制起点划分克隆载体按复制起点划分克隆载体 1)1)质粒复制型质粒复制型复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体 2)2)ARSARS复制型复制型ARSARS（autonomus replicative sequence)autonomus replicative sequence)，或，或
18、称染色体复制型称染色体复制型3)3)病毒复制型病毒复制型复制起点来自病毒，若为复制起点来自病毒，若为RNARNA病毒，必须反转录病毒，必须反转录为为cDNAcDNA。4)4)混合复制型混合复制型 a.a.同种生物复制起点混合同种生物复制起点混合质粒形式存在；质粒或病质粒形式存在；质粒或病毒形式存在毒形式存在第12页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新例：大肠杆菌（例：大肠杆菌（E.coliE.coli）的）的噬粒噬粒（phagemidphagemid）载体既含有来自质粒）载体既含有来自质粒的复制起点
19、，又含有来自噬菌体（如的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13M13）的复制起点。在不）的复制起点。在不同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而获得质粒获得质粒ds-DNAds-DNA或噬菌体或噬菌体ss ss DNADNA又如：酿酒酵母（又如：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）的某些载体既含有）的某些载体既含有质粒（质粒（22）复制起点，又含有）复制起点，又含有ARSARS片段片段 b.b.不同生物复制起点混合不同生物复制起点混合穿梭载体穿梭载体（shutt
20、le vectorshuttle vector）两两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在以质粒或病毒形式存在 *穿梭载体范围穿梭载体范围：细菌：细菌细菌（放线菌），细菌细菌（放线菌），细菌酵母菌，酵母菌，细菌细菌真菌，细菌真菌，细菌动物动物第13页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝数的关分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝数的关系系
21、 1.1.复制起点种类与拷贝数间的关系复制起点种类与拷贝数间的关系1)1)质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，1-2 copies1-2 copies，受宿主染色体基因控制），受宿主染色体基因控制）；高拷贝（松弛型，；高拷贝（松弛型，20 copies20 copies，受宿主染色体控制较弱），受宿主染色体控制较弱）2)ARS 2)ARS型载体：拷贝数较高（约型载体：拷贝数较高（约20 copies20 copies）3)3)病毒型复制起点：高拷贝病毒型复制起点：高拷贝 2.2.标记基因与拷贝数的关系标记基因与拷贝数的关系 若若标标记记基基因因表表达达效效率率高
22、高，宿宿主主细细胞胞可可能能不不大大量量产产生生标标记记基基因因以以满满足足选选择择压压力力要要求求，因因而而载载体体拷拷贝贝数数会会降降低低。对对于于不不同同标标记记基基因因，可可采采取取相相应应方方法法提提高高其其拷贝数。拷贝数。如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。对对于于营营养养标标记记基基因因，可可降降低低该该基基因因的的表表达达效效率率或或更更换换其其他他低低效效率率的标记基因的标记基因第14页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新分子克隆载体
23、的转化频率和稳定性分子克隆载体的转化频率和稳定性 1.1.影响转化频率的因素影响转化频率的因素 1)1)复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点 2)2)标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因 2.2.影响稳定性的因素影响稳定性的因素 1)1)复制起点类型复制起点类型低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性差性差 2)2)选择压力选择压力 3)3)载体在宿主细胞中的状态载体在宿主细胞中的状态自主复制型和整合型自主复制型和整合型 宿主细胞的遗传特性和生理特性宿主细胞的遗传特性和生理特性第15页，本讲稿
24、共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质1、定义 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA,ccc DNA）第16页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n自主复制性自主复制性n质粒
25、DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制 第17页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n不相容性不相容性n利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，几种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。第18页，本讲稿共58页2022/10/9苏州
26、科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n可扩增性可扩增性npMB1或ColEI类质粒在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增氯霉素扩增。第19页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新第一节 E.col
27、i 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质2、特征n携带遗传标记携带遗传标记 n在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞，就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。第20页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新第一节 E.coli 质粒载体一、质粒（plasmid）的一般性质3、分类 接合型和非接合型 严紧性和松弛型在基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒第2
28、1页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建1、理想质粒载体所具备的条件n质粒较小n质粒带有可供选择的标记n带有尽可能多的单一限制酶切位点n应有较高的基因表达能力第22页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建2、质粒人工构建的目的n 天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用
29、作基因工程的载体必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件加装特殊的基因元件方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。第23页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新1.多拷贝质粒多拷
30、贝质粒 经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。2.测序质粒测序质粒 拷贝数高，加装测定顺序所必需的序列，如多切口接头，便于各种片段方便克隆 3.整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上4.穿梭质粒穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制 5.表达质粒表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达 6.探针质粒探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件，他通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。人工
31、构建的质粒根据其功能及用途分为：第24页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建3、人工组建克隆载体-pBR322n大小：4.3 kbn选择标记：Apr Tcrn单一酶切位点：EcoR Hind BamH PstI Sal 等第25页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建3、人工组
32、建克隆载体-pBR322n用于组建pBR322的三个亲本质粒的特征：npSE2124：Apr基因npMB8:Col EI松弛型复制子npSC101:Tcr基因第26页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第27页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒n多拷贝大肠杆菌型质粒，包括pUC8/9 pUC18/19n
33、pUC的亲本质粒是pBR322,包括如下四个部分：n来自 pBR322 的复制起点（ori）n来自pBR322的Apr基因（核甘酸序列已发生改变）nE.coli的lacZ基因及其启动子组成lacZ 基因nlacZ内部人工组装了一个多克隆位点（MCS）它含有如下单一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。第28页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新第一节 E.coli 质粒载体二、质粒（plasmid）载体的构建4、人工组建克隆载
34、体-pUC系列质粒npUC系列质粒的优点n更小的相对分子量和更高的拷贝数n可用组织化学法检测重组体n具有多克隆位点（MCS）区段是基因工程中目前最常用的是基因工程中目前最常用的E.coli克隆载体克隆载体第29页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新第一节 E.coli 质粒载体三、质粒（plasmid）的制备1.碱裂解法（1）将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中（2）加溶菌酶裂解细菌细胞壁（3）加NaOH与SDS的混合溶液，去膜释放内含物（4）加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分
35、蛋白质（5）离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶（6）乙醇或异丙醇沉淀水相质粒（7）无DNase的RNase处理残余RNA第30页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新第一节 E.coli 质粒载体三、质粒（plasmid）的制备2.沸水浴法（1）将菌体悬浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液中（2）加溶菌酶破细胞壁（3）放入沸水浴中煮40秒（4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物（5）乙醇异丙醇沉淀第31页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生
36、物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新一、一、Ti质粒载体质粒载体1.根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与与Ti质粒质粒G-菌，可侵入菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crowngalltumor)。冠瘿。冠瘿瘤细胞具有以下特征：瘤细胞具有以下特征：i.不需要补充植物激素便可进行离体培养不需要补充植物激素便可进行离体培养 ii.ii.合成肿瘤特有的化合物合成肿瘤特有的化合物冠瘿碱冠瘿碱(opine)(opine)，能专一，能专一 的为根癌农杆菌所利用的为根癌农杆菌所利用.这两个特这
37、两个特征由征由TiTi质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。三、其他质粒载体第32页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新二、酿酒酵母二、酿酒酵母(Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆载体的分子克隆载体1.克隆载体的种类克隆载体的种类1)按复制方式划分按复制方式划分i.自主复制型；自主复制型；ii.整合型（非自主复制型）整合型（非自主复制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)2)按复制子来源划分按复制子来源
38、划分i.附加体型附加体型-yeastepisomalplasmid(YEp)，其复制起点来自于酿酒酵母的，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒天然质粒-2质粒质粒ii.染色体复制型染色体复制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其复制起点来自染色体，其复制起点来自染色体上的自主复制序列上的自主复制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)三、其他质粒载体第33页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新4.pYAC载体载体酵母菌人工染色体酵母菌人工染色
39、体(yeastartificialchromosome,YAC)广泛用于构建高等动植广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建物基因组文库的构建,由由YLp经适当改造后构建成经适当改造后构建成pYAC载体。载体。pYAC载体具有以下特点：载体具有以下特点：1）双双TEL位点；位点；2）三个酵母菌遗传标记基因；三个酵母菌遗传标记基因；3）一个一个SUP4基因用于检测重组子基因用于检测重组子，其原理是：，其原理是：SUP4是是tRNAtyr的赭色抑制突变基因，但的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要
40、是在SUP4基因中插入基因中插入外源外源DNA片段后在转化片段后在转化ade2宿主菌，转化子成红色菌落。宿主菌，转化子成红色菌落。第34页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新YAC:酵母人工染色体（yeast artificial chromosome）目前能容纳最大外源DNA片断的载体.nYAC载体有两个臂，每个臂的末端有一个端粒（TEL），臂上有着丝粒（CEN）、自主复制序列（ARS）、选择标记（TRP1和URA3）n装载容量：50Kb-2000KbnYAC载体是以质粒的形式出现，如：pYAC2
41、第35页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第36页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第二节 噬菌体载体一、l噬菌体的分子生物学nl噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和l DNA组成n1.l-DNA的物理图谱n l-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端），称为cos区，全长48.5kb。左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞，DNA自主复制以及调控基因，中间是
42、负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因第37页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建n天然的lDNA由于包装上下限的存在以及同种酶切口太多不适合作为重组实验的载体n1.1.缩短长度缩短长度 野生型lDNA包装的上限为50.9kb，本身长度为48.5kb，那么外源DNA片段允许插入的大小至多为2.4kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，如果将缩短便提高装载量。其实lDNA上约有40-50%的DNA片段（J-N区间）是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高
43、载量。第38页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建1.1.缩短长度缩短长度 n插入型载体插入型载体 n 该类载体经改造后的长度为37kb，有单一酶切位点，便于外源DNA的插入。其允许插入片段最大为13.9kb。n根据插入失活效应的特异性分为两种亚型：n免疫功能失活插入型载体n半乳糖苷酶失活插入型载体第39页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第二节 噬菌体载体二、l
44、噬菌体载体的构建1.1.缩短长度缩短长度 n替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体）n该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。第40页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建2.2.删除重复的酶切口删除重复的酶切口n插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；n取代型载
45、体在取代位点有两个酶切口，多了也不行n天然的l-DNA上有许多重复的酶切口，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切口必须被删除。第41页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第二节 噬菌体载体二、l噬菌体载体的构建3.构建琥珀型密码子突变体n 终止密码子有三种：UAA（赭石）；UGA（乳白）；UAG（琥珀）n 琥珀型突变：CAG-UAG（stop）n 将野生型-DNA上A和B两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG，当这种l-DNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的
46、A和B头部蛋白，也就不能被包装，不能裂解细菌。阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。第42页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第二节 噬菌体载体三、l l-DNA作为载体的优点作为载体的优点1.l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌2.l-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量3.重组l-DNA的筛选较为方便4.4.重组l-DNA分子的提取比质粒容易第43页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科
47、技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新第三节 Cosmid载体一、Cosmid的定义的定义nCosmid（cos sitecarrying plasmid）：是一类由是一类由人工构建的含有人工构建的含有l l-DNA两端两端cos序列和质粒复序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体制子的特殊类型的质粒载体。n质粒复制子包括：一个复制起点和两个抗性基因Apr 、Tcr。第44页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新Cosmid载体的特点载体的特点1.具有
48、具有噬菌体的特性；噬菌体的特性；2.具有质粒载体的特性；具有质粒载体的特性；3.具有较高容量的克隆能力；具有较高容量的克隆能力；4.具有与同源性序列的质粒进行重组的能力具有与同源性序列的质粒进行重组的能力第45页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第三节 Cosmid载体二、Cosmid的构建的构建nCosmid含有l-DNA两端cos区的质粒。由于l-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，均1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片
49、段，同时它仍可象l-DNA一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，Cosmid不能在体内被包装，更不不能在体内被包装，更不能裂解细胞能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，通过质粒上的复制子进行复制。第46页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚新叶亚新叶亚新叶亚新第三节 Cosmid载体三、Cosmid的优越性1.能象l-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞2.可以装载比质粒或l-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3k
50、b，则该Cosmid最大可装载最大可装载45.9kb的外源的外源DNA3.由于携带质粒的选择标记，便于筛选4.由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。第47页，本讲稿共58页2022/10/9苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系苏州科技学院生物系 叶亚叶亚叶亚叶亚新新新新采用Cosmid作载体的困难载体自身只相当于可以插入片段的载体自身只相当于可以插入片段的1/101/10左右，因此往往会出现载体同左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止