《活性维生素D3通过nephrin-PI3KAkt信号通路对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的影响.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《活性维生素D3通过nephrin-PI3KAkt信号通路对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的影响.docx（65页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 摘 要目的：人类慢性肾脏病（CKD）病例起源于肾小球，它是形成原发尿的过滤器，肾小球选择性过滤过程很大程度上取决于足细胞的结构完整性和功能能力。足细胞表面核心蛋白nephrin是其中央信号平台，发挥信号传递作用。越来越多证据表明维生素D及其类似物发挥独立于钙磷代谢之外的肾保护作用，其对足细胞作用的报道较少，以及足细胞损伤的机制还没有定论。所以，我们探究活性维生素D3（AVD3）对足细胞损伤和PI3K/Akt通路的影响，挖掘其发挥作用的潜在机制。方法：1. 健康6周龄雄性SD大鼠随机分为对照组（NC组）、阿霉素肾病模型组（AN组）、阿霉素肾病活性维生素D3（0.25g/kg/d）干预组（AN+
2、AVD3组），每组36只。造模大鼠（AN、AN+AVD3组）单次尾静脉注射阿霉素（adriamycin,ADR,7.5mg/kg），以大量蛋白尿、肾功能障碍以及肾病理损伤为实验标准，实验时长达10周。每2周测定各组大鼠不同时期内各项指标，包括：体重、肾脏系数、肾功能指标、肾病理损伤；免疫荧光观察nephrin、desmin、PI3K（p85）及p-Akt在肾小球中的定位，免疫组织化学半定量和Western Blot定量分析nephrin、desmin、PI3K（p85）、AKT及p-Akt蛋白表达水平，实时荧光定量PCR（qPCR）检测nephrin、desmin、PI3K（p85）及AKT
3、mRNA水平。2. 将体外培养的大鼠足细胞分为：正常对照组（NC组）、单纯1a,25-二羟维生素D3组（10nmol/L, AVD3组）、ADR足细胞损伤模型组（1.5mol/L, ADR组）和1a,25-二羟维生素D3干预组（1.5mol/L ADR +10nmol/L AVD3, ADR+AVD3组）；大鼠形态学，免于荧光鉴定大鼠足细胞；MTT法检测ADR对足细胞细胞活力的抑制作用，AVD3对足细胞细胞活力的保护效应；Western Blot 检测不同浓度ADR、AVD3对nephrin蛋白表达的影响；Western Blot 检测AVD3对ADR刺激下损伤足细胞desmin、nephri
4、n、PI3K（p85）、AKT及p-Akt蛋白表达的影响。结果：第一部分：活性维生素D3对AN大鼠足细胞损伤和PI3K/Akt通路的影响1.1 AN大鼠模型评价与NC组比，造模组(AN、AN+AVD3组)大鼠出现一般体征和精神异常：毛色蓬乱暗黄、多尿便稀、喜蜷缩、易激惹；造模大鼠产生大量蛋白尿（30mg/100g）和肾表型异常：肾小囊囊腔增宽、基底膜增厚、肾小管上细胞脱落及肾间质炎性浸润等。1.2 AVD3对AN大鼠肾保护作用与同期NC组比，AN组大鼠体重显著降低（P0.05），肾脏指数、24h尿蛋白（24h UP）、显著升高，肾功能指标：血清总蛋白（total serum protein,
5、TP）和白蛋白（albumin, Alb）降低（均P0.05），肌酐（creatinine, Cre）和总胆固醇（total cholesterol, TC）升高（均P0.05），肾病理染色显示系膜基质指数及纤维化面积百分比显著升高（均P0.05），AN+AVD3组大鼠体重不同程度升高、肾脏系数降低、蛋白尿减少、TP 及Alb水平升高、Cre及TC水平降低、系膜基质指数和纤维化面积百分比降低（均P0.05）。1.3 AVD3对AN大鼠的nephrin、desmin、PI3K（p85）及p-Akt的影响免疫荧光显示nephrin、desmin、PI3K（p85）及p-Akt蛋白均定位与肾小球内，
6、免疫组织化学染色和Western Blot检测显示AN组大鼠肾皮质nephrin蛋白表达水平降低（P0.05），desmin、PI3K（p85）及p-Akt蛋白水平均显著升高（均P 0.05），同时进一步qPCR结果与蛋白结果一致；活性维生素D3治疗促进nephrin 蛋白及mRNA水平表达（P0.05），降低desmin、PI3K（p85）蛋白及mRNA水平（均P0.05）。1.4 足细胞损伤与蛋白尿的生成密切相关Spearman相关分析表明，AN大鼠的nephrin表达和足细胞损伤与足细胞损伤呈负相关（r=-0.4938, P0.05），同时，与24h UP呈负相关（r=-0.4588,
7、P0.05）；desmin蛋白表达与24h UP呈正相关（r=0.8165, P0.01）。第二部分：活性维生素D3可能通过nephrin-PI3K/Akt通路减轻足细胞损伤2.1 体外大鼠足细胞鉴定未分化的足细胞呈鹅卵石样外观，未见明显足突，分化成熟的足细胞呈纤维细胞样，中间凸起，两端细长；免疫荧光染色显示该细胞系表达足细胞WT-1、nephrin蛋白，可见，该细胞系来源足细胞，为后续实验开展奠定基础。2.2 不同ADR， AVD3干预对细胞活力的影响采用不同浓度，不同时间刺激足细胞，MTT检测细胞的活力显示，ADR对细胞的活力抑制作用随浓度、刺激时间呈依赖性降低，1.5mol/L ADR刺
8、激足细胞对细胞活力有显著抑制作用（P0.05），为对照组的64.21%；在此条件下诱导足细胞损伤，活性维生素D3干预，细胞活力呈浓度依赖性升高，且10nmol/L干预浓度对细胞活力有显著保护效应（P0.05），nephrin蛋白表达检测获得与之一致结果。2.3 AVD3对足细胞nephrin、desmin、PI3K（p85）、AKT及p-Akt蛋白表达影响与Control组比，ADR刺激下足细胞nephrin表达降低（P0.05），desmin、PI3K（p85）及p-Akt表达升高（均P0.05），AVD3干预促进nephrin表达（P0.05），抑制desmin、PI3K（p85）及p-A
9、kt表达（均P0.05）。2.4 nephrin与PI3K/Akt信号通路相关性分析 Spearman相关性分析显示：ADR诱导的足细胞损伤模型中，nephrin蛋白表达与PI3K/Akt通路蛋白呈明显负相关（r=-0.6082,-0.3671;均P 30mg / 100g) and abnormal renal phenotype: renal capsule widens, thickened basement membrane, cell shedding in renal tubules, and renal interstitial inflammatory infiltration
10、.1.2 Renal protective effect of AVD3 on AN ratsCompared with the NC group in the same period, the body weight of the rats in the AN group was significantly reduced (P0.05), renal index, 24h urine protein (24h UP), Significantly increased, renal function indicators: total serum protein (TP) and album
11、in (albumin, Alb) decreased (both P0.05), creatinine (crein) and total cholesterol (TC) increased High (all P0.05), renal pathological staining showed significantly increased mesangial matrix index and percentage of fibrotic area (all P0.05). Rats in the AN + AVD3 group had increased body weight, ki
12、dney coefficient, and proteinuria in varying degrees. , TP and Alb levels increased, Cre and TC levels decreased, mesangial matrix index and fibrosis area percentage decreased (all P0.05).1.3 Effects of AVD3 on nephrin, desmin, PI3K (p85) and p-Akt in AN ratsImmunofluorescence showed that nephrin, d
13、esmin, PI3K (p85) and p-Akt proteins were localized in the glomerulus.Immunohistochemical staining and Western Blot detection showed that nephrin protein expression level in the renal cortex of AN group rats was decreased (P0.05), and desmin, PI3K (p85) and p-Akt protein levels were significantly in
14、creased (all P0.05), Further qPCR results were consistent with protein results; active vitamin D3 treatment promoted the expression of nephrin protein and mRNA levels (P0.05), reduced desmin, PI3K (p85) protein and mRNA levels (both P0.05), and total AKT in protein and There was no difference betwee
15、n the groups in mRNA level (all P0.05).1.4 Podocyte injury is closely related to the production of proteinuriaSpearman correlation analysis showed that nephrin expression and podocyte injury in AN rats Negative correlation (r = -0.4938, P0.05), and negative correlation with 24h UP (r = -0.4588, P0.0
16、5); desmin protein expression was positively correlated with 24h UP (r = 0.8165, P 0.01).Part 2: Active vitamin D3 may reduce podocyte damage through the nephrin-PI3K / Akt pathway2.1 Identification of rat podocytes in vitroUndifferentiated podocytes have a cobblestone-like appearance, no obvious fo
17、ot processes are seen, and mature and mature podocytes are fibroblast-like.The middle is raised and the two ends are slender. Immunofluorescence staining shows that the cell line expresses podocyte WT-1 and nephrin proteins. It can be seen that the cell line is derived from podocytes, which lays the
18、 foundation for subsequent experiments.2.2 Effect of different ADR and AVD3 interventions on cell viabilityDifferent concentrations and different times were used to stimulate podocytes. MTT assay of cell viability showed that ADR had Viability inhibition decreased with concentration and stimulation
19、time. 1.5mol / L ADR stimulated podocytes had a significant inhibitory effect on cell viability (P0.05), which was 64.21% of the control group; under these conditions, podocyte injury was induced. With the intervention of active vitamin D3, the cell viability increased in a concentration-dependent m
20、anner, and the 10 nmol / L intervention concentration had a significant protective effect on cell viability (P0.05). Nephrin protein expression detection showed consistent results.2.3 Effect of AVD3 on the expression of nephrin, desmin, PI3K (p85), AKT and p-Akt proteins in podocytesCompared with th
21、e control group, the expression of nephrin in podocytes was reduced by ADR stimulation (P0.05), and the expression of desmin, PI3K (p85) and p-Akt were increased (all P0.05). Inhibited the expression of desmin, PI3K (p85) and p-Akt (all P 0.05).2.4 Correlation analysis of nephrin and PI3K / Akt sign
22、al pathway Spearman correlation analysis showed that in the ADR-induced podocyte injury model, nephrin protein expression was significantly negatively correlated with the PI3K / Akt pathway protein (r = -0.6082, -0.3671; all P 0.05). There is co-expression of nephrin protein and PI3K / Akt pathway p
23、rotein in cortical glomeruli.Conclusions:1. In adriamycin nephropathy podocyte injury model, nephrin expression is down-regulated, and there is a correlation with 24h urinary protein.Shows that podocyte injury is an important cause of proteinuria produced by CKD.2. Animal kidney disease model and po
24、docyte injury model experiments show that active vitamin D3 promotes nephrin expression and improvesKidney function, suggesting that podocytes are the target organs for active vitamin D3 to exert renal protective effects.3. Active vitamin D3 inhibits ADR-induced activation of the PI3K / Akt signalin
25、g pathway, and nephrin expression is related to PI3K / Akt There is a correlation between signaling pathway activation, suggesting that the nephrin-PI3K / Akt signaling pathway is a potential molecular mechanism for active vitamin D3 to exert renal protection.Key words: Active vitamin D3; adriamycin
26、 nephropathy ; podocytes ; nephrin; desmin; PI3K / Akt signaling pathway; VIII目 录摘 要I前言1第一部分：活性维生素D3对AN大鼠肾足细胞保护作用研究31材料与方法31.1研究对象31.2主要试剂和耗材31.3主要仪器设备41.4 .主要试剂配方52实验方法62.1 AN模型的建立62.2 动物给药干预72.3 肾功能指标的检测72.4 标本的采集与处理72.5 肾脏病理学检查72.6 免疫组织化学检测92.7 免疫荧光检测102.8 Western Blot检测102.9 实时荧光定量PCR检测112.10 统计
27、学分析133 结果133.1阿霉素肾病（AN）大鼠模型效果评价133.1.2 ADR对大鼠的肾功能的影响143.1.3 ADR对大鼠肾结构的影响143.2 AVD3对AN大鼠肾保护作用143.2.1 AVD3对AN大鼠一般情况的影响143.2.2 AVD3对AN大鼠肾脏系数的影响153.2.3 AVD3对AN大鼠蛋白尿的影响153.2.4 AVD3对大鼠肾功能指标的影响163.3 AVD3减轻AN大鼠足细胞损伤173.3.1 AVD3对AN大鼠desmin的影响173.3.2 AVD3对AN大鼠nephrin的影响193.3.3 AN大鼠nephrin低表达与足细胞损伤密切相关213.3.4
28、AN大鼠nephrin、 desmin蛋白与24h尿蛋白相关性分析223.4 AVD3抑制AN大鼠PI3K/Akt信号通路223.4.1 AVD3对AN大鼠PI3K（p85a）蛋白表达的影响223.4.2 AVD3对AN大鼠p-Akt蛋白表达的影响24第二部分：活性维生素D3通过nephrin-PI3K/Akt信号通路抑制足细胞损伤271一般资料271.1研究对象271.2主要试剂271.3主要仪器设备271.4主要试剂配制282.1细胞的培养282.2 细胞计数292.3 细胞活力的检测292.4 细胞分组302.5 细胞免疫荧光技术302.6 Western Blot技术302.7统计学分
29、析313结果313.1 大鼠足细胞的鉴定313.2 ADR刺激对大鼠足细胞的影响323.2.1ADR刺激对大鼠足细胞相对活力的影响323.2.3 足细胞在不同浓度ADR刺激下nephrin的表达323.3 不同浓度AVD3对ADR大鼠足细胞的影响333.3.1不同浓度AVD3对ADR刺激下细胞活力的影响333.3.2不同浓度AVD3对ADR大鼠足细胞nephrin表达333.4 AVD3对足细胞损伤的影响343.5 AVD3对ADR诱导的损伤足细胞nephrin表达的影响343.6 AVD3对ADR诱导的损伤足细胞PI3K/AKT信号通路的影响353.6.1AVD3对ADR诱导的损伤足细胞PI
30、3K（p85a）的影响353.6.2AVD3对ADR诱导的损伤足细胞AKT活性的影响353.7 nephrin与 PI3K/Akt通路蛋白的相关性分析363.6 nephrin与 PI3K/Akt通路蛋白共定位36讨论37结论41文 献 综 述42XI活性维生素D3通过nephrin-PI3K/Akt信号通路对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的影响前言(Introduction)慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是以肾实质的逐渐破坏和功能肾元的丧失为特点，最终导致终末期肾衰竭，以及各种病理条件的风险增加，包括心血管疾病和神经系统疾病，如冠状动脉钙化、高血压和中风等1。
31、CKD是全球性疾病，在2013年的全球疾病负担研究中，估计有95万人死于CKD，迄今，世界范围内，终末期肾病（ESRD）已达140万余人，CKD成为全球公共卫生重点2, 3。导致CKD进展的因素包括实质细胞丢失、慢性炎症、纤维化和肾再生能力降低等，目前，关于CKD的防治成为中国肾脏病学术界最活跃的一个研究领域，但肾病学的研究证据相对有限，具体的发病机制尚不十分清楚4。我们都知道，现在CKD的有效治疗还未满足的医疗需求，因此，寻求CKD预防和治疗手段迫在眉睫。足细胞，高度分化的极性腺上皮细胞，有膜延伸，以高度极化的方式在基底膜上分枝，关于足细胞生物学研究有望帮助人们更好地理解与蛋白尿相关的多种疾
32、病的机械性质，涉及足细胞上皮细胞功能，包括足细胞足突功能减退等5。足细胞骨架的改变和迁移特性与蛋白尿和肾小球硬化的发展之间存在着很强的相关性6。最近的足细胞生物学和基因破坏研究表明，单个足细胞分子的异常与蛋白尿和肾小球硬化之间存在因果关系7。结蛋白(desmin)是一种细胞骨架中间的丝蛋白成分，其特殊的连接收缩保持了细胞结构和机械完整性，其表达上调在疾病发病过程中维持正常肌层排列的一种防御机制8。desmin免疫反应是一种有效、敏感的急性足细胞损伤指标，对肾小球损伤有潜在的疗效标志和足细胞损伤的毒性标志作用。体内体外研究表明，大量肾脏疾病小鼠受损足细胞的结蛋白增加，提示结蛋白参与足细胞损伤9。
33、研究足细胞的损伤有望帮助人们更好地理解与蛋白尿相关的多种疾病的机械性质。附着在肾小球基底膜(GBM)的肾小球毛细血管上足突，彼此相连，形成隔膜10。Nephrin是位于狭缝横膈膜的免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白原，是维持肾小球滤过膜的渗透不可或缺的，与其他足细胞分子CD2相关蛋白（CD2AP）、膜蛋白（podocin）、闭锁连接蛋白-1(ZO-1) 等并介导重要的细胞信号11。nephrin是形成SD重要的分子筛，能识别血液的过滤防止过滤过程中必需，足细胞任何一种结构的破坏或nephrin丢失/减少是足细胞上皮特征的丧失，加重诸如微小病变、局灶性节段性肾小球硬化和糖尿病肾病等蛋白尿性疾病12。He
34、 M等13发现Nephrin下调是加重糖尿病肾病（DN）的肾功能障碍。Liu M等14发现发现在足细胞肾病期间，尿激酶纤溶酶原激活物受体（uPAR）的激活事件发生由于nephrin表达的丧失，也是导致足细胞足突消退和蛋白尿发生发展所必需的。郭晓媛15在膜性肾病大鼠同样观察到nephrin蛋白表达的下调。唐英等16研究表明固本通络方调控Nephrin、CD2AP的表达上调，从而有效减轻IgA大鼠蛋白尿及肾小球病变。应该注意的是，外隔膜蛋白nephrin,CD2AP, podocin不仅是细胞外SD滤过网络的核心成分，还是细胞内短区的相互作用的信号支架，然而CKD与nephrin调控下潜在机制尚未
35、完全阐明，研究nephrin在活性维生素D3治疗CKD的信号作用具有重要的临床现实意义。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是研究细胞周期调控的热点网络，它对细胞生长、代谢和死亡等多个关键环节有着广泛的影响17。研究发现，外隔膜蛋白nephrin、CD2AP，podocin除了对肾小球足细胞（即肾脏肾小球上皮细胞）的完整性至关重要外，还能够启动肾小球足细胞PI3K/Akt依赖的信号转导18。先前的众多研究强调了PI3K/Akt与抗肾脏炎症、抑制足细胞功能障碍所发挥的作用，一些学者也PI3K/Akt作为nephrin下游这一存在的说法19, 20。nephrin-CD2A
36、P-p85a复合体的存在也被发现，体外孤立的肾小球中也证明nephrin与PI3K的p85a管理子单元相关联，相似的相互功能也被报道在体外调节肾足细胞的功能21。关于nephrin联合PI3K对下游Akt激活，类似蛋白的磷酸化的激活，有研究发现nephrin自身磷酸化调节相互作用领域与一些蛋白质相互作用，不仅仅依靠于nephrin-podocin-CD2AP复合体，还包括PI3K等一些通路分子蛋白，从而发挥细胞调控功能22, 23。虽然在学术研究者们眼里，nephrin-PI3K/Akt的信号通路的发现是肾脏学者研究足细胞的一个重要突破，但关于其如何调控足细胞，以及是否发挥药物靶向作用仍罕见报道。1a,25-（OH）2D3活性维生素D3(Active Vitamin D3，AVD3)，即1a,25-二羟维生素D3，是维生素D生物激素活性形式，先前，以其作为钙和骨骼平衡调节剂的经典骨骼作用而闻名，现在其独立钙磷之外的多效性得到广泛应用。有资料描述低血清维生素D水平与肾脏损害以及增加的蛋白尿之间的联系，但这些研究并没有证明因果关