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1、赵 世 光第第2 2章生物样品前处理章生物样品前处理现在学习的是第1页，共29页第二章 生物样品前处理现在学习的是第2页，共29页第一节 样品分离的预提取第二节 细胞的破碎与分离 第一章 绪论现在学习的是第3页，共29页第一节 样品分离的预提取（前处理）前处理的目的：对目标组分进行初步富集，前处理的目的：对目标组分进行初步富集，对干扰成分进对干扰成分进行去除；行去除；2.1.1 2.1.1 概述概述预处理材料的种类和特点预处理材料的种类和特点 动物细胞反应液动物细胞反应液植物细胞反应液植物细胞反应液微生物细胞反应液微生物细胞反应液植物组织提取液植物组织提取液动物组织提取液动物组织提取液“发酵液
2、发酵液”“”“产物产物”，胞内，胞内oror胞外？胞外？组织组织现在学习的是第4页，共29页2.1.2 2.1.2 植物组织提取物的制备植物组织提取物的制备植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。叶片、根、茎叶片、根、茎叶片、根、茎叶片、根、茎清洗去泥沙、灰尘等杂质（清洗去泥沙、灰尘等杂质（清洗去泥沙、灰尘等杂质（清洗去泥沙、灰尘等杂质（-4C -30C低温保存备用）；低温保存备用）；低温保存备用）；低温保存备用）；种子（大豆、莲子）、中药提取的原材料等种子（大豆、莲
3、子）、中药提取的原材料等泡涨，泡涨，粉碎。粉碎。现在学习的是第5页，共29页一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。所以要在预处会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶
4、段去除酚类化合物。理阶段去除酚类化合物。2.1.2.1 2.1.2.1 植物组织中酶的提取植物组织中酶的提取现在学习的是第6页，共29页例子：植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取例子：植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取1.步骤：步骤：100g100g新鲜叶片新鲜叶片切成小片（打孔器、切片）切成小片（打孔器、切片）置入提取液置入提取液中（稳定酶活性）中（稳定酶活性）PVPPPVPP预浸泡（预浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性溶性PVPPVP聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮，），）间歇高速搅拌（充分接触混匀）间歇高速搅拌（充分接触混匀）纱布过滤纱布过滤滤液加入滤液加入PVPP
5、PVPP重复轻搅（重复一次）重复轻搅（重复一次）离心去除离心去除PVPPPVPP酶粗提液。酶粗提液。现在学习的是第7页，共29页2.条件讨论条件讨论低温（低温（45度），器皿、溶液预冷、操作要快；度），器皿、溶液预冷、操作要快；57倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不利于酶活倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不利于酶活稳定）；稳定）；PH6.57.0，中性，未知蛋白酶要远离等电点；，中性，未知蛋白酶要远离等电点；PVPP优良，不溶性；优良，不溶性；PPO抑制剂，抑制剂，DTT、2-ME；蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，剧毒。（苯甲磺酰氟）酒精溶解，剧毒。
6、现在学习的是第8页，共29页2.1.2.2 2.1.2.2 多糖提取多糖提取重要活性多糖重要活性多糖步骤：原料步骤：原料粉碎粉碎醇醚回流脱脂醇醚回流脱脂水提取水提取粗提液粗提液去蛋白策略：去蛋白策略：SevagSevag法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性TCATCA法，低浓度的法，低浓度的TCATCA可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。现在学习的是第9页，共29页2.1.2.3 2.1.2.3 细菌重组蛋白的提取细菌重组蛋白的提取重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，40%40%总蛋
7、白含量，总蛋白含量，但易形成包涵体（蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中）。但易形成包涵体（蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中）。现在学习的是第10页，共29页例：例：E.coli.E.coli.中提取重组蛋白中提取重组蛋白1.步骤：步骤：-酶解菌体细胞：离心收集菌体酶解菌体细胞：离心收集菌体溶菌酶溶菌酶去核酸（去核酸（DNaseDNase）电泳检测；电泳检测；-清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶解；清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶解；-溶解包涵体：释放目的蛋白；溶解包涵体：释放目的蛋白；-目的蛋白再折叠：恢复活性目的蛋白再折叠：恢复活性现在学习的是第11页，共29页第二节 细胞的
8、破碎与分离微生物代谢产物：微生物代谢产物：胞外产物（氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等）胞外产物（氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等）胞内产物（大多数蛋白质、类脂）胞内产物（大多数蛋白质、类脂）微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。目前重组细胞内部。目前重组DNADNA技术，表达的产品（如胰岛素、技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。2.2.1 概述概述现在学
9、习的是第12页，共29页2.2.2 2.2.2 常用破碎方法常用破碎方法机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-pressX-press法等；法等；对物料的挤压和剪切作用对物料的挤压和剪切作用非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等；非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等；现在学习的是第13页，共29页2.2.2.1 2.2.2.1 珠磨法珠磨法原理：原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、石进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、石英砂、氧化铝英砂、氧化铝d1mmdG+G-G+酵母。酵母。易失活物质不宜用（超
10、声波可促使产生一些化学自由，基因使敏感易失活物质不宜用（超声波可促使产生一些化学自由，基因使敏感活性物质失活），可加入保护剂活性物质失活），可加入保护剂N2N2、PMSFPMSF等等 特点：特点：现在学习的是第19页，共29页溶菌酶（细菌），溶菌酶（细菌），-3-3，3-3-葡聚糖酶，葡聚糖酶，-1-1，6-6-葡聚糖酶，蛋白酶，葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽键内切酶，壳多糖酶，细胞壁溶解酶（复合酶），甘露糖酶，糖苷酶，肽键内切酶，壳多糖酶，细胞壁溶解酶（复合酶），酵母。酶有专一性。酵母。酶有专一性。特点：特点：条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物（可从细胞不同位置）条件温和，核酸泄
11、出量少，选择性释放产物（可从细胞不同位置）价格高，限制了大规模应用价格高，限制了大规模应用通用性差，不同菌种需选择不同的酶，最佳条件不易确定；通用性差，不同菌种需选择不同的酶，最佳条件不易确定；产物抑制的存在：在溶酶系统中，甘露糖产物抑制的存在：在溶酶系统中，甘露糖蛋白酶，葡聚糖蛋白酶，葡聚糖葡聚糖葡聚糖酶酶2.2.2.4 2.2.2.4 酶溶法酶溶法外加酶外加酶现在学习的是第20页，共29页将新鲜的生物材料存放于一定的将新鲜的生物材料存放于一定的pHpH和适当的温度下，和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下
12、发生溶解，使细胞内含物释放出来。等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。特点：特点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质变性。对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质变性。自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。自溶法自溶法现在学习的是第21页，共29页2.2.2.5 2.2.2.5 化学渗透法化学渗透法原理：原理：使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。透法。现在学习的是第22页，共29页表面活性物质
13、：促使细胞某些组分溶解，其增溶作表面活性物质：促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞破碎用有助于细胞破碎EDTAEDTA螯合剂：与结构中螯合剂：与结构中ca2+ca2+或或Mg2+Mg2+螯合，使其原有结构螯合，使其原有结构破坏而破裂破坏而破裂有机溶剂：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高级醇等，有机溶剂：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高级醇等，能被细胞壁中的类脂吸收，使胞壁膜溶胀，导致细能被细胞壁中的类脂吸收，使胞壁膜溶胀，导致细胞破碎；胞破碎；变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水性化合物溶于水现在学习的是第23页，共29页特点特点选择性
14、释放产物。可使一些较小分子量的溶质，如多肽和小分选择性释放产物。可使一些较小分子量的溶质，如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。步提取。通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞；通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞；时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过80%80%；有些化学试剂有毒，在其后产物提取精时，需分离除去。有些化学试剂有毒，在其后产物提取精
15、时，需分离除去。现在学习的是第24页，共29页将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。2.2.2.6 2.2
16、.2.6 反复冻结反复冻结融化法融化法原理：原理：现在学习的是第25页，共29页使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。胞内物质就容易被抽提出来。热空气干燥、真空干燥、冷冻干燥热空气干燥、真空干燥、冷冻干燥2.2.2.72.2.2.7干燥法干燥法现在学习的是第26页，共29页X-pressX-press法：将浓缩的菌体悬浮液冷却至法：将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25-25形成冰晶形成冰晶体，利用体，利用500MPa500MPa以上的
17、高压冲击，使冷冻细胞从高压阀以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。2.2.2.8 2.2.2.8 其他方法其他方法现在学习的是第27页，共29页渗透压法：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓渗透压法：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。适用于细胞壁较脆弱的细胞、实验室规模适用于细胞壁较脆弱的细胞、实验室规模现在学习的是第28页，共29页微波加热法：热运动使液态水气化，冲破细胞壁。微波加热法：热运动使液态水气化，冲破细胞壁。现在学习的是第29页，共29页