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1、关于氨基酸的代谢控制关于氨基酸的代谢控制与发酵与发酵第一页，讲稿共一百二十三页哦n n大约20种氨基酸构成了数目庞大的各种肽类和蛋白质。其中8种氨基酸是人体必需的，它们分别是L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋蛋氨氨酸酸、L-苯苯丙丙氨氨酸酸、L-L-色氨酸、L-L-亮氨酸和L-缬氨酸。第一节第一节 概述概述 第二页，讲稿共一百二十三页哦一、氨基酸的应用与市场一、氨基酸的应用与市场 n n氨基酸的应用是基于它们的营养价值、风味、生理活性和化学特性。n n主主要要应应用用领领域域是是食食品品、饲饲料料、化化妆妆品品、医医药药，也也用用作作化化学学工工业业的的中中间间体体。据据估估计计全全
2、世世界界每每年年氨氨基基酸酸市市场场为为4050亿美元，其中35%用用于于食食品品、50%50%用于饲料和15%用于医药和化妆品。第三页，讲稿共一百二十三页哦1、食品领域、食品领域 n n氨基酸大多无味，但它们是自然芳香的前体。氨基酸大多无味，但它们是自然芳香的前体。n n谷氨酸钠（味精）是所有氨基酸中最大生产品种，全世界年产量达100100万吨（中国大陆约为6060万吨）。万吨）。n n二二肽肽和和寡寡肽肽大大多多具具有有苦苦味味，但但二二肽肽L-L-门冬氨酰-L-L-苯丙氨酸甲酯（Aspartame，阿阿斯斯巴巴甜甜）是是个个例例外外，它它比比蔗蔗糖糖甜甜150150200200倍倍，现现
3、已已广广泛泛作作为为人人造造甜甜味味剂剂，应应用用于于低低热热量量的的饮饮料料等等。目目前前，阿阿斯斯巴巴甜甜的的世世界界年年产产量量已已超超过过2 2万万吨。吨。第四页，讲稿共一百二十三页哦2、饲料领域、饲料领域 n n组组成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸几几乎乎半半数数对对于于动动物物（如如猪猪和和家家禽禽）来来说说是必需的。是必需的。n n蛋氨酸和赖氨酸的全世界年产量分别为蛋氨酸和赖氨酸的全世界年产量分别为3535万吨和万吨和4040万吨。万吨。n n近近年年来来，由由于于发发酵酵水水平平的的提提高高，苏苏氨氨酸酸成成功功地地进进入入饲饲料料市市场，估计全世界年产量已达场，估计全世界年产
4、量已达1.51.5万吨。万吨。n nL-L-色色氨氨酸酸也也是是一一种种限限制制性性氨氨基基酸酸，尤尤其其在在以以玉玉米米为为基基础础的的饲饲料料中中。但但由由于于生生产产成成本本较较高高，目目前前L-L-色色氨氨酸酸的的世世界界年年产产量量仅仅500500吨吨（日日本本400400吨吨），因因此此还还不不能能广广泛泛作作为为饲饲料添加剂使用。料添加剂使用。第五页，讲稿共一百二十三页哦3、医药领域、医药领域 n nL-氨基酸输液是术前和术后的营养治疗剂。氨基酸输液是术前和术后的营养治疗剂。n n标标准准氨氨基基酸酸输输液液含含有有8种必需氨基酸，2种半必需氨基酸（L-L-精氨酸和L-组氨酸），
5、以及几种非必需氨基酸，通常包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和丝氨酸和L-L-谷氨酸。n nL-L-门冬氨酸钾镁常用于消除疲劳和治疗心力衰竭和肝脏疾病。第六页，讲稿共一百二十三页哦4、工业领域、工业领域 n n谷谷氨氨酸酸制制成成的的聚聚谷谷氨氨酸酸树树脂脂具具有有天天然然皮皮革革性性能能，因因此此可可用用于于制制造造人人造造皮皮革革和和涂涂料料。谷谷氨氨酸酸还还可可以以制造人造纤维。制造人造纤维。n n甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸等可用于制造表面活性剂、缓冲剂和抗氧化剂。第七页，讲稿共一百二十三页哦u生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的
6、三巨头。它们能生产高品质的氨基酸，可直接用于输液制剂的生产。u日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家，生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。u国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司，湖北八峰氨基酸公司，但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。u2000年后，世界氨基酸产值已达45亿美元，占生物技术市场的7%；国内的氨基酸产值可达40亿元，占全国发酵产业总产值的12%。第八页，讲稿共一百二十三页哦二、氨基酸的生产方法二、氨基酸的生产方法 n n蛋白质水解法：早期味精生产、复合氨基酸蛋白质水解法：早期味精生产、复合氨基酸n n化学合成法：化学合成法：DL-DL-蛋氨酸，甘氨酸，蛋氨酸，甘氨酸
7、，DL-DL-丙氨酸丙氨酸n n微生物发酵法微生物发酵法 19561956年年，木木下下竹竹郎郎（KinoshitaKinoshita）首首次次报报道道分分离离出出谷谷氨氨酸酸产产生生菌菌；次次年年发发酵酵法法工工业业化化生生产产谷谷氨氨酸酸首首先先在在日日本本问问世世，继继而而迅速掀起一股氨基酸发酵研究的热潮。迅速掀起一股氨基酸发酵研究的热潮。经经过过半半个个世世纪纪的的努努力力，目目前前几几乎乎所所有有氨氨基基酸酸都都能能用用微微生生物法生产（胱氨酸和半胱氨酸除外）。物法生产（胱氨酸和半胱氨酸除外）。第九页，讲稿共一百二十三页哦n n氨基酸发酵属于典型的代谢控制发酵，这是由于氨基酸的生物合
8、成受到严格的反馈调节。n n要进行氨基酸发酵，就必须采取某些人为的手段以打破微生物的反馈调节机制，从而大量积累目的氨基酸。第十页，讲稿共一百二十三页哦采用微生物法生产氨基酸的情况如下：n n1 1）使使用用野野生生型型细细菌菌生生产产氨氨基基酸酸（L-L-谷谷氨氨酸酸、L-丙丙氨氨酸等）；酸等）；n n2 2）使用突变株生产氨基酸（L-L-赖赖氨氨酸酸、L-苏苏氨氨酸酸、L-L-缬氨酸、L-L-精精氨氨酸酸、L-L-瓜瓜氨氨酸酸、L-L-鸟氨酸、L-高丝氨酸、L-L-色色氨氨酸酸、L-L-苯苯丙丙氨氨酸酸、L-L-酪酪氨氨酸酸、L-L-组组氨氨酸酸等）；等）；n n3 3）使使用用添添加加前前
9、体体的的方方法法生生产产氨氨基基酸酸（如如用用邻邻氨氨基基苯苯甲甲酸酸生产生产L-L-色氨酸；甘氨酸生产色氨酸；甘氨酸生产L-L-丝氨酸等）；丝氨酸等）；第十一页，讲稿共一百二十三页哦n n4）使用酶法生产氨基酸（利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸，如以延胡索酸和铵盐为原料，经天冬氨酸酶催化生产L-L-天冬氨酸）；n n5）应应用用基基因因工工程程、蛋蛋白白质质工工程程和和代代谢谢工工程程方方法法育育成成的菌株，进行发酵生产（的菌株，进行发酵生产（L-羟脯氨酸）。羟脯氨酸）。第十二页，讲稿共一百二十三页哦 氨氨基基酸酸本本身身的的合合成成在在不不同同生生物物体体中中，有有较较大大的的差
10、差异异，但但是是许许多多氨氨基基酸酸的的合合成成途途径径在在不不同同生生物物体体中中也也有有共同之处。共同之处。按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：谷氨酸族（谷氨酸族（-酮戊二酸族）酮戊二酸族）包包括括：谷谷氨氨酸酸、谷谷氨氨酰酰胺胺、精精氨氨酸酸、赖赖氨氨酸酸 和脯氨酸；和脯氨酸；丙酮酸族丙酮酸族 包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；第十三页，讲稿共一百二十三页哦 天冬氨酸族（草酰乙酸族）天冬氨酸族（草酰乙酸族）包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；酸；磷酸甘油酸族磷酸甘油酸族
11、包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；芳香族芳香族 包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。第十四页，讲稿共一百二十三页哦第二节第二节 谷氨酸发酵的代谢控制育种谷氨酸发酵的代谢控制育种 n n1957年日本率先采用微生物发酵法生产谷氨酸，被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进行代谢控制发酵的阶段。n n目前全国有近50家工厂生产味精，年产量约为60万吨，居世界首位。第十五页，讲稿共一百二十三页哦一、谷氨酸的生物合成与发酵生产一、谷氨酸的生物合成与发酵生产 谷氨酸生物合成
12、途径谷氨酸生物合成途径（1）糖酵解途径（EMP）（2）磷酸已糖途径（HMP)（3）三羧酸循环(TCA)（4）乙醛酸循环（DCA）（5）二氧化碳固定反应（6）-KGA的还原氨基化反应第十六页，讲稿共一百二十三页哦第十七页，讲稿共一百二十三页哦苹果酸酶苹果酸酶丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶酸羧化酶CO2固定反应固定反应(丙酮酸羧化支路丙酮酸羧化支路)第十八页，讲稿共一百二十三页哦 谷氨酸谷氨酸glutamic acid合成的内在因素合成的内在因素 GA产生菌必须具备以下条件-酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺失TCA环阻断，-酮戊二酸积累琥珀酸辅酶A TCA环正常 GA产生菌
13、体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失积累NADPH，抑制KGA的脱羧氧化 GA产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶通过该酶酶活性调节实现DCA循环的封闭，GA积累第十九页，讲稿共一百二十三页哦 菌体有强烈的L谷氨酸脱氢酶活性提供NADPH,用于还原-酮戊二酸生成谷氨酸氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：-酮戊二酸+NH4+NADPH谷氨酸脱氢酶GDH-酮戊二酸+谷氨酰胺+NADPH谷氨酸转氨酶AT谷氨酸-酮戊二酸+-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸2谷氨酸 NADP+谷氨酸合成酶GS谷氨酸H2ONADP+反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联 第二十页，讲稿共一百二十三页哦 谷氨酸生
14、物合成的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径此时，谷氨酸对糖的转化率达到81.7%；目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内。第二十一页，讲稿共一百二十三页哦 生物素（生物素（VH）对谷氨酸发酵的影响）对谷氨酸发酵的影响1、生物素对糖代谢的影响生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度(对TCA有促进作用）而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累乳酸积累碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。第二十二页，讲稿共一百二十三页哦研究表明，异柠檬酸裂解酶活性 为醋酸诱导 受琥珀酸的阻遏抑制当VH缺乏时：（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱，乙酰辅酶A的生成量 就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用
15、降低；（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；两者综合的作用使得异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。另一方面，可以通过控制VH的浓度，实现对于乙醛酸循环的封闭。第二十三页，讲稿共一百二十三页哦 生物素对糖代谢的影响：生物素对糖代谢的影响：主要是影响糖降解速度，而不是影响EMP与HMP途径的比率。在生物素充足的条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高，但由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出。生物素对CO2固定反应也有影响。研究表
16、明，生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应。据有关资料报道，当生物素过量（100g/L以上）时，CO2固定反应可提高30%。第二十四页，讲稿共一百二十三页哦n n以葡萄糖为原料发酵生成谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。n n另外，该酶受琥珀酸阻遏，生物素亚适量时因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移动。第二十五页，讲稿共一百二十三页哦2、生物素对氮代谢的影响、生物素对氮代谢的影响VH丰富时，出现“只长菌，不产酸”的现象 谷氨酸发酵过程中，前期，菌
17、体的增殖期，一定量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。第二十六页，讲稿共一百二十三页哦 在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的
18、谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。第二十七页，讲稿共一百二十三页哦3、生物素对菌体细胞膜通透性的影响、生物素对菌体细胞膜通透性的影响 通常谷氨酸发酵采用的菌种都是生物素缺陷型，而生物素又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制生物素的浓度（干扰磷脂中的脂肪酸的生物合成）来实现对菌体细胞膜通透性的调节。培养基中生物素限量时，胞内AA 92%胞外培养基中生物素丰富时，胞内AA 12%胞外 第二十八页，讲稿共一百二十三页哦 谷氨酸生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失调使Glu得以积累。生物素贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易
19、析出，而培养基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不积累Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。第二十九页，讲稿共一百二十三页哦细胞膜透性的调节细胞膜透性的调节细胞膜透性的调节细胞膜透性的调节 谷谷氨氨酸酸发发酵酵的的关关键键在在于于发发酵酵培培养养期期间间谷谷氨氨酸酸生生产产菌菌细细胞胞膜膜结结构构与与功功能能发发生生特特异异性性变变化化，使使细细胞胞膜膜转转变变成成有有利利于于谷谷氨氨酸酸向向膜膜外外渗渗透透的的形形态态，使使终终产产物物不不断断排排出出细细胞胞外外，胞胞内内谷谷氨氨酸酸不不能能积积累累到到引引起起反反馈馈调调节节的
20、的浓浓度度，胞胞内内谷谷氨氨酸酸源源源源不不断断被被优优先先合合成成，分泌到发酵培养基中积累。分泌到发酵培养基中积累。细细胞胞透透性性的的调调节节，一一般般通通过过向向培培养养基基中中添添加加化化学学成成分分（如如生生物物素素、油油酸酸、甘甘油油、表表面面活活性性剂剂、青青霉霉素素等等，达达到到抑抑制制磷磷脂脂、细细胞胞膜膜的的形形成成或或阻阻碍碍细细胞胞壁壁的的正正常常生生物物合合成成，使使谷谷氨氨酸酸生生产产菌菌处处于于异异常常生生理理状状态态，解解除除细细胞胞对对谷谷氨氨酸酸向向胞胞外外漏漏出的渗透障碍。出的渗透障碍。第三十页，讲稿共一百二十三页哦n n生物素：影响磷脂的合成及细胞膜的完
21、整性。生物素：影响磷脂的合成及细胞膜的完整性。n n油酸：直接影响磷脂的合成及细胞膜油酸：直接影响磷脂的合成及细胞膜n n甘甘油油：甘甘油油缺缺陷陷型型菌菌株株丧丧失失-磷磷酸酸甘甘油油脱脱氢氢酶酶，不不能能合合成成-磷磷酸酸甘甘油油和和磷磷脂脂。限限量量供供应应甘甘油油，控控制制了了细细胞胞膜膜中中与与渗渗透透性性直接关系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而积累。直接关系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而积累。n n表表面面活活性性剂剂：对对生生物物素素有有拮拮抗抗作作用用，拮拮抗抗不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸的的合合成成，导导致致磷磷脂脂合合成成不不足足，影影响响细细胞胞膜膜的的完完整整性性，提提供供细
22、细胞膜对谷氨酸的渗透性。胞膜对谷氨酸的渗透性。n n青青霉霉素素：抑抑制制细细菌菌细细胞胞壁壁的的后后期期合合成成，形形成成不不完完整整的的细细胞胞壁壁，使使细细胞胞膜膜失失去去保保护护，使使胞胞内内外外的的渗渗透透压压差差导导致致细细胞胞膜膜的的物物理理损伤，增大谷氨酸向胞外漏出的渗透性。损伤，增大谷氨酸向胞外漏出的渗透性。第三十一页，讲稿共一百二十三页哦生物素生物素阻断脂肪酸的合成阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成影响细胞膜的合成表面活性剂表面活性剂对生物素有拮抗对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素在对数生长期添加青霉素抑制细胞
23、壁合成抑制细胞壁合成细胞膜损伤细胞膜损伤甘油缺陷型甘油缺陷型磷脂的合成受阻磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成影响细胞膜的合成油酸缺陷型油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成影响细胞膜的合成提高细胞膜的提高细胞膜的提高细胞膜的提高细胞膜的谷氨酸通透性谷氨酸通透性谷氨酸通透性谷氨酸通透性控制磷脂的合成控制磷脂的合成 使细胞膜受损（如表面活性剂）使细胞膜受损（如表面活性剂）青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜控制磷脂含量控制磷脂含量控制磷脂含量控制磷脂含量通过油酸的合成通过油酸的合成通过甘油合成通过甘油合成直接控制磷脂合成直接控制磷脂合成第三十
24、二页，讲稿共一百二十三页哦二、谷氨酸生物合成的调节机制二、谷氨酸生物合成的调节机制第三十三页，讲稿共一百二十三页哦谷氨酸生物合成的调节谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶-酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶第三十四页，讲稿共一百二十三页哦优先合成优先合成 在微生物的代谢中，Glu比Asp优先合成；合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp；Asp过量时反馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶(GDH)的调节的调节谷氨酸脱氢酶谷氨酸对其反馈抑制和反馈阻遏柠檬酸合成酶的调节柠檬酸合成酶的调节柠檬酸合成酶TCA的关键
25、酶，受能荷调节，谷氨酸反馈阻遏，乌头酸反馈抑制所以，正常代谢不积累Glu第三十五页，讲稿共一百二十三页哦异柠檬酸脱氢酶的调节异柠檬酸脱氢酶的调节 细胞内-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当-酮戊二酸过量时，将对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成-酮戊二酸。异柠檬酸脱氢酶-酮戊二酸反馈抑制-酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶:谷氨酸产生菌中先天性的丧失或微弱。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEP受天冬氨酸反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸反馈阻遏。第三十六页，讲稿共一百二十三页哦37n n丧丧失失或或有有微微弱弱的的-酮酮戊戊二二酸酸脱脱氢氢酶酶活活力力，使使-酮酮戊戊二二酸酸不不
26、能能继继续续氧化；氧化；n nCOCO2 2固固定定能能力力强强，使使四四碳碳二二羧羧酸酸全全部部由由COCO2 2固固定定反反应应提提供供，而而不不走乙醛酸循环；走乙醛酸循环；n n谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶的的活活力力很很强强，并并丧丧失失谷谷氨氨酸酸对对谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶的的反反馈馈抑抑制制和和反反馈馈阻阻遏遏，同同时时，NADPHNADPH2 2再再氧氧化化能能力力弱弱，使使-酮酮戊戊二二酸酸到到琥琥珀珀酸酸的过程受阻；的过程受阻；n n有有过过量量的的NHNH4 4+存存在在，-酮酮戊戊二二酸酸经经氧氧化化还还原原共共轭轭氨氨基基化化反反应应而而生生成成谷谷氨氨酸酸却却不不形形成
27、成蛋蛋白白质质，从从而而分分泌泌泄泄漏漏于于菌菌体体外外；同同时时，谷谷氨氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。n n生生产产菌菌株株还还应应该该具具有有生生物物素素合合成成缺缺陷陷、油油酸酸合合成成缺缺陷陷和和甘甘油油合合成成缺陷等特点。缺陷等特点。谷氨酸高产菌模型特征谷氨酸高产菌模型特征第三十七页，讲稿共一百二十三页哦1、谷氨酸生产菌的育种思路、谷氨酸生产菌的育种思路 谷氨酸生产的代谢调控谷氨酸生产的代谢调控第三十八页，讲稿共一百二十三页哦1.切断或减弱支路代谢 2.解除自身的反馈抑制 3.增加前体物的合成 4.提高细胞膜
28、的渗透性 5.强化能量代谢6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株 育种思路：育种思路：第三十九页，讲稿共一百二十三页哦1.切断或减弱支路代谢切断或减弱支路代谢 选育减弱选育减弱-酮戊二酸进一步氧化能力的突变株酮戊二酸进一步氧化能力的突变株 减弱-酮戊二酸脱氢酶复合体的活性，可以使代谢流向谷氨酸，从而使谷氨酸得到积累。选育减弱选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株途径后段酶活性的突变株 通过HMP途径也可生成核糖、核苷酸、辅酶Q、维生素K、叶酸等物质。这些物质的生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的产率降低。如果削弱或切断这些物质的合成途径，就会使谷氨酸的产率增加。这可通过选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸
29、能促进生长的突变株以及抗嘌呤、嘧啶类似物或核苷酸类抗生素来实现。第四十页，讲稿共一百二十三页哦选育不分解利用谷氨酸的突变株选育不分解利用谷氨酸的突变株选育不分解利用谷氨酸的突变株选育不分解利用谷氨酸的突变株 可可通通过过选选育育以以谷谷氨氨酸酸为为唯唯一一碳碳源源，菌菌体体不不长长或或生生长长微微弱弱的的突突变变株来实现。株来实现。选育减弱乙醛酸循环的突变株选育减弱乙醛酸循环的突变株选育减弱乙醛酸循环的突变株选育减弱乙醛酸循环的突变株 四四碳碳二二羧羧酸酸是是由由COCO2 2固固定定反反应应和和乙乙醛醛酸酸循循环环所所提提供供的的。减减弱弱乙乙醛醛酸酸循循环环，COCO2 2固固定定反反应应
30、所所占占的的比比例例就就会会增增大大，谷谷氨氨酸酸的的产产率率就就高高。这这可可通通过过选选育育琥琥珀珀酸酸敏敏感感型型突突变变株株、不不分分解解利利用用乙乙酸酸突突变变株株、异异柠檬酸裂解酶活力降低菌株来实现。柠檬酸裂解酶活力降低菌株来实现。阻止谷氨酸进一步代谢阻止谷氨酸进一步代谢阻止谷氨酸进一步代谢阻止谷氨酸进一步代谢 由由于于细细胞胞还还可可以以谷谷氨氨酸酸为为前前体体继继续续向向下下合合成成谷谷氨氨酰酰胺胺等等，要要避避免谷氨酸被菌体利用，还需要切断谷氨酸向下的代谢途径。免谷氨酸被菌体利用，还需要切断谷氨酸向下的代谢途径。第四十一页，讲稿共一百二十三页哦2.解除菌体自身的反馈调节解除菌
31、体自身的反馈调节 选育耐高渗透压突变株选育耐高渗透压突变株 要使菌种能高产谷氨酸，首先要使菌种具备在高糖、高谷氨酸的培养基中仍能正常生长、代谢的能力。这可通过选育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖+高谷氨酸突变株来实现。选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 当谷氨酸合成达到一定量时，谷氨酸就会反馈抑制和阻遏谷氨酸脱氢酶，使谷氨酸的合成停止，使代谢转向天冬氨酸的合成，因此要解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈调节。这可通过选育酮基丙二酸抗性、谷氨酸结构类似物抗性（如谷氨酸氧肟酸盐）、谷氨酰胺抗性突变株来实现。第四十二页，讲稿共一百二十三页哦3.增加前体物的合
32、成增加前体物的合成 选选育育强强化化三三羧羧酸酸循循环环中中从从柠柠檬檬酸酸到到-酮酮戊戊二二酸酸代代谢谢的的突突变株变株 这可通过选育柠檬酸合成酶活力强突变株及抗氟乙酸、氟化钠、重氮丝氨酸、氟柠檬酸等突变株来实现。选育强化选育强化CO2固定反应的突变株固定反应的突变株 这可通过选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源生长良好的突变株、氟丙酮酸敏感突变株以及丙酮酸或天冬氨酸缺陷突变株来实现。第四十三页，讲稿共一百二十三页哦4.提高细胞膜的渗透性提高细胞膜的渗透性（1）选育抗选育抗Vp类衍生物突变株类衍生物突变株 选育抗Vp类衍生物，如香豆素、卢丁等突变株，都能遗传性的改变细胞膜的渗透性。生物素缺陷株（生
33、物素亚适量）（2）选育溶菌酶敏感突变株选育溶菌酶敏感突变株 使细胞壁网状结构变疏松，对细胞膜保护作用降低，渗透性变大。（3）选育二氨基庚二酸缺陷突变株选育二氨基庚二酸缺陷突变株 第四十四页，讲稿共一百二十三页哦5.5.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株n n20002000年年，莲莲花花集集团团技技术术中中心心与与河河南南省省科科学学院院生生物物研研究究所所共共同同承承担担河河南南省省重重大大科科技技攻攻关关项项目目“FM00-187FM00-187谷氨酸高产酸菌种选育”，利用原生质融合这一基
34、因重组技术，将两个具有不同基因型的细胞进行融合，达到基因重组的目的，获得高产酸的谷氨酸菌株，谷氨酸产酸率由10.5%10.5%提提高高到到14%14%以以上上，糖糖酸酸转转化化率率提提高高到到65%65%以上。以上。第四十五页，讲稿共一百二十三页哦1 1、生产菌种、生产菌种n n现在经过鉴定和命名的谷氨酸生产菌很多，主要是棒现在经过鉴定和命名的谷氨酸生产菌很多，主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。n n它们有很多相似点：革兰氏阳性；不形成芽孢；没有它们有很多相似点：革兰氏阳性；不形成芽孢；没有鞭毛，不能运动；都需要生物素作为生长因
35、子；都具鞭毛，不能运动；都需要生物素作为生长因子；都具有一定的过量合成谷氨酸能力。有一定的过量合成谷氨酸能力。n n目前国内大多数厂家使用的菌种是天津工业微生物研目前国内大多数厂家使用的菌种是天津工业微生物研究所选育的究所选育的天津短杆菌天津短杆菌天津短杆菌天津短杆菌T6-13及其变异株。及其变异株。及其变异株。及其变异株。三、谷氨酸的生产工艺三、谷氨酸的生产工艺第四十六页，讲稿共一百二十三页哦2 2、谷氨酸发酵生产、谷氨酸发酵生产 发发酵酵初初期期（适适应应期期），糖糖基基本本没没有有利利用用，尿尿素素分分解解放放出出氨氨使使pHpH值略上升。延滞期的长短一般为值略上升。延滞期的长短一般为2
36、-4h2-4h。进进入入对对数数生生长长期期，代代谢谢旺旺盛盛，糖糖耗耗快快，尿尿素素大大量量分分解解，pHpH值值很很快快上上升升。但但随随着着氨氨被被利利用用pHpH值值又又下下降降，溶溶氧氧浓浓度度急急剧下降，然后又维持一定水平，菌体浓度迅速增大。剧下降，然后又维持一定水平，菌体浓度迅速增大。这这个个时时期期，为为了了及及时时供供给给菌菌体体生生长长必必需需的的氮氮源源及及调调节节培培养养液液的的pHpH值值至至7.5-7.87.5-7.8，必必须须流流加加尿尿素素；又又由由于于代代谢谢旺旺盛盛，泡泡沫沫增增加加并并放放出出大大量量发发酵酵热热，需需加加入入消消泡泡剂剂及及冷冷却却，使使
37、温温度度维维持持在在30-3230-32。这这个个阶阶段段主主要要是是菌菌体体生生长长，几几乎乎不不产产酸酸，一一般般为为12h12h左右。左右。第四十七页，讲稿共一百二十三页哦当菌菌体体生生长长基基本本停停止止就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的-酮酮戊戊二二酸和氨主要用来合成谷氨酸。酸和氨主要用来合成谷氨酸。这这一一阶阶段段，为为了了提提供供谷谷氨氨酸酸合合成成所所需需的的氨氨及及维维持持pH值值在在7.0-7.2，必必须须流流加加尿尿素素，又又为为了了促促进进谷谷氨氨酸酸的的合合成成需需要要加加大大通通气气量量，并并将将发发酵酵温温度度提提高高到到谷谷氨氨酸酸
38、合合成成的的最适温度最适温度36-3736-37。发发酵酵后后期期，菌菌体体衰衰老老，糖糖耗耗缓缓慢慢，残残糖糖低低，此此时时流流加加尿尿素素必必须须相相应应减减少少。当当营营养养物物质质耗耗尽尽酸酸度度不不再再增增加加时时需及时放罐。需及时放罐。发酵周期一般为发酵周期一般为30-36h。第四十八页，讲稿共一百二十三页哦第三节第三节 天冬氨酸族氨基酸发酵机制天冬氨酸族氨基酸发酵机制第四十九页，讲稿共一百二十三页哦一、生物合成途径及代谢调控机制一、生物合成途径及代谢调控机制、生物合成途径、生物合成途径 天天冬冬氨氨酸酸族族氨氨基基酸酸合合成成可可以以以以草草酰酰乙乙酸酸或或天天冬冬氨氨酸酸为为原
39、原料料，合合成成苏苏氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸、蛋蛋氨氨酸酸和和赖赖氨酸。氨酸。第五十页，讲稿共一百二十三页哦葡萄糖葡萄糖 丙酮酸丙酮酸 草酰乙酸草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸 天冬氨酸天冬氨酸-半醛半醛 赖氨酸赖氨酸 高丝氨酸高丝氨酸 蛋氨酸蛋氨酸 苏氨酸苏氨酸 异亮氨酸异亮氨酸EMPCO2 固定、氧化固定、氧化 氨基化反应氨基化反应天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶天冬氨酸天冬氨酸-半醛脱氢酶半醛脱氢酶二氢吡啶二羧酸（二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶）合成酶高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶 琥珀酰高丝氨琥珀酰高丝氨酸合成酶酸合成酶高丝氨酸激酶高丝氨酸激酶苏氨酸脱氨酶苏氨酸脱氨酶第五十一页，讲稿共一百二十三页哦第
40、五十二页，讲稿共一百二十三页哦第五十三页，讲稿共一百二十三页哦、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制 在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。1.大肠杆菌 K12K12 天冬氨酸激酶（AK）AK:AK:受苏氨酸、异亮氨酸的多价抑制和阻遏受苏氨酸、异亮氨酸的多价抑制和阻遏 AKAK：受蛋氨酸专一性抑制和阻遏 AKAK：受赖氨酸专一性抑制和阻遏：受赖氨酸专一性抑制和阻遏第五十四页，讲稿共一百二十三页哦天冬氨酸-半醛脱氢酶 专一性的受赖氨酸不完全的抑制二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶（赖氨酸分支的第一个酶）DDP合成酶受赖氨酸反
41、馈抑制。二氨基庚二酸（DAP）脱羧酶受赖氨酸阻遏第五十五页，讲稿共一百二十三页哦高丝氨酸脱氢酶（HD）（通向苏氨酸、蛋氨酸分支的第一个酶）HD：受苏氨酸反馈抑制 HD：受蛋氨酸阻遏苏氨酸脱氨酶（异亮氨酸合成途径的酶）受异亮氨酸的反馈抑制和阻遏第五十六页，讲稿共一百二十三页哦第五十七页，讲稿共一百二十三页哦2.黄色短杆菌黄色短杆菌 其其赖赖氨氨酸酸生生物物合合成成调调节节机机制制比比大大肠肠杆杆菌菌简简单单，其其天天冬冬氨氨酸酸激激酶酶只只有有一一种种，该该酶酶具具有有两两个个变变构构部部位位，可可以以与与终终产产物物结结合合，当当只只有有一一种种终终产产物物（赖赖氨氨酸酸或或苏苏氨氨酸酸）与与
42、酶酶结结合合，酶酶活活性性不不受受影影响响。当当两两种种终终产产物物（赖赖氨氨酸酸和和苏苏氨氨酸酸）同同时时过过量量时时，与与酶酶的的两两个个变变构构部部位位结结合合，该该酶酶活活性性受受到到抑抑制制，这这种种终终产产物物的的反反馈馈抑抑制制称称为为协协同同反馈抑制反馈抑制。第五十八页，讲稿共一百二十三页哦第五十九页，讲稿共一百二十三页哦3.乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节 1）存在代谢优先向苏氨酸和蛋氨酸方向进行。）存在代谢优先向苏氨酸和蛋氨酸方向进行。2）与黄色短杆菌区别：）与黄色短杆菌区别：n nAK受赖氨酸受赖氨酸+苏氨酸的反馈抑制苏氨酸的反馈抑制n n存存在在
43、代代谢谢互互锁锁，DDP合合成成酶酶的的合合成成受受亮亮氨氨酸酸阻阻遏，遏，DDP还原酶受半胱氨酸和丙氨酸抑制。还原酶受半胱氨酸和丙氨酸抑制。第六十页，讲稿共一百二十三页哦第六十一页，讲稿共一百二十三页哦n n黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌，其赖氨酸生物合成调节机制比大肠杆菌简单得多。这些细菌只有一种AK，不存在想大肠杆菌那样的三种同功酶。反馈调节易于解除，使育种过程简单化，故常被用作氨基酸发酵育种的出发菌株。第六十二页，讲稿共一百二十三页哦 谷谷谷谷氨氨氨氨酸酸酸酸棒棒棒棒杆杆杆杆菌菌菌菌、黄黄黄黄色色色色短短短短杆杆杆杆菌菌菌菌等等等等中中中中的的的的天天天天冬冬冬冬氨氨氨氨酸酸酸酸族族族族氨
44、氨氨氨基基基基酸酸酸酸的的的的代代代代谢谢谢谢调调调调节机制包括以下几方面：节机制包括以下几方面：节机制包括以下几方面：节机制包括以下几方面：n n关键酶关键酶关键酶关键酶 AKAKAKAK是关键酶，受是关键酶，受是关键酶，受是关键酶，受LysLysLysLys和和和和ThrThrThrThr的协同反馈抑制。的协同反馈抑制。的协同反馈抑制。的协同反馈抑制。n n优先合成优先合成优先合成优先合成 MetMetMetMet比比比比ThrThrThrThr、LysLysLysLys优先合成，优先合成，优先合成，优先合成，ThrThrThrThr比比比比LysLysLysLys优先合成。优先合成。优先
45、合成。优先合成。n n代代代代谢谢谢谢互互互互锁锁锁锁 在在在在乳乳乳乳糖糖糖糖发发发发酵酵酵酵短短短短杆杆杆杆菌菌菌菌中中中中，LysLysLysLys分分分分支支支支途途途途径径径径的的的的初初初初始始始始酶酶酶酶DDPDDPDDPDDP合合合合成酶受成酶受成酶受成酶受LeuLeuLeuLeu的反馈阻遏。的反馈阻遏。的反馈阻遏。的反馈阻遏。n n平平平平衡衡衡衡合合合合成成成成 AspAspAspAsp和和和和乙乙乙乙酰酰酰酰CoACoACoACoA形形形形成成成成平平平平衡衡衡衡合合合合成成成成。当当当当乙乙乙乙酰酰酰酰CoACoACoACoA合合合合成成成成过过过过量量量量时，能解除时
46、，能解除时，能解除时，能解除AspAspAspAsp对对对对PEPPEPPEPPEP羧化酶的反馈抑制。羧化酶的反馈抑制。羧化酶的反馈抑制。羧化酶的反馈抑制。n nAspAspAspAsp与与与与GluGluGluGlu之之之之间间间间的的的的调调调调节节节节机机机机制制制制 GluGluGluGlu比比比比AspAspAspAsp优优优优先先先先合合合合成成成成。当当当当GluGluGluGlu合合合合成成成成过过过过量量量量时时时时，反反反反馈馈馈馈抑抑抑抑制制制制GHDGHDGHDGHD，使使使使生生生生物物物物合合合合成成成成转转转转向向向向AspAspAspAsp。当当当当AspAsp
47、AspAsp合合合合成成成成过过过过量量量量时时时时，反反反反馈馈馈馈抑制抑制抑制抑制PEPPEPPEPPEP羧化酶，使整个生物合成停止。羧化酶，使整个生物合成停止。羧化酶，使整个生物合成停止。羧化酶，使整个生物合成停止。第六十三页，讲稿共一百二十三页哦第六十四页，讲稿共一百二十三页哦二、赖氨酸发酵二、赖氨酸发酵 L-L-赖氨酸的化学名称为2,6-二氨基己酸，分子式C6H14O2N2。作为第一限制性必需氨基酸，广泛应用于食品、饲料和医药工业，在平衡氨基酸组成方面起着十分重要的作用。目前绝大部分赖氨酸都是采用发酵法生产。目前绝大部分赖氨酸都是采用发酵法生产。第六十五页，讲稿共一百二十三页哦 赖赖
48、氨氨酸酸是是一一种种必必需需氨氨基基酸酸，可可以以促促进进儿儿童童发发育育，增增强强体质。补充适量体质。补充适量L-L-赖氨酸，可以大大提高蛋白质的利用率。赖氨酸，可以大大提高蛋白质的利用率。赖赖氨氨酸酸被被广广泛泛用用于于食食品品强强化化剂剂、饲饲料料添添加加剂剂及及医医疗疗保保健健、滋滋补补饮饮料料等等各各方方面面，是是一一个个具具有有广广泛泛市市场场的的氨氨基基酸产品。酸产品。目目前前全全世世界界产产量量已已达达20万万吨吨，而而且且还还呈呈上上升升趋趋势势，其其中中日日本本占占世世界界产产量量的的60%60%，我国赖氨酸生产水平还有待提高。第六十六页，讲稿共一百二十三页哦公司公司公司公
49、司厂址厂址厂址厂址规模规模规模规模(万吨万吨万吨万吨/年年年年)制法制法制法制法味之素味之素味之素味之素日本，九州佐贺县日本，九州佐贺县日本，九州佐贺县日本，九州佐贺县2.02.0发酵法发酵法发酵法发酵法协和发酵协和发酵协和发酵协和发酵日本，山口县防府日本，山口县防府日本，山口县防府日本，山口县防府1.51.5发酵法发酵法发酵法发酵法哈特兰德赖氨酸公司哈特兰德赖氨酸公司哈特兰德赖氨酸公司哈特兰德赖氨酸公司美国，依阿华州美国，依阿华州美国，依阿华州美国，依阿华州2.02.0发酵法发酵法发酵法发酵法生物协和发酵生物协和发酵生物协和发酵生物协和发酵美国，蜜苏里州开普吉拉多美国，蜜苏里州开普吉拉多美国
50、，蜜苏里州开普吉拉多美国，蜜苏里州开普吉拉多1.361.36发酵法发酵法发酵法发酵法ADMADM公司公司公司公司美国，依利诺斯州迪凯特美国，依利诺斯州迪凯特美国，依利诺斯州迪凯特美国，依利诺斯州迪凯特4.74.7发酵法发酵法发酵法发酵法亚吉诺莫托公司亚吉诺莫托公司亚吉诺莫托公司亚吉诺莫托公司美国，北卡罗来纳州罗利美国，北卡罗来纳州罗利美国，北卡罗来纳州罗利美国，北卡罗来纳州罗利不详不详不详不详发酵法发酵法发酵法发酵法欧洲赖氨酸公司欧洲赖氨酸公司欧洲赖氨酸公司欧洲赖氨酸公司法国，亚眠法国，亚眠法国，亚眠法国，亚眠2.02.0发酵法发酵法发酵法发酵法日本味之素泰国公司日本味之素泰国公司日本味之素泰