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1、第二节动物细胞工程技术第1页，此课件共56页哦思考与回忆：1 1、动物细胞全能性特点？、动物细胞全能性特点？随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄。细胞核仍具有全能性。窄。细胞核仍具有全能性。2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成动物个体？成动物个体？不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定不能。动物细胞和组织在体外培养的过程中，伴随一定的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的的组织分化，不管采用什么手段和培养条件，由于细胞的运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间的
2、培养运动、变化，细胞发生结构功能变异，结果长时间的培养只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培只能使单一类型的细胞保存下来，最终成了简单的细胞培养。养。3、动物的细胞培养的理论依据（原理）？、动物的细胞培养的理论依据（原理）？细胞增殖细胞增殖第2页，此课件共56页哦动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合动物动物细胞细胞工程工程主要主要技术技术其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植核移植第3页，此课件共56页哦第4页，此课件共56页哦一、动物细胞培养的一、动物细胞培养的概念和原理概念和原理：1 1、概念：、概念：动物细胞动物细胞培养就是
3、从动物有机培养就是从动物有机体中取出相关的体中取出相关的组织组织,将它分散成将它分散成单个细胞单个细胞,然后然后,放在适宜的放在适宜的培培养基养基中中,让这些让这些细胞细胞生长和增殖生长和增殖.2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖第5页，此课件共56页哦3 3.动物细胞培养的动物细胞培养的条件条件:1 1）营养：营养：4 4）气体环境：）气体环境：2 2）无菌无毒的环境：无菌无毒的环境：3 3）温度和）温度和pHpH：第6页，此课件共56页哦条件条件:1 1）营养：营养：对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液中培养液中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中防止培养过程
4、中污染；污染；定期更换培养液定期更换培养液以清除代谢产以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。物，防止对培养细胞造成危害。2 2）无菌无无菌无毒的环境：毒的环境：液体合成培养基液体合成培养基：（：（糖、氨基酸）、糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元促生长因子、（水、无机盐、微量元素）素）等；通常还需加入等；通常还需加入血浆、血清等血浆、血清等天然成分。天然成分。第7页，此课件共56页哦条件条件:适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞人和哺乳动物细胞最适温度为最适温度为36.50.5。适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：PH：7.2-7.44 4）气体环境：）气体环境：3 3）温度和）温度和
5、pHpH：“95空气空气+5CO2”的混合气的混合气体培养箱。体培养箱。氧氧气是细胞代谢必须的；气是细胞代谢必须的；CO2维维持培养液的持培养液的PHPH。第8页，此课件共56页哦问题问题1 1、动物血清的作用是动物血清的作用是什么什么？以以提供提供一个类似生物体一个类似生物体的的内环境内环境；此外动物此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以可以促进促进细胞的细胞的发育发育。第9页，此课件共56页哦胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理取出组织取出组织胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎剪碎单个细胞单个细胞细胞悬液细胞悬液转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养
6、原代培养原代培养4 4：过程：过程：图示图示原代培养原代培养第10页，此课件共56页哦 定义：定义：人们通常将动物组织人们通常将动物组织消化后消化后的的初次初次培养培养称为原代培养。称为原代培养。原代原代培养培养4 4：过程：过程：第11页，此课件共56页哦问题问题2 2、为什么选用动物为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？做动物细胞培养材料？问题问题3 3、为什么在用酶处理前要先剪碎？、为什么在用酶处理前要先剪碎？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。低。增大与酶的接触面积。增大与酶的接触面积。
7、问题问题3 3、为什么培养前要将组织细胞为什么培养前要将组织细胞分散成单个分散成单个细胞细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。第12页，此课件共56页哦问题问题5 5：为什么用为什么用胰蛋白酶胰蛋白酶处理？处理？（动物组织细胞间隙中含有一定量的（动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质弹性纤维等蛋白质，），）胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。个细胞。问题问题6 6：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白
8、酶？为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适PH值为值为7.2-7.4，胰蛋白酶，胰蛋白酶作用的适宜作用的适宜PH为为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜，胃蛋白酶适宜PH为为2.胃胃蛋白酶在蛋白酶在PH为为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。的动物细胞培养中无活性。第13页，此课件共56页哦问题问题7 7：用胰蛋白酶处理用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉不会把所培养的细胞消化掉吗？吗？问题问题8 8、动物细胞培养动物细胞培养能否能否像绿色植物组织培养那样最像绿色植物组织培养那样最终终培养成新个体培养成新个体？控制好时间！长时间处理当然会损伤控制好时间！长时间处理
9、当然会损伤细胞。细胞。不能，动物细胞培养只能使细胞数目增不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体多，不能发育成新的动物个体第14页，此课件共56页哦问题问题8、动物细胞培养液有哪两大特点？动物细胞培养液有哪两大特点？问题问题9 9、为什么会出现为什么会出现贴壁生长贴壁生长 1、贴壁生长、贴壁生长 2、接触抑制、接触抑制 大多数组织细胞不适应悬浮生长，必须在固定的表面大多数组织细胞不适应悬浮生长，必须在固定的表面上生长和分裂。上生长和分裂。问题问题1010、如何解除如何解除接触抑制接触抑制：传代培养传代培养第15页，此课件共56页哦强调一：强调一：细胞贴壁过程细胞贴壁过程细胞
10、贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附贴附在瓶壁在瓶壁上，称为细胞贴壁。上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖表面光滑、无毒、易于帖附。附。第16页，此课件共56页哦 当贴壁细胞分裂生当贴壁细胞分裂生长到表面长到表面相互接触相互接触时时,细胞细胞就会就会停止分裂停止分裂增殖，这种增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。现象称为细胞的接触抑制。强调二强调二：接触抑制：接触抑制第17页，此课件共56页哦 定义：定义：当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触抑制后接触抑制后,用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理处理,使细胞从瓶
11、壁上使细胞从瓶壁上脱离脱离下下来来,然后加入新的培养液然后加入新的培养液,将细胞分离稀释将细胞分离稀释,并并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这这个过程称个过程称传代培养传代培养.（分瓶培养的过程分瓶培养的过程）细胞：细胞：分为分为细胞株细胞株和和细胞系细胞系 传代培养传代培养第18页，此课件共56页哦问题问题1111、如何界定原代培养、传代培养？细胞株、细如何界定原代培养、传代培养？细胞株、细胞系？胞系？原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，通常把第一代至第十代以内的培后立即进行培养，通常把第一代至第十
12、代以内的培养细胞统称为原代细胞培养养细胞统称为原代细胞培养；将原代培养的培养将原代培养的培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养，这个过程就称为传代培养。内，再进行培养，这个过程就称为传代培养。细胞分裂细胞分裂1050代为细胞株代为细胞株；分裂分裂50代以上极为代以上极为细胞系。细胞系。第19页，此课件共56页哦细胞株：传代细胞一般能传到细胞株：传代细胞一般能传到40-5040-50代，代，遗遗传物质一般不会发生改变传物质一般不会发生改变，叫细胞株。，叫细胞株。强调：细胞系、细胞株强调：细胞系、细胞株细胞系：传代细胞系：
13、传代5050代以后不能再传下去，部分代以后不能再传下去，部分细胞细胞遗传物质发生了改变遗传物质发生了改变，能连续传代，获得，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。不死性，叫细胞系。第20页，此课件共56页哦5 5、总结：动物细胞、总结：动物细胞培养过程培养过程动物胚胎或幼龄动物的组动物胚胎或幼龄动物的组织、器官织、器官配置细胞悬液配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理剪碎用胰蛋白酶处理1010代细胞代细胞转入培养瓶转入培养瓶40-5040-50代细胞代细胞传传代代培培养养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液稀释加培养液稀释传代传代1010代以内，代以内，遗传物质不改变，保遗传物质不改变，保持持正常正常
14、二倍体核型二倍体核型。传代传代10-5010-50代左右，增长缓慢以至于代左右，增长缓慢以至于完全停止，完全停止，部分细胞核型可能发生变部分细胞核型可能发生变化化（遗传物质可能改变（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？为什么用胰蛋白酶处理？分瓶分瓶传代培养传代培养原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁、接细胞贴壁、接触抑制触抑制继续传代培养少部分细胞继续传代培养少部分细胞获得不死性获得不死性，细胞突变细胞突变，遗传物质已经改变遗传物质已经改变，等同等同于癌细胞于癌细胞。细细胞胞株株：一一般般说说遗遗传传物物质质未未改改变变细细胞胞系系：遗遗传传物物质质已已改改变变原原代代培培养养第21页，此
15、课件共56页哦6 6.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用:1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 第22页，此课件共56页哦植物组织培养和动物细胞培养的比较：植物组织培养和动物细胞培养的比较：比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞
16、的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 促促-动物血清动物血清培养结果培养结果植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系培养目的培养目的快速繁殖、培育无快速繁殖、培育无病毒植株病毒植株获得细胞或细胞获得细胞或细胞分泌蛋白分泌蛋白取材取材植物幼嫩部分或花植物幼嫩部分或花药药胚胎或幼龄动物胚胎或幼龄动物的器官或组织的器官或组织其他条件其他条件无菌无毒，适宜条无菌无毒，适宜条件件无菌无毒，适宜无菌无毒，适宜条件条件第23页，此课件共56页哦第24页，此课件共56页哦人鼠细胞融合过
17、程第25页，此课件共56页哦1 1、定义：、定义：指用自然或人工方法使指用自然或人工方法使两个或多个不两个或多个不同的细胞融合成一个同的细胞融合成一个细胞的过程。细胞的过程。一）、动物细胞融合一）、动物细胞融合细胞杂交：细胞杂交：不同基因型的细胞之间的融合就是不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交细胞杂交。杂交细胞：杂交细胞：融合后形成的具有原来融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息两个或多个细胞遗传信息的的单核细胞单核细胞成为杂交细胞成为杂交细胞。第26页，此课件共56页哦 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用第27页，此课件
18、共56页哦动物细动物细胞融合胞融合第28页，此课件共56页哦2、诱导融合的诱导融合的方法方法 物理法：物理法：电激电激融合融合 化学法：化学法：聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG诱导融诱导融合合.生物法：生物法：灭活的病毒灭活的病毒诱导融合诱导融合.(.(动物细胞融合所特有的。动物细胞融合所特有的。这是由这是由于于病毒的外壳病毒的外壳磷脂与动物细胞的磷脂与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。能。)病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒颗粒
19、穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞第29页，此课件共56页哦问题：问题：为什么细胞融合过程中使用的病为什么细胞融合过程中使用的病 毒需要灭活？不灭活行吗？毒需要灭活？不灭活行吗？因为灭活的病毒因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。合。若若不灭活不灭活则会则会感染细胞感染细胞，且，且不能诱导不能诱导细胞融合。细胞融合。第30页，此课件共56页哦3 3、动物细胞融合技术的应用、动物细胞融合技术的应用 意义：意义：细胞融合技术细胞融合技术突破了有性杂交的突破了有性杂交的局限局
20、限，使远缘杂交成为可能。，使远缘杂交成为可能。主要用途：主要用途：利用杂交瘤技术，利用杂交瘤技术，制备单克隆抗制备单克隆抗体。体。第31页，此课件共56页哦二）：动物细胞融合的成功应用二）：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备第32页，此课件共56页哦人们获得抗体的传统方法是什么人们获得抗体的传统方法是什么?将抗原注入动物体将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么?效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。产生严重的过敏反应。运用已学知识，
21、设想怎样获得单一类型的抗体？运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？能否用单个能否用单个B B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？产生单一类型的抗体呢？-B B淋巴细胞在体外不能无限增殖。淋巴细胞在体外不能无限增殖。思考思考第33页，此课件共56页哦单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备极富创造性的方案极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的B B淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖能力和具有无限增殖能力的的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起，融合在一起，形成杂交瘤细胞形成杂交瘤细胞。杂交瘤细。杂交瘤细胞胞既既能在体外快速生长，能在体外快速生长
22、，又又能持续分泌成分单一的特异能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。抗体分子，就是单克隆抗体。米尔斯坦米尔斯坦(阿根廷阿根廷)和科勒和科勒(德国德国)因此在因此在19841984年获诺贝尔奖。年获诺贝尔奖。第34页，此课件共56页哦杂交杂交杂交杂交 细胞细胞细胞细胞灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞经免疫经免疫经免疫经免疫的小鼠的小鼠的小鼠的小鼠提取提取杂交瘤杂交瘤
23、杂交瘤杂交瘤细胞细胞细胞细胞第一次筛选第一次筛选第一次筛选第一次筛选用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基第二次筛选第二次筛选第二次筛选第二次筛选能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养体外培养体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体第35页，此课件共56页哦问题：问题：1 1）、本过程利用了哪些）、本过程利用了哪些原理原理？免疫原理；免疫原理；细
24、胞融合原理和动物细胞培养原理细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2）、为什么选用）、为什么选用小鼠小鼠骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞与B B细胞细胞融合？融合？同种生物的细胞没有免疫排斥反应；同种生物的细胞没有免疫排斥反应；融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质。传物质。（不仅具有（不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体）有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体）第36页，此课件共56页哦3 3 3 3）、为何要进行）、为何要进行）、为何要进行）、为何要进行两次筛选两次筛选？4 4）、
25、如何进行）、如何进行第第2 2次筛选次筛选？培养在多孔培养板上，培养在多孔培养板上，每孔只有一个每孔只有一个杂交瘤细胞。杂交瘤细胞。第第1 1次筛选次筛选得到得到杂交瘤细胞杂交瘤细胞（多种）。（多种）。第第2 2次筛选次筛选得到能得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。群。问题：问题：第37页，此课件共56页哦 动物特异性动物特异性免疫免疫 分离分离B淋巴细胞（淋巴细胞（B）；）；找到找到骨髓瘤细胞（骨髓瘤细胞（G）。注意）。注意B淋巴细胞是一淋巴细胞是一个系列。（个系列。（B1,B2,B3,-Bn）细胞细胞融合融合三种融合方式三种融合方式:（BB;BG;GG）第第一次筛
26、选一次筛选：在：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（只有（只有BG杂交瘤细胞存活。但杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G-BnG。而而BB,GG在此培养基上不能存活。）在此培养基上不能存活。）第第二次筛选二次筛选：在：在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列 ，每孔只放每孔只放一个杂交瘤细胞。一个杂交瘤细胞。“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行每个杂交瘤细胞，并进行“单一单一抗体检测抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。的孔内即是所需要的杂交瘤
27、细胞。选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外体外培养培养或注射到或注射到小鼠腹腔内小鼠腹腔内增殖增殖。提取提取单克隆抗体。单克隆抗体。1、单抗的制备过程单抗的制备过程要点：要点：第38页，此课件共56页哦1、作为诊断试剂作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等瘤的定位等,与常规抗体相比与常规抗体相比,具有具有准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速特点特点.2、用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物：主要用于癌症治疗。主要用于癌症治疗。生物导弹：生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体抗癌细胞的单克隆抗体+放射性
28、同位素放射性同位素+化学药物化学药物或细胞毒素或细胞毒素。（。（单克隆抗体：导向单克隆抗体：导向准确找到癌细胞位置；准确找到癌细胞位置；药物药物原位杀死癌细胞。）原位杀死癌细胞。）2 2、单克隆抗体的优点：、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，可大量制备。特异性强，灵敏度高，可大量制备。3 3 3 3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用第39页，此课件共56页哦三）、动物体细胞核移植技术和克隆动物三）、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：定义：动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞的一个细胞的细胞核细胞核,移入一个已经移入一个已经去掉细胞核的
29、卵母细胞中去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎,这个新的胚胎这个新的胚胎最终发育为最终发育为动物个体动物个体.3、分类：分类：胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对容易。能性相对容易。动物体细胞分化程动物体细胞分化程度高，恢复其全能度高，恢复其全能性十分困难性十分困难2、原理：原理：动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性第40页，此课件共56页哦体细胞核移植过程体细胞核移植过程-示动物克隆示动物克隆-无性繁殖无性繁殖克隆羊克隆羊多利培多利培 育过程：育过程：黑面绵羊去黑面
30、绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎胚胎移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利供体供体受体受体代孕代孕受体受体第41页，此课件共56页哦核移植核移植流程流程:1、供体、供体（体）（体）、受体受体（卵母）（卵母）细胞细胞的采集与培养的采集与培养4、电刺激促融电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚使供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎。胎。3、将供体细胞与去核卵母细胞、将供体细胞与去核卵母细胞紧密接触紧密接触2、显微操作、显微操作去除去除卵
31、母细胞中的卵母细胞中的核核5、胚胎、胚胎移植移植入代孕母牛体内入代孕母牛体内6、妊娠、妊娠分娩分娩与供体遗传物质基础相同的犊牛。与供体遗传物质基础相同的犊牛。第42页，此课件共56页哦1 1 1 1）、）、）、）、克隆动物性状与供体动物完全一样吗克隆动物性状与供体动物完全一样吗？2 2）、供体和受体动物可为同一个体吗）、供体和受体动物可为同一个体吗？可以。可以。不完全！不完全！因为：因为：一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体质（如线粒体DNADNA）来自于受体卵母细胞）来自于受体卵母细胞.二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境
32、的影二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。响。问题：问题：第43页，此课件共56页哦3 3 3 3）、为什么要对乳腺细胞进行饥饿处理？）、为什么要对乳腺细胞进行饥饿处理？）、为什么要对乳腺细胞进行饥饿处理？）、为什么要对乳腺细胞进行饥饿处理？4 4）、除）、除电刺激促融外，还有其他电刺激促融外，还有其他方法吗方法吗？也可用显微注射法。也可用显微注射法。核移植的乳腺细胞是经过细胞培育核移植的乳腺细胞是经过细胞培育3 36 6代的细胞。代的细胞。在饥饿状态下，在饥饿状态下，大部分细胞死亡，小部分转入静止大部分细胞死亡，小部分转入静止期而实现脱分化。这些脱分化的细胞即可作核供体期而实现脱
33、分化。这些脱分化的细胞即可作核供体问题：问题：第44页，此课件共56页哦二、动物细胞工程的应用快速繁殖优良品种克隆转基因动物拯救濒危灭绝的动物培育人造器官第45页，此课件共56页哦4.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景第46页，此课件共56页哦5.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题第47页，此课件共56页哦 取供体细胞取供体细胞传代培养传代培养1010代代以内的细胞以内的细胞.为为什么？什么？用的是去核用的是去核的减数第二的减数第二次分裂中期次分裂中期细胞（细胞（M中期中期）为什）为什么？么？激活方法：激活方法：激活目的：激活目的：促融方法：促融方法：电刺激
34、电刺激胚胎移植至代胚胎移植至代孕受体内孕受体内 妊娠、分娩妊娠、分娩2.）核移植流程）核移植流程供体：优质高产奶牛供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）母细胞的采集与培养）1.体积大，易体积大，易操作。操作。2.含有促含有促使细胞核表达全使细胞核表达全能性的物质和营能性的物质和营养条件。养条件。有人说它三个母亲，有人说它三个母亲，对吗？对吗？第48页，此课件共56页哦例题例题例题例题1 1 1 1：1975197519751975年，英国剑桥大学分子生物学年，英国剑桥大学分子生物学年，英国剑桥大学分子生物学年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把
35、小鼠实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目胞，实现在体外大量生产抗体的目胞，实现在体外大量生产抗体的目胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。的。实验过程如图所示。的。实验过程如图所示。的。实验过程如图所示。(1)(1)(1)(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细
36、胞，两种细胞膜也能淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合融合融合融合”在一起，说明细胞膜在一起，说明细胞膜在一起，说明细胞膜在一起，说明细胞膜 。(2)(2)(2)(2)单克隆抗体的准确定义应为单克隆抗体的准确定义应为单克隆抗体的准确定义应为单克隆抗体的准确定义应为 ()()()()A A A A一类特殊抗体一类特殊抗体一类特殊抗体一类特殊抗体 B B B B无性繁殖系无性繁殖系无性繁殖系无性繁殖系 C C C C单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体单一抗体细胞的无性繁殖第
37、产生的抗体单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体 D D D D单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体(3)(3)(3)(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是杂交瘤细胞繁殖进行的是杂交瘤细胞繁殖进行的是杂交瘤细胞繁殖进行的是_分裂，其遗传性状分裂，其遗传性状分裂，其遗传性状分裂，其遗传性状_。(4)(4)(4)(4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等
38、病原体或癌变细胞等病原体或癌变细胞等病原体或癌变细胞等)并并并并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹”这是利用了这是利用了这是利用了这是利用了 _ 。具有一定的流动性具有一定的流动性具有一定的流动性具有一定的流动性C C C C有丝有丝有丝有丝不变不变不变不变抗体能与抗原发生特异性结合的特点抗体能与抗原发生特异性结合的特点抗体能与抗原发生特异性结合的特点抗体能与抗原发生特异性结合的特点第49页，此课件共56页哦已知细胞已知细胞已知细胞已知
39、细胞合成合成合成合成DNADNA有有有有D D和和和和S S两条途径两条途径两条途径两条途径，其中，其中，其中，其中D D途径能被途径能被途径能被途径能被氨基嘌呤氨基嘌呤氨基嘌呤氨基嘌呤阻断。人淋阻断。人淋阻断。人淋阻断。人淋巴细胞中有这两种巴细胞中有这两种巴细胞中有这两种巴细胞中有这两种DNADNA的合成途径，但一般不分裂增殖。的合成途径，但一般不分裂增殖。的合成途径，但一般不分裂增殖。的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中鼠骨髓瘤细胞中鼠骨髓瘤细胞中鼠骨髓瘤细胞中尽管没有尽管没有尽管没有尽管没有S S途径途径途径途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加，但能不断分裂增殖，
40、将这两种细胞在试管中混合，加，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：（1 1）试管中除融合的杂种细胞外，还有）试管中除融合的杂种细胞外，还有）试管中除融合的杂种细胞外，还有）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。种融合细胞。种融合细胞。种融合细胞。（2 2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中
41、分离出）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出 杂种细胞，并说原理。杂种细胞，并说原理。杂种细胞，并说原理。杂种细胞，并说原理。方法：方法：方法：方法：。原理：原理：原理：原理：培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞加入氨基嘌呤后加入氨基嘌呤后,使使使使D D合成的途径阻断合成的途径阻断,所以仅所以仅所以仅所以仅D D合合合合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖成途径的骨髓瘤细胞或彼此融
42、合的细胞就不能增殖,但但但但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成途径合成DNADNA而而而而增殖增殖增殖增殖第50页，此课件共56页哦 例题例题例题例题22（1 1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，将抗原注射到小鼠体内，可获得将抗原注射到小鼠体内，可获得将抗原注射到小鼠体内，可获得将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选多选多选多选)（）A AT T淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞
43、B B效应效应效应效应B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞 C C抗体抗体抗体抗体 D D记忆细胞记忆细胞记忆细胞记忆细胞（2 2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，正确的是正确的是正确的是正确的是 (多选多选多选多选)（）A AB B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台 病毒或聚乙二醇诱导病毒或聚乙二醇诱导病毒或聚
44、乙二醇诱导病毒或聚乙二醇诱导 B B融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克 隆抗体隆抗体隆抗体隆抗体 C C体外培养时，一个体外培养时，一个体外培养时，一个体外培养时，一个B B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不淋巴细胞可以产生一种抗体，但不淋巴细胞可以产生一种抗体，但不淋巴细胞可以产生一种抗体，但不 能无限增殖能无限增殖能无限增殖能无限增殖 D D单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，单克隆
45、抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性明显优越性明显优越性明显优越性明显 BCD ACD第51页，此课件共56页哦黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核a重组细胞重组细胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利1、写出、写出AB所代表细胞工程名称：所代表细胞工程名称：a表示：表示：b表示表示:2、实施细胞工程时，所需受、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞的体细胞大多采用卵母细胞的原因：原因：体积大，易操作。含有促使细
46、胞核表达体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。全能性的物质和营养条件。3 3、多利面部毛色是：、多利面部毛色是：根据遗传学原理说明判断依据。根据遗传学原理说明判断依据。4 4、若黑面绵羊的基因型为、若黑面绵羊的基因型为AA,AA,白面白面绵羊的基因型为绵羊的基因型为aaaa，则克隆羊的基因，则克隆羊的基因型为型为 核移植核移植胚胎移植胚胎移植白色白色多利全部的核基因都来自白面绵羊多利全部的核基因都来自白面绵羊aa第52页，此课件共56页哦B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC 下图为某同学根
47、据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案杆菌单克隆抗体的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞
48、株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50例例3 3：第53页，此课件共56页哦问题问题3 3：为什么用胰蛋白酶处理？：为什么用胰蛋白酶处理？问题问题1 1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题问题2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单
49、个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。问题问题4 4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适PH值为值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜，胰蛋白酶作用的适宜PH为为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜
50、，胃蛋白酶适宜PH为为2.胃蛋白酶在胃蛋白酶在PH为为7.2-7.4的动的动物细胞培养中无活性。物细胞培养中无活性。问题问题5 5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。第54页，此课件共56页哦问题问题6 6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？培养基有何独特之处？问题问题7 7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？成新个体？主要成分