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1、第九章生物大分子的分离与纯化技术2022/10/81第1页，此课件共36页哦第九章第九章 生物大分子的分离与纯化技术生物大分子的分离与纯化技术9.1 9.1 概述概述概述概述 生物大分子是指蛋白质生物大分子是指蛋白质(包括酶包括酶)、多聚糖和核酸类化合物，一般、多聚糖和核酸类化合物，一般分子量从几千到几百万。它分子量从几千到几百万。它 们广泛存在于各种生物体内，与各们广泛存在于各种生物体内，与各种生命活动息息相关。除了天然存在的外，还有生物工程培养和种生命活动息息相关。除了天然存在的外，还有生物工程培养和发酵的。生物大分子具有十分重要的生理功能和应用价值。发酵的。生物大分子具有十分重要的生理功
2、能和应用价值。研研究生物大分子的结构、功能及应用已成为生命科学的一个关键问究生物大分子的结构、功能及应用已成为生命科学的一个关键问题。蛋白质药物及其他生物制品在医药方面有着十分重要的应用题。蛋白质药物及其他生物制品在医药方面有着十分重要的应用前景。不论从动植物和微生物体内提取或用生物工程前景。不论从动植物和微生物体内提取或用生物工程 制备的生制备的生物大分子产品，都是组成十分复杂的混合物，在使用前都要分离物大分子产品，都是组成十分复杂的混合物，在使用前都要分离和纯化。和纯化。2022/10/82第2页，此课件共36页哦9.1.1 生物大分子分离纯化的特殊性生物大分子分离纯化的特殊性1、要求产品
3、保持其生物活性，也就是说要避免不可逆结构变化发、要求产品保持其生物活性，也就是说要避免不可逆结构变化发 生。生。2、多孔填料必须使用大、多孔填料必须使用大 孔径基质。孔径基质。3、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。所以在选择色谱条、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。所以在选择色谱条件时不能随便套用小分子的件时不能随便套用小分子的 条件。条件。2022/10/83第3页，此课件共36页哦9.1.2 生物大分子分离技术生物大分子分离技术本章以下的方法主要以蛋白质及酶为分离对象。本章以下的方法主要以蛋白质及酶为分离对象。2022/10/84第4页，此课件共36页哦9.2 9.2 蛋白质的
4、反相色谱（蛋白质的反相色谱（蛋白质的反相色谱（蛋白质的反相色谱（RPCRPC）9.2.1 分离机理分离机理蛋白质的反相色谱中：蛋白质的反相色谱中：用用C4C8烷基作配基（将配基键合在固定基质上作为固定相）为固定相，以水溶性烷基作配基（将配基键合在固定基质上作为固定相）为固定相，以水溶性有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。有机溶剂（如甲醇、乙腈、异丙醇）加强酸作流动相（流动相极性大于固定相）。蛋白质分子中既有亲蛋白质分子中既有亲 水性基团（水性基团（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏水性基等），也有疏水性基团（如苯环、团（如苯环、-CH3、-CH2和
5、和-CH等）。等）。在水溶液中，疏水性基团有避开水而亲合其他疏水性基团的倾向，即溶质分在水溶液中，疏水性基团有避开水而亲合其他疏水性基团的倾向，即溶质分子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小，促进了其与填料（疏水子的非极性部分在水中倾向于与水的接触面减小，促进了其与填料（疏水性配基）的亲合。性配基）的亲合。不同的蛋白质在相同流不同的蛋白质在相同流 动相中由于疏水基团多少、种类以及表面分布情况不同，与填料动相中由于疏水基团多少、种类以及表面分布情况不同，与填料的亲合力也不同，从而得到的亲合力也不同，从而得到 分离。分离。结果：结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋白质就疏水性强
6、的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋白质就容容易被洗脱。易被洗脱。2022/10/85第5页，此课件共36页哦9.2.2 色谱条件色谱条件固定相：常用固定相：常用C4 C8链烃作为配基（键合在固体基质上）为填链烃作为配基（键合在固体基质上）为填料。孔径料。孔径2550nm。流动相：流动相：水溶性有机溶剂（水溶性有机溶剂（B液）液）（甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃）（甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃）水（水（A液）液）强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸 ）洗脱能力增大加酸作用：加酸作用：SiOH=SiO-H+蛋白质易与蛋白质易与SiO-结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。结合很
7、难洗脱，加酸抑制上述平衡向右离解。减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。温度：常温温度：常温2022/10/86第6页，此课件共36页哦 检测：用紫外检测器，检测波长检测：用紫外检测器，检测波长280nm 和和220nm。280nm检测中含有含苯环的检测中含有含苯环的 酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的蛋白质，酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的蛋白质，一般蛋白质都含有苯环，所以一般蛋白质都含有苯环，所以280nm检测检测 是普遍使用的波长。是普遍使用的波长。220nm主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。主要检测肽键；所以所有蛋白质普遍适用。核酸可在核酸可在2
8、60nm检测。检测。洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱逐渐增加洗脱强度。逐渐增加洗脱强度。有机小分子与蛋白质在反相色谱中的洗脱曲线不一样。以有机小分子与蛋白质在反相色谱中的洗脱曲线不一样。以B液的百分含量和蛋白质的容量因液的百分含量和蛋白质的容量因 子子k作图，发现蛋白质在图上有一突跃。即在某一区间内，作图，发现蛋白质在图上有一突跃。即在某一区间内，B液含量的一个较小的变化会引液含量的一个较小的变化会引 起起某个蛋白质容量因子很大的变化。在此区间内某个蛋白质容量因子很大的变化。在此区间内B液一个小的增大使液一个小的增大使k很快减小，使蛋白质很快减小，使蛋白质 从基本上不移动到很快洗脱下来。不
9、同蛋白质到达这突跃区时所需从基本上不移动到很快洗脱下来。不同蛋白质到达这突跃区时所需B液的浓度不同，液的浓度不同，从而可从而可 以得到分离。以得到分离。蛋白质的分离一般就需要用梯度洗脱，否则有些蛋白质已达到突跃会很快被洗蛋白质的分离一般就需要用梯度洗脱，否则有些蛋白质已达到突跃会很快被洗 脱下来，有些蛋白质脱下来，有些蛋白质还远离突跃区，实际上无法被洗脱。而有机小分子的反相色谱中未发现还远离突跃区，实际上无法被洗脱。而有机小分子的反相色谱中未发现 此种突跃现象。此种突跃现象。实际工作中实际工作中梯度洗脱时间约为梯度洗脱时间约为2060min，B液的变化速度约为每分钟液的变化速度约为每分钟5%1
10、5%。2022/10/87第7页，此课件共36页哦9.2.3 应用应用最大优点：分离度最高；最大优点：分离度最高；最大缺点：容易使蛋白质变性失活。最大缺点：容易使蛋白质变性失活。例子：人的胶例子：人的胶 原蛋白原蛋白I型型1和和2键的色谱分离键的色谱分离 图图 9-1人的胶原蛋人的胶原蛋白白I型型1和和2键的色谱分键的色谱分离离 2022/10/88第8页，此课件共36页哦9.3 9.3 疏水相互作用色谱疏水相互作用色谱疏水相互作用色谱疏水相互作用色谱 概念：用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体概念：用适度疏水性的配基作固定相，以盐水体 系作流动相，系作流动相，用疏水作用来分离生物大分子化合物
11、的液相色谱法，叫疏水用疏水作用来分离生物大分子化合物的液相色谱法，叫疏水相互作用色谱相互作用色谱(Hyd rophobic Interaction Chromatography,HIC)或疏水作用色谱。或疏水作用色谱。9.3.1 分离原理分离原理在在HIC中中：固定相表面有疏水性基团，（如：固定相表面有疏水性基团，（如-CH2，-CH3，-ph等）。而蛋白质分子是一个外部有一亲水层包围，内部有等）。而蛋白质分子是一个外部有一亲水层包围，内部有疏水核的具有四级结构的复杂体系。蛋白质表面亲水性很强，疏水核的具有四级结构的复杂体系。蛋白质表面亲水性很强，但也有一些疏水性的基团，同时团状的蛋白质还存在
12、疏水基但也有一些疏水性的基团，同时团状的蛋白质还存在疏水基团较多的团较多的裂隙裂隙。在不同的介质中裂隙的伸展和收缩程度不在不同的介质中裂隙的伸展和收缩程度不同，从而使疏水基团暴露的多少也同，从而使疏水基团暴露的多少也 不同不同。疏水色谱是利。疏水色谱是利用盐水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基用盐水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之间疏水作用力之间疏水作用力 的不同而达到分离的目的。的不同而达到分离的目的。2022/10/89第9页，此课件共36页哦配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗脱机理配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗脱机理 （即：（即：溶质在色谱
13、中的保留行为）：溶质在色谱中的保留行为）：用用“疏溶剂化理论疏溶剂化理论”：蛋白质与配基的结合是由于溶质分子有：蛋白质与配基的结合是由于溶质分子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐水溶液中，一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。溶质和疏水配两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。溶质和疏水配基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水中的面积的多少而基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水中的面积的多少而进行的。进行的。（即蛋白质在盐水体系中，有一倾向产生：避开水（即蛋白质在盐水体系中，有一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。相
14、而吸附在固定相上。生物物质界面自由能比水低，与表生物物质界面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力）面自由能低的固定相产生亲合力）在疏水作用色谱中，溶质的容量因在疏水作用色谱中，溶质的容量因 子子K与流动相盐浓度等因素的关系：与流动相盐浓度等因素的关系：讨论讨论可见：盐的摩尔浓度增可见：盐的摩尔浓度增大，蛋白质在大，蛋白质在HIC柱上柱上的保留长。的保留长。2022/10/810第10页，此课件共36页哦结论结论 疏水作用色谱中，蛋白质在固定相上的保留性质是四个可变因素疏水作用色谱中，蛋白质在固定相上的保留性质是四个可变因素综合作用的结果。这四个因综合作用的结果。这四个因 素是：样品分
15、子、填料、流动相组成及素是：样品分子、填料、流动相组成及性质和温度。性质和温度。2022/10/811第11页，此课件共36页哦9.3.2 填料填料由基质和键合在基质上的配基两部分组成。（基质配基）由基质和键合在基质上的配基两部分组成。（基质配基）基质：基质：有有“软软”、“硬硬”两类，它们必须有两类，它们必须有25100nm的内孔径或的内孔径或者有较大间隙的网者有较大间隙的网 状结构（孔径要大）。状结构（孔径要大）。软基质：软基质：交联琼脂糖凝胶，交联葡聚糖凝胶、高分子交联琼脂糖凝胶，交联葡聚糖凝胶、高分子 聚合物。聚合物。硬基质：硬基质：主要是大孔径硅胶。主要是大孔径硅胶。配基：配基：是一
16、些含氮和氧原子是一些含氮和氧原子 的中等疏水性基团；的中等疏水性基团；or是丁基、苯基这些疏水基团键合在一个亲水性表面。是丁基、苯基这些疏水基团键合在一个亲水性表面。9.3.3 色谱条件色谱条件 主要有：主要有：a.具有中等疏水性表面的填料；具有中等疏水性表面的填料；b.盐析性盐的水溶盐析性盐的水溶液为流液为流 动相；动相；c.紫外检测器检测，检测波长紫外检测器检测，检测波长220或或280nm，核酸在，核酸在260nm；d.流动相流动相pH值接近中性；值接近中性；e.由高盐浓度到低盐浓度的梯度洗脱，由高盐浓度到低盐浓度的梯度洗脱，梯度时间梯度时间2060min；f.常温或常温或4下操作。下操
17、作。2022/10/812第12页，此课件共36页哦1、流动相的组成、流动相的组成 有有A液和液和B液两种。液两种。A液液：疏水性浓盐水溶液，并含有缓冲液作用的盐以稳定：疏水性浓盐水溶液，并含有缓冲液作用的盐以稳定pH值。值。常用的常用的A液为液为1.03.0mol/L(NH4)2SO4加加0.010.05mol/L磷酸盐磷酸盐缓冲液；缓冲液；B液液：稀的缓冲液，浓度与：稀的缓冲液，浓度与A液中的缓冲作用的盐的浓度相等。液中的缓冲作用的盐的浓度相等。常用的常用的B液为液为0.010.05mol/L磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液。盐有两类。盐有两类。盐析性盐盐析性盐：使蛋白质的构象稳定，会促进蛋白质
18、自身间的：使蛋白质的构象稳定，会促进蛋白质自身间的 疏水作用而析出，疏水作用而析出，or促进蛋白质与配基之间的疏水作用而保留在促进蛋白质与配基之间的疏水作用而保留在柱上。不失活，溶解度减小。常用：柱上。不失活，溶解度减小。常用：(NH4)2SO4盐溶性盐盐溶性盐：提高蛋白质的水溶性，同时会使蛋白质变性。如硫：提高蛋白质的水溶性，同时会使蛋白质变性。如硫氰酸盐、盐酸胍等会。氰酸盐、盐酸胍等会。2022/10/813第13页，此课件共36页哦2、流动相的、流动相的pH值值 一般地一般地pH 48；常选常选 pH 7左右。左右。3、温度、温度 一般在常温或低于常温下操作。一般在常温或低于常温下操作。
19、HIC中蛋白质的保留对温度较敏感。中蛋白质的保留对温度较敏感。在在HIC体系中蛋白质处在活性状态，体系中蛋白质处在活性状态，T使蛋白质的团状结构伸展，使蛋白质的团状结构伸展，暴露出更多的疏水基团，疏水作用增强，保留暴露出更多的疏水基团，疏水作用增强，保留 值增大。值增大。（其他色谱，（其他色谱，T保留增大）保留增大）T传质加快，使保留减小。传质加快，使保留减小。（对所有色谱均适用）（对所有色谱均适用）总之，在疏水色谱中，总之，在疏水色谱中，比比大，大，T，保留增大。，保留增大。4、洗脱方式、洗脱方式梯度洗脱。（高浓度盐梯度洗脱。（高浓度盐低浓度盐）低浓度盐）2022/10/814第14页，此课
20、件共36页哦9.3.4 疏水作用色谱的应用疏水作用色谱的应用 只用于生物大分子的分离，不用于有机小分子分只用于生物大分子的分离，不用于有机小分子分离。离。优点：优点：首先首先是其色谱条件温和，蛋白质活性回是其色谱条件温和，蛋白质活性回 收收率高，一般都在率高，一般都在85%以上。以上。其次其次是不用有毒和昂贵是不用有毒和昂贵的有机溶剂。的有机溶剂。第三第三是分离性能好。是分离性能好。第四第四 含高浓度含高浓度盐的样品可以直接进疏水作用色谱柱进行分离。盐的样品可以直接进疏水作用色谱柱进行分离。第第五五对生物工程产品的粗品可直接上样，一次完成对生物工程产品的粗品可直接上样，一次完成蛋白质的初步分离
21、、脱盐和复性三个目的。蛋白质的初步分离、脱盐和复性三个目的。2022/10/815第15页，此课件共36页哦例如例如：基因重组人干扰素：基因重组人干扰素r r是一种是一种基因工程产品，其粗品是基因工程产品，其粗品是7mol/L盐酸胍溶液。干扰素盐酸胍溶液。干扰素在盐酸胍在盐酸胍 溶液中处于可逆性溶液中处于可逆性失活状态。因盐浓度太高无失活状态。因盐浓度太高无法直接上其他柱，除去盐酸法直接上其他柱，除去盐酸胍后干扰素又容易胍后干扰素又容易 析出来。析出来。若使用疏水作用色谱柱，将若使用疏水作用色谱柱，将此样品直接进样，既脱除了此样品直接进样，既脱除了盐酸胍，又达到盐酸胍，又达到 了复性的效了复性
22、的效果。而且一步分离后，干扰果。而且一步分离后，干扰素纯度可达到素纯度可达到90%。图图 9-2 IFN-r粗品的粗品的HIC分离分离2022/10/816第16页，此课件共36页哦疏水作用色谱与反相色谱的区别疏水作用色谱与反相色谱的区别相同：蛋白质与填料之间的保留是疏水力作用的结果。相同：蛋白质与填料之间的保留是疏水力作用的结果。区别：区别：填料不同填料不同（HIC，表面中等疏水性作为配基；，表面中等疏水性作为配基；RPC，表面是烷基，表面是烷基C48等疏水性强的为配基。）等疏水性强的为配基。）疏水力不同疏水力不同（HIC，疏水作用较弱；，疏水作用较弱；RPC，强）。，强）。两色谱中洗脱液主
23、要成分不同两色谱中洗脱液主要成分不同（正是上面的差异引起的）（正是上面的差异引起的）在在HIC中可以加入少量有机溶剂以增强流动相的洗脱能力；中可以加入少量有机溶剂以增强流动相的洗脱能力；在在RPC中加入盐来改变蛋白质的保留值中加入盐来改变蛋白质的保留值2022/10/817第17页，此课件共36页哦9.4 9.4 亲合色谱亲合色谱亲合色谱亲合色谱 (Affinity Chromatography)AC(Affinity Chromatography)AC9.4.1 亲合色谱的原理亲合色谱的原理AC是吸附色谱的一种。但溶质的保留是一种特异的有选择性的是吸附色谱的一种。但溶质的保留是一种特异的有选
24、择性的亲合力。填料只是有选择地对一种生物大分子或一类生物大分亲合力。填料只是有选择地对一种生物大分子或一类生物大分子有吸附，对其他物质无吸子有吸附，对其他物质无吸 附作用，洗脱时先被分离，分段洗附作用，洗脱时先被分离，分段洗脱或梯度洗脱再将生物大分子从填料上洗脱下来，从而达到分脱或梯度洗脱再将生物大分子从填料上洗脱下来，从而达到分离目的。离目的。亲合色谱填料：亲合色谱填料：是在基质上键合一个特殊的配基（配位体）制得。是在基质上键合一个特殊的配基（配位体）制得。例如例如 酶的底物、产酶的底物、产物、抑制剂、辅酶、变构效应物，抗物的抗原，激素的结合蛋白等都可以作为物、抑制剂、辅酶、变构效应物，抗物
25、的抗原，激素的结合蛋白等都可以作为 配位体用于分离对应的酶，抗体和激素。有些配体可以用于一类化合物的吸附分配位体用于分离对应的酶，抗体和激素。有些配体可以用于一类化合物的吸附分离。离。如如伴刀豆球蛋白可以特异地吸附糖蛋白；三嗪染料作配基也会对某些蛋白质伴刀豆球蛋白可以特异地吸附糖蛋白；三嗪染料作配基也会对某些蛋白质有选择性吸附。有选择性吸附。配体与分离对象的作用：配体与分离对象的作用：是一种特异的生物亲合力，是配体与被吸物之是一种特异的生物亲合力，是配体与被吸物之 间范德华力、间范德华力、疏水力、静电力和其他力的综合作用的结果。这种综合作用力是有选择性的，只对一疏水力、静电力和其他力的综合作用
26、的结果。这种综合作用力是有选择性的，只对一个或一类生物大分子起作用，对其他物质不起作用。故个或一类生物大分子起作用，对其他物质不起作用。故AC选择性很高。选择性很高。2022/10/818第18页，此课件共36页哦9.4.2 填料填料 （由基质、间隔臂和配体三部分组成）（由基质、间隔臂和配体三部分组成）AC填料的基质：填料的基质：分两类。一类为有机聚合物，用得最多的是多糖聚合物，分两类。一类为有机聚合物，用得最多的是多糖聚合物，如纤维素如纤维素 ，交联葡聚糖、交联琼脂糖等。还有聚丙烯酰胺也是一类常用的，交联葡聚糖、交联琼脂糖等。还有聚丙烯酰胺也是一类常用的基质。多糖基质表面羟基基质。多糖基质表
27、面羟基 密度大，易制得柱容大的填料，而且其表面羟基密度大，易制得柱容大的填料，而且其表面羟基对蛋白质无非特异性吸附。但这类基质机械对蛋白质无非特异性吸附。但这类基质机械 强度低，不耐高压。第二类基强度低，不耐高压。第二类基质是多孔玻璃和硅胶。这类基质机械强度高，但柱容较小，表面硅羟基的质是多孔玻璃和硅胶。这类基质机械强度高，但柱容较小，表面硅羟基的非特异性吸附难以完全克服。非特异性吸附难以完全克服。2022/10/819第19页，此课件共36页哦9.4.3 实验技术实验技术 1、装柱、装柱柱子有玻璃柱和不锈钢柱两种。软基质填料装在玻璃柱内，用于常压色谱。硅胶和多柱子有玻璃柱和不锈钢柱两种。软基
28、质填料装在玻璃柱内，用于常压色谱。硅胶和多孔玻璃基质填料可装在不锈钢柱内用在高效液相色谱上。孔玻璃基质填料可装在不锈钢柱内用在高效液相色谱上。玻璃柱采用普通的湿法装柱，溶剂应不损害配体的活体，一般用缓冲溶液作分散剂来装柱。玻璃柱采用普通的湿法装柱，溶剂应不损害配体的活体，一般用缓冲溶液作分散剂来装柱。不锈钢柱一般采用匀浆法装柱，但装柱压力要低一些。分散剂常用亲水的醇不锈钢柱一般采用匀浆法装柱，但装柱压力要低一些。分散剂常用亲水的醇类。类。2、洗脱方式、洗脱方式 AC最常用的洗脱方式是分段洗脱，还有脉冲洗脱和梯度洗脱。最常用的洗脱方式是分段洗脱，还有脉冲洗脱和梯度洗脱。分段洗脱的过程是：分段洗脱
29、的过程是：平衡柱子平衡柱子(平衡液平衡液)上样上样平衡液洗涤平衡液洗涤洗脱液洗下目标蛋白洗脱液洗下目标蛋白再生再生平衡平衡第二次上样第二次上样 脉冲洗脱是在平衡、上样、洗涤后，用一段少量的洗涤液让其象一条密集的脉冲带脉冲洗脱是在平衡、上样、洗涤后，用一段少量的洗涤液让其象一条密集的脉冲带流过柱子流过柱子 ，以洗下某个特定的蛋白。，以洗下某个特定的蛋白。2022/10/820第20页，此课件共36页哦3、流动相、流动相 （有平衡液和洗脱液两种）（有平衡液和洗脱液两种）平衡液：平衡液：起平衡柱子和上样后洗去不吸附的杂蛋白及其他杂质的起平衡柱子和上样后洗去不吸附的杂蛋白及其他杂质的作用。其成分是稀盐
30、缓冲溶液作用。其成分是稀盐缓冲溶液 。洗脱液：洗脱液：是使吸附在柱子上的蛋白质解吸的流动相。分：是使吸附在柱子上的蛋白质解吸的流动相。分：非特异性洗脱：非特异性洗脱：利用洗脱液的组成、浓度、利用洗脱液的组成、浓度、pH值和温度的改变值和温度的改变使蛋白质与配体作用减弱而洗脱下来。使蛋白质与配体作用减弱而洗脱下来。特异性洗脱：特异性洗脱：利用一种对目标蛋白质也有亲合作用的游离配体使利用一种对目标蛋白质也有亲合作用的游离配体使其与固定相上配体产生竞争作用把蛋白质拉下其与固定相上配体产生竞争作用把蛋白质拉下 来的洗脱。来的洗脱。4、共价亲合色谱、共价亲合色谱 一种特殊的一种特殊的AC。利用一种特殊的
31、配体，与待纯化的蛋白质形成。利用一种特殊的配体，与待纯化的蛋白质形成某种不太强的共价健，将蛋白质固定在柱子上，待洗去杂蛋白后，用适某种不太强的共价健，将蛋白质固定在柱子上，待洗去杂蛋白后，用适当的化学方法，将被固定的蛋白质重新释放出来。当的化学方法，将被固定的蛋白质重新释放出来。例如：例如：2022/10/821第21页，此课件共36页哦硫醇硫醇二硫化物交换色谱可以用来纯化许多含硫醇的蛋白质二硫化物交换色谱可以用来纯化许多含硫醇的蛋白质 将将谷胱甘肽谷胱甘肽N2HCH(COOH)CH2CH2CONHCN(CH2SH)CONHCH2COOH先键合到基质上得到先键合到基质上得到 (结构见右)。简写
32、为：。简写为：再与二吡啶基二硫化物再与二吡啶基二硫化物 反应得到填料反应得到填料 。含硫醇基的蛋白质可牢固地固定在定固定相上，必须用含硫醇基的洗脱含硫醇基的蛋白质可牢固地固定在定固定相上，必须用含硫醇基的洗脱液将其洗脱下来，柱子还得用二吡啶基二硫化物再生。液将其洗脱下来，柱子还得用二吡啶基二硫化物再生。2022/10/822第22页，此课件共36页哦5、其他色谱条件、其他色谱条件 上样体积上样体积流速流速温度温度蛋白质浓度的影响蛋白质浓度的影响6、柱子的再生与保护、柱子的再生与保护再生：再生：用洗脱液充分洗涤后即可再次进样用洗脱液充分洗涤后即可再次进样 。但是重复使用几次后对。但是重复使用几次
33、后对目标蛋白的吸附率常会降低。所以用目标蛋白的吸附率常会降低。所以用2mol/L KCl加加6 mol/L尿素洗涤。尿素洗涤。保护：保护：柱子平时应保存在柱子平时应保存在4。柱内充满稀缓冲溶液。为了防止细。柱内充满稀缓冲溶液。为了防止细菌，液体可含万分之二的叠氮化钠。菌，液体可含万分之二的叠氮化钠。2022/10/823第23页，此课件共36页哦9.4.4 应用应用亲合色谱应用于酶、蛋白质等生物大分子的分离纯化。亲合色谱应用于酶、蛋白质等生物大分子的分离纯化。例如：例如：淀粉酶的分离可以使硅胶淀粉酶的分离可以使硅胶为基质、淀粉为配体的亲合色谱柱为基质、淀粉为配体的亲合色谱柱来完成。以去离子水为
34、平衡液，以来完成。以去离子水为平衡液，以0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，pH7.0作洗脱液，从工业粗酶中纯化作洗脱液，从工业粗酶中纯化淀淀粉酶，活性回收率为粉酶，活性回收率为93.6%，纯化，纯化后的比活提高了后的比活提高了20倍。柱子寿命为倍。柱子寿命为600次以上。吸附容量次以上。吸附容量4.6mg/g填填料。料。色谱图见右图。色谱图见右图。图图9-3 淀粉酶的亲合色谱分离淀粉酶的亲合色谱分离 2022/10/824第24页，此课件共36页哦9.5 9.5 电泳分离技术电泳分离技术电泳分离技术电泳分离技术 电泳：电泳：带电粒子在电场作用下向着与其自身所带的电荷相带电粒子在
35、电场作用下向着与其自身所带的电荷相反的电极的移动。反的电极的移动。电泳技术电泳技术：样品以一支持物为载体，在一定的电解质溶液中，：样品以一支持物为载体，在一定的电解质溶液中，各组分在电场的作用下，以不同的速度进行迁移，从而得各组分在电场的作用下，以不同的速度进行迁移，从而得到分离。到分离。电泳技术分类电泳技术分类：按支持物的不同，分为：凝胶电泳、纸上电泳和薄膜电按支持物的不同，分为：凝胶电泳、纸上电泳和薄膜电泳等。泳等。按操作原理分为：一般电泳、等速电泳、等电聚焦电泳和免疫按操作原理分为：一般电泳、等速电泳、等电聚焦电泳和免疫电泳电泳 等。等。对分离物的要求对分离物的要求：在介质中必须带电。：
36、在介质中必须带电。2022/10/825第25页，此课件共36页哦9.5.1 凝胶电泳（主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳（主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳 ）1、原理：不同带电粒子在同一外加电场作用下泳动的速度是不、原理：不同带电粒子在同一外加电场作用下泳动的速度是不同的，泳动度取决于带电颗粒的性质，颗粒所带净电荷越多、同的，泳动度取决于带电颗粒的性质，颗粒所带净电荷越多、直径越小，越接近球形、泳动速度越大。直径越小，越接近球形、泳动速度越大。此外，还与介质此外，还与介质PH值值（蛋白质为两性电解质，有一等电点，在不同（蛋白质为两性电解质，有一等电点，在不同pH值下所带净电值下所带净电荷的符号及数
37、量均不同，荷的符号及数量均不同，在电场中的泳动速率也就不同了。在电场中的泳动速率也就不同了。）、电场强度、电场强度（电场强度越高，粒子泳动速度越快。（电场强度越高，粒子泳动速度越快。）、离子强度、离子强度（介质离子强度越大，粒子的泳动越慢。一般在介质离子强度越大，粒子的泳动越慢。一般在0.02 0.2之间。）之间。）、电渗等实验条件有关。、电渗等实验条件有关。2、凝胶的化学结构、凝胶的化学结构 由丙烯酰胺单体聚合成长链，长链之间用由丙烯酰胺单体聚合成长链，长链之间用N,N-甲叉双丙烯酰胺交甲叉双丙烯酰胺交联成多孔状结构。孔的大小可以用双丙烯酰胺的浓度来调节。浓度增联成多孔状结构。孔的大小可以用
38、双丙烯酰胺的浓度来调节。浓度增大，网状结构的空隙（孔径）减小。大，网状结构的空隙（孔径）减小。2022/10/826第26页，此课件共36页哦形形成成凝凝胶胶的的反反应应式式3、丙烯酰胺凝胶电泳的优点、丙烯酰胺凝胶电泳的优点 具有很高的分辨率。大小不同的分子在通过网状结构的凝胶的空隙泳动具有很高的分辨率。大小不同的分子在通过网状结构的凝胶的空隙泳动时受到的阻力不同，大分子物质受到的阻力比小分子的大。这样就使聚丙时受到的阻力不同，大分子物质受到的阻力比小分子的大。这样就使聚丙烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重功能，提高了分辨力。烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重功能，提高了分辨力。凝胶空隙的
39、大小可以人为地调节，以适应不同分子量的样品。凝胶空隙的大小可以人为地调节，以适应不同分子量的样品。聚丙烯酰胺凝胶电泳中电渗现象很小。聚丙烯酰胺凝胶电泳中电渗现象很小。凝胶机械强度较好，弹性大，易保存。凝胶机械强度较好，弹性大，易保存。丙烯酰胺可以提得很纯，不会污染样品。丙烯酰胺可以提得很纯，不会污染样品。2022/10/827第27页，此课件共36页哦4、连续与不连续平板凝胶电泳、连续与不连续平板凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的是平板电泳仪。装置见下图聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的是平板电泳仪。装置见下图 凝胶电泳分为：连续和不连续两类。凝胶电泳分为：连续和不连续两类。连续电泳：是指整个电泳系统所
40、用的缓冲液、连续电泳：是指整个电泳系统所用的缓冲液、pH值和凝胶组成值和凝胶组成都相同。都相同。不连续电泳：是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲不连续电泳：是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、液、pH值和凝胶。值和凝胶。优点：稀的蛋白质样品在电泳过程中被浓缩，提高了优点：稀的蛋白质样品在电泳过程中被浓缩，提高了分辨力。分辨力。图图9-4 连续连续(a)与与不连续不连续(b)平板凝胶平板凝胶电泳示意电泳示意图图2022/10/828第28页，此课件共36页哦5、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：原理：SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是一个在缓冲不连续聚丙烯酰胺凝胶电
41、泳是一个在缓冲液中加有液中加有SDS，并且样品事先用含，并且样品事先用含SDS的溶液作解离处理的溶液作解离处理的电泳体系。当蛋白质在过量的的电泳体系。当蛋白质在过量的SDS溶液中加热时，天然溶液中加热时，天然蛋白质的球形状态就变成线形。变性后的蛋白质，几乎是蛋白质的球形状态就变成线形。变性后的蛋白质，几乎是定量地定量地 1克蛋白质结合克蛋白质结合1.4g SDS，使蛋白质的亚基多，使蛋白质的亚基多肽带上了大量的负电荷，也就是说多肽的肽带上了大量的负电荷，也就是说多肽的SDS复合物复合物上单位量上的电荷相等，即电荷密度相等。在电场中上单位量上的电荷相等，即电荷密度相等。在电场中这种电荷密度相等的
42、粒子严格按照其分子的大小具有这种电荷密度相等的粒子严格按照其分子的大小具有不同的流动度。样品按多肽分子量的大小分离，研究不同的流动度。样品按多肽分子量的大小分离，研究人员可以用已知分子量的样品作对照测定未知物的肽人员可以用已知分子量的样品作对照测定未知物的肽链大小。链大小。2022/10/829第29页，此课件共36页哦 6、凝胶电泳的应用、凝胶电泳的应用 广泛用于分离蛋白质、酶和核酸等生物大分子及其他带电的有机物。广泛用于分离蛋白质、酶和核酸等生物大分子及其他带电的有机物。生物大分子的分离及分子量测定生物大分子的分离及分子量测定样品组分在电泳中按照其带电情况和分子大小不同而有不同样品组分在电
43、泳中按照其带电情况和分子大小不同而有不同的迁移率，在胶板上得到分离。的迁移率，在胶板上得到分离。在在 SDS不连续凝胶电泳中，样品组分按分子量大小排列，分不连续凝胶电泳中，样品组分按分子量大小排列，分子量的对数与迁移率之间有一个线性关系。因此在电泳时加子量的对数与迁移率之间有一个线性关系。因此在电泳时加入标准分子量的蛋白质标准样，可以测定未知样的分子量。入标准分子量的蛋白质标准样，可以测定未知样的分子量。样品组分的回收样品组分的回收凝胶电泳可以作凝胶电泳可以作g级样品的分离制备。回收样品组分的方法级样品的分离制备。回收样品组分的方法有：扩散洗脱和电泳洗脱有：扩散洗脱和电泳洗脱 。2022/10
44、/830第30页，此课件共36页哦9.5.2 聚焦电泳（又叫等电点聚焦聚焦电泳（又叫等电点聚焦 ）用于分离具有不同等电点的物质。用于分离具有不同等电点的物质。不同蛋白质有不同的等电点。当蛋白质或多肽放在一个通直流电而产不同蛋白质有不同的等电点。当蛋白质或多肽放在一个通直流电而产生的一个生的一个pH梯度的体系中时，不同的蛋白质在电场作用下会向不同梯度的体系中时，不同的蛋白质在电场作用下会向不同的方向移动，并聚焦的方向移动，并聚焦 在相应于其等电点的在相应于其等电点的pH位置处，即为等电聚位置处，即为等电聚焦，或叫聚焦电泳。焦，或叫聚焦电泳。2022/10/831第31页，此课件共36页哦等电聚焦
45、的特点是：等电聚焦的特点是：分辨率高。可以将等电点相差分辨率高。可以将等电点相差0.010.02pH单位的蛋白质分离开。单位的蛋白质分离开。不管蛋白质样品加在什么部位，由聚焦作用使其总是聚焦到等不管蛋白质样品加在什么部位，由聚焦作用使其总是聚焦到等电点处，所以很稀的样品也可电点处，所以很稀的样品也可 以进行分离。这一点是其优于以进行分离。这一点是其优于一般电泳和色谱的地方。一般电泳和色谱的地方。分离是依据等电点不同而进行的，所以重现性很好。分离是依据等电点不同而进行的，所以重现性很好。用于蛋白质及多肽的分析及等电点的测定，也可以用于分离和制备。用于蛋白质及多肽的分析及等电点的测定，也可以用于分
46、离和制备。一般电泳中随着时间加长和泳动距离的加大，物质区带因扩散一般电泳中随着时间加长和泳动距离的加大，物质区带因扩散作用而加宽。等电聚焦中不存作用而加宽。等电聚焦中不存 在这个问题。在这个问题。缺点：缺点：样品溶液要求无盐。样品溶液要求无盐。样品组分分别聚焦在其等电点处，所以对于一些在其等电样品组分分别聚焦在其等电点处，所以对于一些在其等电点处不溶或变性的蛋白质此方法不适用。点处不溶或变性的蛋白质此方法不适用。2022/10/832第32页，此课件共36页哦1、原理、原理在有两性载体的溶液中，通稳定的直流电时，两性载体会形成在有两性载体的溶液中，通稳定的直流电时，两性载体会形成一个由阳极到阴
47、极逐渐增加的一个由阳极到阴极逐渐增加的 pHpH梯度。梯度。阳极端两性载体得到质子带正电，阴极端会失去质子带负电，带电粒阳极端两性载体得到质子带正电，阴极端会失去质子带负电，带电粒子在电场作用下向带相反电荷的电极方向移动。子在电场作用下向带相反电荷的电极方向移动。若一个等电点低的载体若一个等电点低的载体A A由阴极移向阳极时，会逐步失去负电荷由阴极移向阳极时，会逐步失去负电荷而停止运动，所在位置即为其等电点。若另一个等电点比而停止运动，所在位置即为其等电点。若另一个等电点比A A稍高稍高的物质的物质B B向阳极移动时，在靠近向阳极移动时，在靠近A A而不到而不到A A的位置处即会停止运的位置处
48、即会停止运动，这处即为动，这处即为B B的等电点。的等电点。B B的等电点应在的等电点应在A A物靠阴极一侧。物靠阴极一侧。在这样一个稳定的在这样一个稳定的pHpH梯度场中加入蛋白质样品，它们会按表面电荷状梯度场中加入蛋白质样品，它们会按表面电荷状况在电场中移动而最后停止在其表面电荷为零的地方，此处的况在电场中移动而最后停止在其表面电荷为零的地方，此处的pHpH值即值即为该蛋白质的等电点。为该蛋白质的等电点。2022/10/833第33页，此课件共36页哦2、两性载体、两性载体 为分子量为分子量30030010001000的两性电解质，等电点在的两性电解质，等电点在2.52.51111之间，具
49、有良好导电性能的水溶液。之间，具有良好导电性能的水溶液。两性载体具备性质：在等电点处必须有足够的缓冲能两性载体具备性质：在等电点处必须有足够的缓冲能力，以控制体系的力，以控制体系的pHpH梯度不受样品组分的影响；在等电梯度不受样品组分的影响；在等电点处有足够的电导；不会与被分离的物质起反应；容易与点处有足够的电导；不会与被分离的物质起反应；容易与被分离物分开。被分离物分开。成分：在成分：在7070水溶液中不饱和的丙烯酸与多乙烯多胺水溶液中不饱和的丙烯酸与多乙烯多胺的加成产物。产物是一系列的加成产物。产物是一系列 PIPI不同的脂肪族多氨基多不同的脂肪族多氨基多羧基类化合物的混合。羧基类化合物的
50、混合。2022/10/834第34页，此课件共36页哦3 等电聚焦等电聚焦 操作中必须有：稳定的操作中必须有：稳定的pH梯度梯度采用方法：密度梯度采用方法：密度梯度 仪器：是由等电聚焦柱、电源、梯度混合器、微量泵、流动测定光度计、仪器：是由等电聚焦柱、电源、梯度混合器、微量泵、流动测定光度计、记录仪、记录仪、分部收集器和酸度计等组成。分部收集器和酸度计等组成。密度梯度：密度梯度：（为了防止液体对流破坏（为了防止液体对流破坏pH梯度，避免分离物质的混合）梯度，避免分离物质的混合）由重溶液和轻溶液使用梯度混合的方法形成。由重溶液和轻溶液使用梯度混合的方法形成。（对重溶液和轻（对重溶液和轻溶液要求：