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1、第三节多肽和蛋白质类药第三节多肽和蛋白质类药物的生产物的生产第1页，此课件共53页哦主要内容主要内容l干扰素概述l基因工程假单胞杆菌的构建与保藏l干扰素的发酵工艺过程l干扰素的分离纯化工艺过程第2页，此课件共53页哦第3页，此课件共53页哦第4页，此课件共53页哦1.干扰素概述干扰素概述l干扰素的种类l干扰素的理化性质l干扰素的生物学活性l干扰素的临床应用l干扰素的生产工艺路线第5页，此课件共53页哦1.1 干扰素的种类干扰素的种类l概念：（interferon，IFN）干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名称
2、为Interferon，简称IFN。l发现：干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。第6页，此课件共53页哦天然干扰素分类天然干扰素分类1.根据来源、基因序列和氨基酸组成分类根据来源、基因序列和氨基酸组成分类I 型干扰素：型干扰素：IFN、IFN、IFN、IF
3、N 来源来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节免疫调节(较弱）较弱）其中IFN-为多基因产物，有23种以上的亚型。II 型干扰素：干扰素型干扰素：干扰素（IFN)来源来源：活化的：活化的T细胞和细胞和NK细胞产生细胞产生 功能功能：免疫调节：免疫调节l 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力l 增强增强Tc细胞和细胞和NK细胞的杀伤活性细胞的杀伤活性l 抑制抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答细胞形成，下调体液免疫应答l 趋化作用趋
4、化作用l 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）抗病毒和抗肿瘤作用（次要）2.根据动物来源确定分类，例如人干扰素（根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFNHuIFN），小鼠干扰素（），小鼠干扰素（MuIFNMuIFN）。第7页，此课件共53页哦l上市重组干扰素:2a、2b、1b、1b，1992年我国第一个基因工程药物IFN-1b获得国家一类新药证书。l研发中的重组干扰素：IFN，临床阶段第8页，此课件共53页哦1.2干扰素的理化性质干扰素的理化性质143-166aa；MW:18-40ku；pI:6.5-7.5；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纤维膜、琼脂和塑料等介质。第9页，此课件共53页哦型
5、干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但这种效应不是直接的，而是通过对宿主细胞的作用引起的。对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体，核内有“抗病毒蛋白”基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻译，并促进病毒mRNA降解。干扰素能提高细胞表面MHC类分子的表达水平，受到病毒感染的细胞表面MHC类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解。干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。1.3干扰素的生物学活性干扰素的生物学活性正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素的作用下才能诱使细胞产生干扰素。1.3.1广谱抗病
6、毒活性机制广谱抗病毒活性机制第10页，此课件共53页哦病毒复制病毒复制抑制病抑制病 毒复制毒复制信号转导信号转导IFN-a aIFN-诱导蛋白诱导蛋白诱导刺激诱导刺激胞核胞核 胞核胞核 第11页，此课件共53页哦抗肿瘤作用机制型干扰素能抑制细胞的型干扰素能抑制细胞的DNADNA合成，减慢细胞合成，减慢细胞 的有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择的有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择 性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强 50050010001000倍。另外，倍。另外，型干扰素也可通过增型干扰素也可通过增 强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其强
7、机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其 抗肿瘤效应。抗肿瘤效应。第12页，此课件共53页哦免疫调节活性机制免疫调节活性机制免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。l对巨噬细胞的作用：IFN可使巨噬细胞表面MHC类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。l对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致
8、敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFN对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFN能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFN不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。l对其它细胞的作用：IFN对其他细胞也有广泛影响：刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；活化NK细胞，增强其细胞毒作用；使某些正常不表达MHC类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHC类分子，发挥抗原递呈作用；使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分
9、化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。第13页，此课件共53页哦1.4 重组干扰素的临床应用重组干扰素的临床应用l广谱抗病毒活性（rhuIFN）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。l直接抗肿瘤活性（rhuIFN）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。l免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN）l多发性硬化症rhuIFN第14页，此课件共53页哦1.5.干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（1）体外诱生干扰素制备工艺体外诱生干扰素制备工艺：lSendai病毒诱导人白细胞l1989年：IFN-n3/Alferon，批准上市l产量低：1gIFN，需要3亿ml人血白细胞
10、l来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵l潜在的血源性病毒污染的可能性第15页，此课件共53页哦干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线（2）人源转化细胞系培养生产工艺：人源转化细胞系培养生产工艺：l1999年：IFN-n1/Wellferon,批准用于临床。l优点：首次实现大规模商业化生产。l缺点：活性低，退出临床应用。第16页，此课件共53页哦干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线（3）上市产品：重组人干扰素rhuIFN1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；20012002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys
11、表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:第17页，此课件共53页哦干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线（4）l上市产品：rhuIFN-1al1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)l表达产物：166aa糖基化蛋白，22.5kul工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格动物无限细胞系培养生产工艺：动物无限细胞系培养生产工艺：第18页，此课件共53页哦干扰素生产工艺路线（干扰素生产工艺路线（5）宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonasputida）上市
12、产品：IFN-2b/安福隆表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性工艺特点：发酵周期短：几个小时无需变性、复性过程，获得有活性产品纯化过程：淘汰抗体亲和层析基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺第19页，此课件共53页哦2.基因工程假单胞杆菌的构建与保藏基因工程假单胞杆菌的构建与保藏l基因工程假单胞杆菌菌种建立l基因工程假单胞杆菌菌种特性l菌种库的建立与保藏第20页，此课件共53页哦2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立、基因工程假单胞杆菌菌种建立l第一步：干扰素-2b基因的克隆l第二步：表达载体的构建l第三步：工程菌的构建第21页，此课件共53页哦第一步：
13、干扰素基因的克隆第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)l制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，l基因连接质粒,转化E.coli,筛选鉴定克隆。l测序：编码人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。第22页，此课件共53页哦第二步：表达载体构建IFN基因与表达载体连接转化大肠杆菌筛选阳性克隆获得序列正确表达载体第23页，此课件共53页哦第三步：工程菌构建第三步：工程菌构建l转化假单胞杆l筛选高表达、稳定遗传的工程菌l获得原始菌种第24页，此课件共53页哦2.2基因工程菌的特性基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征：细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。菌落：
14、直径2.5-3.0mm，灰绿色半透明状,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR（3）具有生产干扰素能力：放射性免疫学效价不低于2.0109IU/L。第25页，此课件共53页哦2.3 菌种库的建立与保藏菌种库的建立与保藏QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性菌种检查合格后，方可投产。第26页，此课件共53页哦3.干扰素-2b的发酵工艺过程第27页，此课件共53页哦3.1摇瓶培养摇瓶培养l取保存工作种子批菌种，室温融化l摇瓶培养：30，pH7.0，250r/min，182hl检测：OD值和发酵液杂菌检查。第28页，此课件共53页哦
15、3.2 种子罐培养种子罐培养p接种：接入50L种子罐，接种量10%。p培养：30，pH7.0。p控制：级联调节通气量和搅拌转速DO为30%，34h，OD4.0。p检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。第29页，此课件共53页哦3.3 发酵罐培养发酵罐培养l接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。l控制：级联调节通气量和搅拌转速。l前4h：30，pH7.0，DO为30%。l4h后：20，pH6.0，DO为60%，56.5h。l终点控制：OD值达9.01.0，5冷却水快速降温至15以下。l检测：发酵液杂菌检查第30页，此课件共53页哦3.4菌体收集菌体收集l连续流离心机：冷却的发酵液
16、，16000r/min离心收集。l菌体保存：20冰柜，不超过12个月。l检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。第31页，此课件共53页哦4干扰素的分离纯化工艺过程干扰素的分离纯化工艺过程 4.1、干扰素分离工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程第32页，此课件共53页哦4.1 干扰素干扰素-2b分离工艺过程分离工艺过程l菌体裂解l预处理l初级分离第33页，此课件共53页哦(1)菌体裂解菌体裂解l裂解缓冲液：纯化水配制，210（pH7.5）l使用保护剂：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）。l破碎20菌体：2厘米以下的碎块l搅拌：加裂解缓冲液，210，2hrl冻
17、融:细胞完全破裂，释放干扰素。第34页，此课件共53页哦(2)预处理预处理-沉淀沉淀l加絮凝剂聚乙烯亚胺:210，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。l加凝聚剂醋酸钙溶液:210,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。第35页，此课件共53页哦(3)离心离心l连续流离心机：210，16000r/minl收集上清液：含有重组干扰素蛋白质l杂质沉淀：121、30min蒸汽灭菌,焚烧处理。第36页，此课件共53页哦（4）初级分离）初级分离l盐析:4M硫酸铵，210，搅匀,静置过夜。l离心：连续流离心机，16000r/minl保存：收集沉淀，粗干扰素，4保存。第37页，此课件共53页哦4.2、
18、干扰素纯化工艺过程、干扰素纯化工艺过程l溶解粗干扰素l沉淀与疏水层析l阴离子交换层析与浓缩l阳离子交换层析与浓缩l凝胶过滤层析l无菌过滤分装第38页，此课件共53页哦(1)溶解粗干扰素溶解粗干扰素l配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45m滤器和10ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至210。l检查:缓冲液的pH值和电导值。l溶解：210，匀浆，完全溶解。第39页，此课件共53页哦(2)沉淀与疏水层析沉淀与疏水层析l等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。l疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中除非疏水性蛋白l洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）
19、。第40页，此课件共53页哦l等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40ms/cm，210，静置过夜l超滤：1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。l透析除盐：调整溶液pH8.0，电导值，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。第41页，此课件共53页哦(3)阴离子交换层析与浓缩阴离子交换层析与浓缩l0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。l盐浓度线性梯度550ms/cm进行洗脱，l配合SDS-PAGE收集干扰素峰。l浓缩：调整溶液和电导，10ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。第42页，此课件共53页哦（4)阳离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩l用0.1M醋酸缓冲
20、液（pH5.0）平衡树脂。l上样，相同缓冲液冲洗。l盐浓度线性梯度550ms/cm进行洗脱l配合SDS-PAGE收集干扰素峰。l浓缩：10ku超滤膜进行。第43页，此课件共53页哦(5)凝胶过滤层析凝胶过滤层析l洗涤液：0.15MNaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂l上样，相同缓冲液进行洗脱。l合并干扰素部分第44页，此课件共53页哦(6)无菌过滤分装无菌过滤分装l0.22m滤膜过滤干扰素溶液l分装l20以下的冰箱中保存。第45页，此课件共53页哦(7)检测项目检测项目l干扰素鉴别试验l干扰素效价测定l蛋白质含量，纯度测定，分子量l宿主残余蛋白、残余DNAl干扰素结构鉴定
21、：紫外光谱，肽谱，N端序列l其他：热原，内毒素，残留抗生素第46页，此课件共53页哦发酵法生产白细胞介素第47页，此课件共53页哦l白细胞介素的结构与功能白细胞介素的结构与功能l Interleukin，简称，简称IL。l 目前批准上市的有目前批准上市的有IL-2、IL-6、IL-12等。等。第48页，此课件共53页哦lIL-2分子量为的糖蛋白，它刺激分子量为的糖蛋白，它刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的细胞增已被特异性抗原或致丝裂因数启动的细胞增殖。重组白介素可用于临床研究。主要用殖。重组白介素可用于临床研究。主要用于于肾癌肾癌、黑色素瘤黑色素瘤和和非何杰金淋巴瘤非何杰金淋巴瘤有效（有效（
22、）。细胞代表个）。细胞代表个有单核巨噬细胞，和淋巴细胞特征的异原有单核巨噬细胞，和淋巴细胞特征的异原的细胞体。这些细胞似乎对癌细胞有特的细胞体。这些细胞似乎对癌细胞有特异作用。此外，细胞（不象细胞）介异作用。此外，细胞（不象细胞）介导杀伤不受的约束。导杀伤不受的约束。第49页，此课件共53页哦生产工艺1 工艺流程图工艺流程图IL-2工程菌工程菌斜面斜面摇瓶摇瓶发发酵酵制备包涵体制备包涵体洗涤与裂解洗涤与裂解凝胶过滤与复凝胶过滤与复性性检定与包装检定与包装第50页，此课件共53页哦l2生产过程及工艺过程生产过程及工艺过程l(1)发酵发酵l 工程菌为大肠杆菌，温度敏感型。工程菌为大肠杆菌，温度敏感
23、型。l 种子用种子用LB培养基；培养基；l 发酵用发酵用M9CA培养基，培养基，30度度10小时，后提高小时，后提高温度至温度至42度，诱导度，诱导3h。第51页，此课件共53页哦l(2)分离纯化分离纯化l包涵体制备包涵体制备l 离心收集，菌体悬于离心收集，菌体悬于EDTA溶液中，用超溶液中，用超声波破碎细胞，后声波破碎细胞，后8000r/min离心，收集沉淀离心，收集沉淀(包涵体和细胞碎片包涵体和细胞碎片)。第52页，此课件共53页哦l包涵体洗涤及裂解：包涵体洗涤及裂解：l l 用用Tris-HCl洗涤洗涤3次，离心收集沉淀，用盐酸次，离心收集沉淀，用盐酸胍变性，离心收集上清液。胍变性，离心收集上清液。第53页，此课件共53页哦