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1、关于染色体免疫共沉淀第一页，讲稿共十七页哦前言前言 基因表达是一个十分复杂而有序的过程，它是众多的反式因子和顺式作用元件之间相互作用的结果。与原核生物不同，真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。第二页，讲稿共十七页哦常用的研究蛋白质与常用的研究蛋白质与DNADNA相互作用的方法相互作用的方法1.凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）2.DNase足迹法（foot printingfoot printing）3.染色质免疫沉淀实验(CHIP)第三页，讲稿共十七页哦凝胶电泳迁移率改变分析凝胶电泳迁移率改变分析 （EM
2、SAEMSA）在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快，因此，可标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合，其向阳极移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射性自显影，就可找到DNA结合蛋白。由于其特异性好，DNA迁移率变动试验常用来鉴定其他方法筛选出的结果 第四页，讲稿共十七页哦DNaseDNase足迹法（足迹法（foot printingfoot printing）蛋白结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相
3、应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。第五页，讲稿共十七页哦 凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）与DNase足迹法均为研究体外DNA与蛋白质相互作用的方法，但不能直接对体内的DNA与蛋白质相互作用进行研究。而CHIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。第六页，讲稿共十七页哦 同时，由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，胶电泳迁移率改变分析（EMSA）获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。第七页，讲稿共十七页哦 染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合
4、的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。第八页，讲稿共十七页哦CHIPCHIP原理原理 在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。第九页，讲稿共十七页哦第十页，讲稿共十七页哦操作步骤操作步骤 其操作步骤可大致分为固定、沉淀和检测三步 第一步：固定，即在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质DNA复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。第十一页，讲稿共十
5、七页哦 第二步：免疫沉淀，即利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段。第十二页，讲稿共十七页哦 第三步：目的片段的纯化与检测，即经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.第十三页，讲稿共十七页哦条件选择条件选择1、超声波破碎条件的选择2、抗体量的选择3、PCR反应条件的选择第十四页，讲稿共十七页哦应用应用1、组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”2、转录调控分析3、药物开发研究4、有丝分裂研究5、DNA损失与凋亡分析 第十五页，讲稿共十七页哦扩展应用 CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围:1、CHIP 与基因芯片相结合所建立的CHIP-on-CHIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；2、CHIP 与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点;3、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用.第十六页，讲稿共十七页哦感谢大家观看第十七页，讲稿共十七页哦