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1、反义的原理及其应用第1页，本讲稿共16页反义RNA反义RNAA(a n t i s e n s e R N A）：一种本身缺乏编 码能力，但能与特异靶 R N A(主要是mR N A)互补的 R NA分子，它可通过配对碱基间氢键作用与靶 R N A的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶 RNA的功能，从而调控基因的正常表达。第2页，本讲稿共16页基本原理反义 R N A技术的基本原理：利用自然存在的或人工合 成的反义 RNA，通过基因重组技术反向插入到合适 的表达载体形成重组DN A，然后转染受体细胞，则 这一反插入的序列就会随细胞周期产生大量反义 R NA，对基因的表达进行调控，从而抑制、
2、封闭或破坏靶基因的表达。第3页，本讲稿共16页一、复制水平DNADNA复制复制 中的作用中的作用 反义反义 R N AR N A作为作为D N AD N A复制的抑制因子，复制的抑制因子，与引物与引物 R N R N A A结合或作用于引物前体而抑制结合或作用于引物前体而抑制 D N AD N A复制，从复制，从 而降而降低低D N AD N A的复制效率。的复制效率。E E c o l i c o l i 的的 c o l e 1 c o l e 1 质粒复质粒复 制制的前提是合成适当的的前提是合成适当的R N A(R N AR N A(R N A)，它自动折叠它自动折叠 后与后与 D N
3、AD N A模板结合形成模板结合形成 D N AD N A复制的引物，复制的引物，从复制起从复制起始点上游一始点上游一4 4 5 b p 4 4 5 b p 处开始，处开始，以另一以另一 D N AD N A为模板反为模板反 向转录的向转录的RN A IRN A I正好与正好与 RNA1 IRNA1 I的结合，的结合，阻止了正阻止了正 常常引物的产生，引物的产生，从而干扰复制的进行。从而干扰复制的进行。第4页，本讲稿共16页作用机制反义 R N A的作用机制主要表现在D N A复制、转录 和翻译 3个水平上。第5页，本讲稿共16页二、转录水平转录及转录后水平的作用转录及转录后水平的作用 反义反
4、义 R NAR NA与与 m RNA 5 m RNA 5 末端互补结合，末端互补结合，阻断帽阻断帽 子结子结构形成；构形成；作用于外显子和内含子的连接区，作用于外显子和内含子的连接区，阻碍前阻碍前 m R m R N AN A剪接；剪接；作用于作用于 p o l y Ap o l y A形成位点，形成位点，阻碍阻碍 mRN AmRN A的的成熟及其向胞浆转运。在成熟及其向胞浆转运。在 c r p c r p 基因的基因的t i c R NA(t r a n t i c R NA(t r a n s c r i p t i o n i n h i b i t o r y c omp l e me
5、 n t a r y s c r i p t i o n i n h i b i t o r y c omp l e me n t a r y RNA)RNA)负负 向向 自我调控中，自我调控中，t i c R N At i c R N A与与 e r p m R N Ae r p m R N A的的 5 5 端结合，端结合，形形 成类似于成类似于R N AR N A聚合酶识别的转录聚合酶识别的转录终止信号的二级终止信号的二级 结构，结构，以反式作用对转录过程本身以反式作用对转录过程本身进行调控进行调控 J J第6页，本讲稿共16页三、翻译水平翻译水平的作用翻译水平的作用 反义反义 R NAR
6、 NA可直接与可直接与 m R N Am R N A的的 S DS D序列序列(含含 R B S)R B S)或编码或编码区区(主要是主要是 A U G)A U G)结合，结合，从空间上直接从空间上直接 阻止核糖体的正常阻止核糖体的正常结合或可直接降解靶结合或可直接降解靶 mR N AmR N A。反义反义R N AR N A与与 m R N Am R N A在在 S S D D序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成 R N AR N AR N AR N A双链结构，从而调控翻译的进行。在真核生物细胞中双链结构，从而调控翻译的进行。在真核生物细胞中
7、有许多有许多 R N AR N A在翻译水平上表现反义在翻译水平上表现反义R N AR N A的功能。如鸡胚的功能。如鸡胚 胎肌浆中存在的富含胎肌浆中存在的富含 U U的小分子的小分子 R N AR N A称为称为 t c RNAt c RNA，它们它们可以与肌球蛋白重链的可以与肌球蛋白重链的 RN ARN A的的 p o l y Ap o l y A尾杂交而抑制正常尾杂交而抑制正常的翻译过程。的翻译过程。A u d r e yA u d r e y等等 J J 的研究表明的研究表明 F GFAS R NAF GFAS R NA在在翻译过程能有效地抑制翻译过程能有效地抑制F GFF GF一一2
8、 2在哺乳动物细胞中的表达。在哺乳动物细胞中的表达。第7页，本讲稿共16页反义 RNA的重组 DNA中只有启动子及终止子，当转染细胞后，重组 D N A能 自动表达反义R N A，并且重组 D NA自身可以整合到宿主的基因组 D NA中，或作为“附加体”长期存在。在原核细胞中，反义 R N A以针对 S D序列效果最好，而在真核细胞中以5 端非编码区为标靶最有效。第8页，本讲稿共16页反义RNA的应用随着基因组草图的完成,人们研究的重点已转向对基因功能的研究,反义核酸技术无疑为这项宏伟的工程提供了一种有力的工具。第9页，本讲稿共16页抗病毒作用病毒是病毒是 对人对人 和动植和动植 物危物危 害
9、极大害极大 的病原体的病原体 ,然而对病毒引然而对病毒引起起 的疾病的治疗的疾病的治疗 ,目前目前 尚无特效药物与方法。反义尚无特效药物与方法。反义 R N R N A A 却能特异性阻断病毒基因表达却能特异性阻断病毒基因表达 和抑制病毒的复制和抑制病毒的复制 ,从而激起许多科学工作者去探索反义从而激起许多科学工作者去探索反义 R N A R N A 治疗病毒性疾治疗病毒性疾病的有效方法。抗病毒反义病的有效方法。抗病毒反义 R N A R N A 技术是将特定的病毒技术是将特定的病毒基因反基因反 向插人到表达险载体中向插人到表达险载体中,以构建反义以构建反义 R N A R N A 表达表达载
10、体载体 ,再将重组体导人真核细胞再将重组体导人真核细胞(病毒宿主细胞病毒宿主细胞)中表达特异中表达特异性反义性反义 R N A,R N A,从而抑制特异有从而抑制特异有 害基害基 因的表达或抑制病毒因的表达或抑制病毒复制。文献报道复制。文献报道 ,运用反义运用反义 R N AR N A技术技术 己经成功地抑制疤己经成功地抑制疤病毒病毒 、流感病毒、流感病毒 、人类免疫缺陷病毒、人类免疫缺陷病毒 (H I V)(H I V)等对培养等对培养的组织细胞的侵袭。用针对植物病的组织细胞的侵袭。用针对植物病 毒的反义毒的反义 R N A R N A 已培育已培育出具有抗病毒能力出具有抗病毒能力 的植的植
11、 物。物。第10页，本讲稿共16页姚志强等针对不同靶位设计了姚志强等针对不同靶位设计了1 0 1 0 段互补反义核酸段互补反义核酸(D(D NANA片段片段)，经模型筛选发现针对经模型筛选发现针对S S基因起始区、基因起始区、S P 2S P 2增强子帽区和增强子帽区和 p o l y Ap o l y A信号编码区的信号编码区的a s O Ns a s O Ns 作用最作用最强，强，揭示反调节基因转录揭示反调节基因转录/翻译起始区的反义核酸具翻译起始区的反义核酸具有明显的抗病毒作用。有明显的抗病毒作用。G a b o r G a b o r 等等(1 9 9 8)(1 9 9 8)使用内源性
12、表达抗使用内源性表达抗HI VHI V一一1po1 1po1 vifvif和和 enr enr 基因，以及基因，以及 3 L T R3 L T R序列的反义序列的反义 R N AR N A方方案，案，构建了构建了 Mu L V L T RMu L V L T R启动子逆转录病毒重组质粒，启动子逆转录病毒重组质粒，转录转录 C D 4 C D 4 淋巴细胞系，淋巴细胞系，结果表明反义结果表明反义 R N AR N A能高效能高效地稳定表达，地稳定表达，反义反义 e n v R N Ae n v R N A能够最有效地抑制能够最有效地抑制HI VHI V一一1 1 的复制，的复制，并且反义并且反义
13、 p o l R NAp o l R NA使使P 2 4 P 2 4 抗原减少抗原减少 了了 1 0 01 0 0 01 0 01 0 0 0倍。倍。另外，另外，国内外在应用反义国内外在应用反义R N AR N A技术培育抗病技术培育抗病(如猪瘟、如猪瘟、抗鸡马立克氏病等抗鸡马立克氏病等)动物品系方面也取得比较明显的进动物品系方面也取得比较明显的进展。展。第11页，本讲稿共16页反义 R N A 的抗肿瘤作用肿瘤肿瘤 的发生是多因素引起的的发生是多因素引起的,其中细胞癌基因或其中细胞癌基因或/和某和某些病毒癌基因的异常激活和过度表达是导致细胞恶变的些病毒癌基因的异常激活和过度表达是导致细胞恶变
14、的原因之一。如何控制细胞有害基原因之一。如何控制细胞有害基 因的表达而在基因水因的表达而在基因水平上治疗恶性肿瘤呢平上治疗恶性肿瘤呢?在目前基在目前基 因治疗的众多方案中因治疗的众多方案中,反义反义R N A R N A 技术是技术是 最具吸引力的手段之一。可以设计出最具吸引力的手段之一。可以设计出针对肿瘤细胞针对肿瘤细胞 的癌基因、突变基因的癌基因、突变基因 、非正常表达基因及、非正常表达基因及某些肿瘤相关病毒的癌基因反义某些肿瘤相关病毒的癌基因反义 R N A,R N A,以阻断这些有害以阻断这些有害基因的表达基因的表达 ,达到治疗肿瘤的目的。许多证据表明达到治疗肿瘤的目的。许多证据表明,
15、反义反义R N A R N A 可使肿瘤可使肿瘤 细胞的表型逆转细胞的表型逆转 ,形态变化形态变化 ,增殖速增殖速度减慢度减慢,生存期缩短生存期缩短,软琼脂中克隆能力下降及体内成瘤软琼脂中克隆能力下降及体内成瘤能力减弱等能力减弱等,而不影响细而不影响细 胞生存所必需的其它基因的表胞生存所必需的其它基因的表达。达。第12页，本讲稿共16页Tr o j a n Tr o j a n 等利用等利用 E B E B 病毒游离体表达载体克隆胰岛素病毒游离体表达载体克隆胰岛素样生样生 长因子长因子 (I G F)(I G F)反反 义基因义基因 ,将此重组体转染将此重组体转染 大鼠大鼠 C 6 C 6 细
16、胞系细胞系,在大鼠模型上实现了胶质母在大鼠模型上实现了胶质母 细胞瘤的基因治细胞瘤的基因治疗和预防。疗和预防。我国学者赵晓航等报道互补于我国学者赵晓航等报道互补于 G r n ycG r n yc基基 因第二外显子因第二外显子及其两侧序列的反义及其两侧序列的反义 R N A R N A 能特异性诱发人食管癌细胞能特异性诱发人食管癌细胞程序性死程序性死 亡。亡。黄黄 贤贤 明等明等 利用利用 G e t sG e t s一一2 2、G m y cG m y c和和 N N一一r asr as三个三个癌基癌基 因联合反义因联合反义 R N A R N A 能使人肝能使人肝 癌细癌细 胞胞 株株 S
17、 M M C 77 S M M C 77 2 1 2 1 生长速率下降约生长速率下降约70%,70%,软琼脂集落形成能力及裸鼠软琼脂集落形成能力及裸鼠致瘤能力显著下降致瘤能力显著下降,提示针对多个癌基提示针对多个癌基 因的联合反义因的联合反义R R N A N A 可能给肿瘤基因治疗提供新的途径。可能给肿瘤基因治疗提供新的途径。第13页，本讲稿共16页反义 RNA技术还可用于肠道疾病(R o t b a r t e t a 1 ，1 9 8 8)、心血管疾病、B 一地中海贫血、调节衰弱心脏中肌细胞的 C a2 泵体内平衡u 、G蛋白防止高血压、肝纤维化等多种疾病的研究。第14页，本讲稿共16页
18、参考文献参考文献 1 1 张西锋，沈伟张西锋，沈伟,潘庆杰潘庆杰,白丁平，耿社白丁平，耿社 民反义民反义 R NAR NA技术原理及其在疾病治疗中的应用技术原理及其在疾病治疗中的应用 J .J .莱阳农学莱阳农学院学报院学报 ,2 0 0 4,2 1(1),2 0 0 4,2 1(1)：2 0,21,2 22 0,21,2 2 2.2.孟博孟博 综述，朱大海审校综述，朱大海审校.反义反义RNA RNA 技术的应用与技术的应用与进展进展 J J 国外医学遗传学分册国外医学遗传学分册,2001,2 4(6),2001,2 4(6)：292292 3 3 汤郡汤郡,张莉张莉,郭辉玉反义郭辉玉反义RNARNA技术及其应用技术及其应用 J J 广州医学院学报，广州医学院学报，1 9 9 91 9 9 9，2 7(2)2 7(2)：8 4,8 58 4,8 5 第15页，本讲稿共16页谢谢！第16页，本讲稿共16页