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1、目 录前言 1第一部分 植物组织培养技术实验一 组织培养实验室基本设备及其用途的识别 3实验二 培养基母液的配制 7实验三 MS培养基配制与灭菌 11实验四 外植体选择、消毒灭菌和接种 14实验五 外植体无菌培养和愈伤组织继代、增殖 15实验六 分化成苗、生根和驯化移栽 第二部分 动植物标本制作技术 实验六 动物剥制标本的制作 16实验七 动物骨骼标本的制作 19实验八 植物蜡叶标本的制作 21第三部分 现代生物分子技术实验九 真核生物高分子量DNA制备 23实验十 琼脂糖凝胶电泳技术 25实验十一 PCR基因扩增技术 26第四部分 食用菌栽培技术实验十二 食用菌的母种制作及扩大培养 27实验
2、十三 食用菌的原种制作 29实验十四 食用菌的栽培种及栽培技术 31参考教材 32第一部分 植物组织培养技术 植物组织培养是指植物的任何器官、 组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。其理论依据是植物细胞具有全能性。组织培养的特点是：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。组织培养不但是进行细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科研究的重要手段；而且在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛的应用。实验一 组织培养实验室基本设备
3、及其用途的识别一、目的1.认识植物组织培养实验室的基本结构，必须的基本设备及其用途、方法。2.认识植物组织培养必需的仪器、器皿，几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制。二、实验室的基本结构（一）准备室（工作室）：要求明亮，通风。准备室的任务很繁重，器皿洗涤，培养基药品称量、配制、分装、高压灭菌；植物材料的预处理，重蒸馏水的制备以及进行生理、生化因素的分析等各种操作都要在此室中进行。要有大型工作台12张，大桌子12张，药柜13个用以放置药品、培养瓶和物品。此外还配有各种培养基所需的化学药剂，仪器设备，各种器皿，烘箱、冰箱、天平、酸度计、蒸馏水发生器或纯水发生器、高压灭菌器、电炉、不锈钢锅、培
4、养基分注器、盆与桶等。（二）缓冲室：为避免进出时带进杂菌，无菌室外应设置缓冲室，面积约3m25m2。进入无菌室前需在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。最好安装1盏紫外灯，用以灭菌。墙上设衣帽钩，门边摆拖鞋或设1鞋箱。（三）无菌操作室（也称接种室）：具体视生产规模和超净工作台数量而定。它是进行无菌工作的场所，如材料的灭菌接种，无菌材料的继代，丛生苗的增殖或切割嫩茎插植生根等等，它是植物组织培养研究或生产工作中的最关键的部分，关系到培养物的污染率、接种工作效率等重要指标。无菌室要求干爽安静、清洁明亮，墙壁光滑平整不易积染灰尘，地面平坦无缝，便于清洗和灭菌。最好采用水磨石地面或水磨石砌块
5、地面，白瓷砖墙面或防菌漆天花板板面等结构。门窗要密闭，一般用移动门窗，以减少空气的扰动。在适当的位置安装紫外灯，使室内保持良好的无菌或低密度有菌状态。主要仪器有接种箱、超净工作台等，超净工作台上放酒精灯和装有刀、剪、镊子的工具合（常用饭盒或搪瓷盘），灭菌用的酒精（75%与95%两种）、外植体表面灭菌剂（0.1%HgCl2等）以及吐温、无菌水等。（四）培养室：培养室是将接种到培养瓶等器皿中的植物材料进行培养的场所。其面积根据培养规模和经济条件来确定。为了满足外植体的生长和发育，培养室要具备适宜的温度、湿度、光照、通风等条件。培养室主要有：培养架子和灯光、通风设施、空调机、除湿机、各类显微镜、温度
6、湿度计等。（五）温室（培养大棚）：进行练苗、移栽等。图11 组织培养实验室设计平面图Z.准备室 H.缓冲室 P.培养室 S.水槽 B.白瓷砖面边台,下有备品柜 d.电炉 b.冰箱 G1.放置培养瓶用的搁架 T.大实验台 G.药品及仪器柜 M.门 L.拉门 W.无菌操作室 C.超净工作台 Y.椅子 D.圆橙 G2.放置灭过菌待用培养瓶的搁架 F.分析天平 LC.拉窗,用于递送培养瓶 p.培养架，高200cm，宽60cm，长126cm，分作5或6层三、常用的仪器1. 蒸馏水器2. 手提式高压消毒锅、卧式高压消毒锅3. 天平药物天平（工业天平）、粗天平、（精密度1/10）扭力天平（精密度1/100）
7、分析天平（精密度1/10000）4. 超净工作台（学习、使用、操作）5. 电热干燥箱（烘箱）6. 恒温光照培养箱7. 电冰箱8. 显微镜和解剖镜9. 旋转培养机10. 离心机11. 酸度测定仪 四、必要的器皿（一）玻璃器皿1.培养器皿 试管 三角烧瓶（锥形瓶） 圆形高形培养瓶（罐头瓶） 培养皿 扁身培养瓶 L型和T型管 凹面载玻片2.盛装器皿 试剂瓶 烧杯3.计量器皿 量筒 容量瓶 吸管4.其它器皿滴瓶、称量瓶、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿。（二）金属器械1.镊子类 2025cm长型镊子（接种或转移愈伤组织） 尖端弯曲“枪型”镊子（镊取较小的植物组织） 尖头钟表镊子和鸭嘴镊子（剥离表皮
8、用） 尖端为小铲状镊子（挖取带琼脂培养基的培养物）2.解剖刀和刀类 眼科用刀种牛痘疫苗的菱形刀（切割柔软组织中小细胞团） 解剖刀（手术刀） 双面刀片焊接在玻棒上（切取茎尖用） 锋利小刀、大刀和小铁锹3.剪刀类解剖剪眉剪眼科剪 1825cm弯头剪 俢枝剪4.接种针五、几种常用药剂的配制（一）用95%尝试酒精配比不同浓度的酒精的配制。学习配制70%和75%酒精。（二）消毒剂1.20%次氯酸钠溶液称取20g次氯酸钠用少许水溶解，100ml水定容。2.0.1%升汞（HgCl2）溶液称取0.1g HgCl2少许水溶解，100ml水定容。（三）洗涤剂1.2HCl酒精95%酒精100ml加入2mlHCl2.
9、硫酸重铬酸钾洗液称取10g重铬酸钾加入蒸馏水90ml，加热溶解冷却后，逐渐加入浓硫酸175ml，放入棕色玻璃瓶备用，（注意：切记不可将盛过洒精，甲醛等原剂的药品玻璃器皿直接泡入洗液在，因为重铬酸钾是一种强的氧化剂，一旦被还原氧化，洗液变绿，失去洗涤作用）。这些器皿必须用自来水冲洗干净并晾干再浸入洗液。（四）1摩尔浓度(mg/L )NaOH 和1摩尔浓度（mg/L）HCl配制。摩尔浓度是指用1升（1000ml）溶液中所含溶质的分子量数来表示的溶液的浓度。用M表示。1.NaOH摩尔浓度（M）1M NaOH是指1000ml溶液中含有40克摩尔质量的NaOH，现要配制100ml 400.14g称取Na
10、OH4g，用少量溶解，定容100ml.2.HCl的摩尔浓度具体配制酸的mol浓度时，应考虑原浓酸的比重mol浓度。要求配制的mol浓度需配制的体积原酸分子量V原酸的百分浓度原酸的比重1000配制1.0MHCl 100ml，量取38%，比重为1.19的HCl8.06ml加蒸馏水，定容至100ml。六、实验报告.组织培养实验室一般包括哪几个部分？各自有什么用途及怎样使用？.了解和掌握组织培养的几种主要设备使用方法、常用几种药剂的配制。实验二 培养基母液的制备 一、实验目的学习和掌握培养基母液的配制方法。二 、意义在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素
11、类分别配制成10-100倍浓缩液（即）母液。当配制培养基时，只需要按稀释比例吸取母液即可。三、实验器材 1、电光分析天平（感量为0.0001g）、扭力天平（感量为0.01g）、烧杯（500ml、100ml、50ml）、容量瓶（1000ml、100 ml、50 ml、25 ml）、细口瓶、药勺、玻璃棒、称量纸、电炉。2、实验药品MS培养基各种药品：NH4NO3、 KNO3 、CaCl22H2O 、MgSO47H2O、KH2PO4 ； KI、 H3BO3 、 MnSO44H2O、 ZnSO47H2O、 Na2MoO42H2O 、CuSO45H2O 、CoCl26H2O；FeSO47H2O、Na2-
12、EDTA2H2O ；肌醇 、烟酸 、 盐酸吡哆醇(维生素B6) 、盐酸硫胺素(维生素B1) 、甘氨酸；蔗糖、琼脂； 四、实验步骤1、1L大量元素母液的配制按照表培养基浓度含量扩大20倍，用感量为0.01g的扭力天平称取，配制培养基时，每配1L培养基取此液50ml。用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合，后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。Ca2+盐也可单独配制； 注意：(1) 配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、Mn2+和SO42、PO43+等在一起可能会产生沉淀。为避免此现象发生，注意混合先后顺序。把Ca2+、Mn2+和SO4
13、2、PO43+等错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。另外要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯；各种化学试剂必须先以少量重蒸馏水单独溶解后才能混合； (2)CaCl22H2O要在最后单独加入；Ca2+盐也可单独配制；在溶解CaCl22H2O时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl22H2O放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。、微量元素母液的配制扩大100倍，用感量为0.0001g的电光分析天平称取，配制1升培养基取10ml母液。MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物（除Fe ）组成。微量元素用量较少，特别是 CuSO45H2O、 CoCl26H2O （有的在
14、配制中单独将分微量CuSO45H2O、 CoCl26H2O扩大1000倍，再稀释成100倍）。 注意：使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上，用完以后，用吸耳球将天平内的脏物清理干净。3、铁盐母液的配制扩大100倍，配制培养基时，配制1L取此液10ml。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。 注意：在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成Fe S 04和Na2EDTA鳌合不彻底，此时若将其冷藏，Fe S 04会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，Fe S 04
15、和Na2EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(约加热20 - 30 min)，调pH值至5 .5，室温放置冷却后，再冷藏。4、有机母液的配制扩大100倍，配制培养基时，配制1L取此液10ml。MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。注意：由于维生素母液营养丰富，因此贮藏时极易染菌。被菌类污染的维生素母液，有效浓度降低，并且易给后期培养造成伤害，不宜再用。避免此现象发生的方法是:配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素，并贮存在棕色无菌瓶中，或缩短贮藏时间
16、。表3 MS培养基母液的配制母液名称母液I（大量元素）20倍NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.2H2O KH2PO4 1000ml母液扩大倍数和用量（mg）165020=33000190020=38000440020=8800037020=740017020=3400配制每升培养基取用量50ml母液II（微量元素）100倍KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 0.83100=836.2100=62022.3100=22308.6100=8600.25100=250.025100
17、=2.50.025100=2.510ml母液III（铁盐 ）100倍FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O 27.8100=278037.3100=373010ml母液IV（有机成分）100倍肌醇烟酸盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素 甘氨酸 100100=100000.5100=500.5100=500.1100=102.010010ml5、 激素母液配制植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般激素母液的配制的终浓度以0.5mg/ml为好，需要注意的是：（）配制生长素类，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的
18、NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。（）细胞分裂素，例如KT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加34滴1mol/L的盐酸溶解，再用蒸馏水定容。（）配制生物素，用稀氨水溶解，然后定容。注意：所有的母液都应保存在04冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。五、思考题：1、 配制母液时为什么要按顺序加入各药品？溶解CaCl22H2O时，为什么要将蒸馏水加热？2、 根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值，按给出的培养基配方计算各种母液吸取量，填入下表。培养基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%，pH5.8。 实验二 MS培养基配制与灭菌一、实验目的 1.
19、了解培养基的化学组成及MS培养基的配方组成，掌握MS培养基配制方法；2.掌握灭菌技术；二、原理1. 培养基是植物组织培养中的主要部分，除了培养材料本身因素外，培养基的种类和成分等直接影响培养材料的生长和发育，应根据培养材料的种类和培养部位选择适宜的培养基。培养基的种类很多，不同的培养基有其不同的特点。所培养的植物已有前人作过研究的，可以从文献中找到可供采用的合适培养条件；若前人从未培养过，就要选择和建立一个最适于该植物的营养培养基。可采用一种已知培养基如MS、B5或SH，对一些成分进行改变，进行一系列试验，找到合适的培养条件。表1 培养基的主要成分无机成分无机大量元素氮：铵态氮、硝态氮混合；磷
20、：磷酸盐；钾： 钾盐；钙、硫、镁无机微量元素主要有：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯有机成分糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。植物生长调节物质生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类：BAP, KT，TDz，ZT其他类： GA3, ABA， PP333水琼脂pH值表2 植物生长调节物质类别名称缩写词分子量使用浓度范围母液配制说明生长素2，4二氯苯氧乙酸2，4D221.00.00110mg/L生长素通常用NaOH溶液滴至溶解成溶液。能溶于乙醇IAA易被植物细胞所氧化。故培养基中很少单独使用，不能高压灭菌。萘乙酸NAA186.20.00110mg/L吲哚3乙酸IAA175.2
21、0.00110mg/L吲哚3丁酸IBA203.20.00110mg/L细胞分裂6苄基氨基嘌呤BA225.2分裂素通常能溶于稀NaOH，含水乙醇或稀盐酸玉米素不耐热，不能高压灭菌。6糠基氨基嘌呤KT215.2N异戊烯氨基嘌呤（玉米素）ZT219.2赤霉素赤霉素GA3346.4能溶于乙醇不耐热不能高压灭菌在愈伤组织和悬浮培养物的启动和保持生长时才需要有时小植株再生时也需要三、主要器材1培养基药品：MS基本培养基各种成分，蒸馏水，生长素和细胞分裂素，1MNAOH，1MHCL，0.1 mg/ml的2,4-D溶液：称取10 mg的 2,4-D，加入少量95%的酒精和1 N的NaOH溶解，再加蒸馏水定容至
22、100ml。用同样的方法配制NAA母液。称取 50 mg 6-BA, 加少量的1 mol/L HCl，使其充分溶解，然后加水至50 ml (浓度为1 mg/ml)。2仪器：量筒，烧杯，玻棒， 试管、三角烧瓶（锥形瓶）、圆形高形培养瓶（罐头瓶）、培养皿、量筒、容量瓶、吸管；PH试纸，高压灭菌锅，100 ml三角烧瓶、250 ml三角瓶、试剂瓶、解剖刀柄与刀片、单面刀片、剪刀、长镊子、培养皿、移液管、漏斗、量筒、烧杯（50、100、500、1000 m1），酒精灯、火柴、玻璃棒、吸耳球、封口薄膜、牛皮纸、线绳、牛皮筋、脱脂棉、滤纸、pH试纸（5.4-7.0）、标签纸、称量纸、药勺等。四、步骤1器皿
23、清洗：准备好三角瓶、罐头瓶；量筒、烧杯、容量瓶、吸管、不锈钢锅等；对于新购置的玻璃器皿的洗涤，因有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。已用过玻璃器皿，先将残渣除去；用清水洗净，再用热肥皂水或洗衣粉洗净，清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。2、培养基母液的配制（具体配方见表2）按照培养基配方准确称取，进行配制。（1）大量元素配制成20倍的母液：（2）微量元素配制成100倍的母液：（3）铁盐单独配制成100倍的母液：其配法为2.78g 的硫酸亚铁（Fe SO4.7H2O）和3.73g乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）溶
24、于1L水中，用时每配1L培养基，取该溶液10ml。（4）有机成分配制成100倍的母液母液配制好后放在4 冰箱中保存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。3 MS培养基的配制（1升培养基）（1）琼脂: 称取5-7g琼脂，加入300ml蒸馏水，在电炉上加热，直至完全溶解为止。（2）蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水中。（3）按比例吸取各种母液用筒量取大量元素母液（I）50ml；分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素母液（II），铁盐（III）母液各10ml；用10ml移液管或吸管吸取有机物
25、母液（IV）10ml；用移液管吸取（依具体情况）加入适宜的植物生长调节物质6-BA、2，4-D、NAA、IAA等（有的生长调节物质需灭菌后再通过过滤灭菌加入，如IAA）；将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，熔化混合均匀后，然后加水至1000ml。（4）调节pH值pH值对培养基的凝固情况和植物材料的生长有很大的影响，因此，等培养基配好后，应该立即调整培养基的pH,最好用酸度计，既快又准。也可用精密PH试纸（干燥保存），过酸用1NNaOH调节，过碱用1NHCl调节，经高压灭菌后，由于某些成分的分解（如蔗糖分解）或氧化，酸度会增加，PH一般可降低（0.2），培养基PH一般调至5.65.8的范围。
26、（5）培养基配好后应该立即分装，体积一般为容器的 1/4 或者1/5为好。 将配制好的培养基分装于三角瓶或罐头瓶中，注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上，盖上封口膜，并用牛皮纸包扎。（6）用具清理和洗涤各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。4 MS培养基的灭菌灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。具体操作步骤：（1）高压锅加水至平把架（自动灭菌锅的绿指示灯亮）；（2）把包扎好的培养基装入高压锅;（3）盖上热压锅盖，上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.（4）把热压锅放在3000W电炉
27、座上,然后接通电源（自动灭菌锅只要打开电源）.（5）压力计升至0.5Kg时，打开放气阀，排除冷空气(此步很重要)反复两次至完全把冷空气排除（观察放气阀的气体，若冒出的热气较急冲就可以了）。（6）排除冷空气后，关闭放气阀，待压力升到1Kg位置时，开始计算灭菌时间，一般在1Kg压力(121)下灭菌2025分钟即可，但要注意保持稳定压力。（7）灭菌时间达到20分钟后，除去电源，待压力降至0时，打开放气阀，开盖，取出灭菌物品。（在压力未完全下降前，切勿打开锅盖）。 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25下保存4天，如果培养基需要贮存较
28、长时间，可在4低温下保存。五、注意事项1.在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。2.配制培养基时，一定要注意调节pH。3.灭菌时一定要将锅内的冷空气已由排气孔排尽。六、实验报告1. 检查培养基母液配制、MS培养基的配制及灭菌情况。2. 培养基的成分主要有那几类？实验四 培养材料外植体选择、消毒灭菌和接种一、实验目的1.熟悉不同外植体取材、冲洗等预处理方法；2.外植体表面消毒灭菌技术；3.掌握在超静工作台进行外植体剥离切割方法、无菌接种方法。4.学习胡萝卜离体根和酢浆草培养的基本方法二、实验原理植物组织培养的成功首先在于初代培养，即能否建全
29、起于无菌外植体。要建立初代培养，首先，一定要选择好合适的植物种类，品种及外植体类型，组织培养已经获得成功的植物，几乎包括植物的各个部位（如茎尖、根、茎、胚、花药、叶等等）。第二，外植体材料消毒灭菌重要，注意选择灭菌剂类型和灭菌时间。第三，选择好合适的培养基激素及其他添加物，并注意掌握适宜的培养条件，如光照、温度、湿度。同时，操作技术亦十分重要，无菌操作快，动作熟练，缩短可能污染的时间。三、器材1材料外植体胡萝卜酢浆草酢浆草2试剂次氯酸钠消毒液、0.1%升汞溶液、70%酒精、95%酒精、无菌双蒸水；3仪器及用具盛有培养基的培养瓶(已灭菌)、灭过菌的空三角瓶；超净工作台、橡皮筋、酒精灯、火柴、酒精
30、、棉花球。接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针、记号笔等）四、步骤1.实验前准备接种室的清洁和消毒，接种前半小时，可用75%酒精或新洁尔灭喷洒，地板用湿拖把拖刷。超净工作台在接种前用95%酒精揩抹工作台面和有关用具，并先开机鼓风15-20分钟后才能使用。无菌操作注意：在缓冲室内改穿经过灭菌的白色工作服及拖鞋，戴上白布帽和口罩，才能进入无菌室。进入无菌室前工作人员双手须用肥皂洗净，进行操作前用75%酒精擦抹双手。2.外植体的选择、预处理先选择好外植体类型，如茎、叶、芽、根等进行预处理。对于茎尖、茎段及叶片等因暴露于空气中，有较多的茸毛、油脂和刺等，首先用自来水较长时间冲洗，特别多年生木本材料
31、更注意，有的可用肥皂、洗衣粉或吐温等进行洗涤。果实及种子可先用自来水冲洗1020分钟再消毒。用于培养的花药，实际上多未成熟，外有花萼，花瓣或颖片保护，处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。根及地下部分器官的消毒，这类材料生长于土中，消毒较为困难，先用自来水洗涤，用软毛刷刷洗、用刀切去损伤及污染严重部位。3.外植体的灭菌：在超净工作台上进行4.外植体的接种将消毒灭菌后的外植体分离放在培养基上进行接种。接种时的注意事项：第一，每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75%的酒精溶液中消毒1次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种。注意，沾有酒精的镊子要等到酒精挥发完后，再放到酒精灯火焰
32、上灼烧。第二，外植体放入培养基时，必须放平。每瓶放置外植体的数量，应该根据锥形瓶的大小来确定，一般放置胡萝卜34块。注意外植体也不要放得太少，以充分利用培养基中的营养成分。第三，接种用的酒精灯，火焰不要调得太高，接种时应靠近酒精灯火焰操作，接种的速度要快。5.接种后进行不断观察记录。接种过的外植体置于培养室合适条件下培养，定时进行观察记录现象。具体培养材料的灭菌与接种如下：（一）胡萝卜组织培养1.先将胡萝卜根冲洗干净去皮，去两头留中段，并切成小段，横切成大约10mm厚的切片。以下步骤全部在无菌条件下进行。取两个50ml的灭菌小烧杯或三角瓶,分别倒入25ml的70%的酒精和0.2%的升汞。2.然
33、后将胡萝卜根于70酒精中浸泡数秒钟。 3.浸于0.1氯化汞（升汞）液中消毒灭菌10 min后,再用无菌水冲洗34次。4.将灭菌材料放在灭菌的滤纸上,吸干水分。5.用解剖刀将胡萝卜切去表皮和中柱，取皮层，切成0.5cm见方的小块（或用打孔器），用镊子切好的外植体,迅速接种于锥形瓶的培养基中（MS+2.0mg/L 2，4-D培养基内）,于25，黑暗或漫射光下培养,1421天后继代一次。（二）酢浆草培养（二）紫叶酢浆草的组织培养1.从无病的紫叶酢浆草取叶片，用自来水冲洗干净；2. 在超净工作台上，用95%乙醇浸泡数十秒，再放入氯化汞（升汞）液中消毒灭菌10 min后，用无菌水冲洗3-5次；3.在无菌
34、条件下，把切成一个长约0.5cm*0.5的片段接种分放在化培养基MS+6-BA1.0 mg/L +0.2NAA mg/L培养基上培养，放入培养室内。4.培养的温度控制在2225,光照强度为2000lx左右,光照时间为12h/d；五、注意事项1.外植体不能太小，否则会影响愈伤组织的形成。2.表面消毒灭菌注意时间3.操作时，注意：（1）若是试管，应在酒精灯火焰上封口，接种迅速避免烧伤材料，若是培养瓶，拧开盖子，迅速将材料放入。（2）每接一瓶，用具都应用95%酒精棉球擦并在火焰上烧灼，避免交叉污染。（3）操作结束，整理，清洁干净用具。六、实验报告1外植体经过培养后，观察2周内长出的愈伤组织，记录愈伤
35、组织颜色、形状、疏松度、量多少等情况。日期第一天第三天第五天第七天第九天第十四天.胡萝卜愈伤组织生长情况（颜色、形状、疏松度、量多少）染菌情况成活率2.植物组织培养的理论基础是什么？实验五 外植体无菌培养和愈伤组织诱导、增殖一、实验目的理解愈伤组织的诱导与分化及培养基中各种成分的作用机理；掌握愈伤组织继代、增殖方法；二、实验原理愈伤组织的培养，一般来说，从接种外植体到出现愈伤组织，需要经过2周时间。2周之内就可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。它们若在原培养基上继续培养，由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累会导致愈伤组织块停止生长，直至老化变黑死亡，因此，若是要求愈伤组织继
36、续生长增殖，必须定期地（如2-4周）将它们分成小块或进行分株、分割、剪截（剪成单芽茎段）并转接于新鲜培养基上（培养基配方同原培养基）继代培养，愈伤组织仍可保持旺盛生长。 通过外植体进行初代培养，能否不断增殖并进行继代，既是植物组织培养能否成功实际应用的关键，又是植物离体快速繁殖中第二个阶段的目的，也是最为重要的一个问题。大多数继代培养基与原诱导培养基相同（如：甘蔗、香蕉）但也有认为改变培养基的培养条件来保持继代培养，有的加活性炭，有的从MS培养基转入降低氨态N和钙，增加硝态N、Mg、P的培养基中，有的认为在继代培养基中用KT优于2IP，认为可使用较弱的细胞分裂素。三、器材1.盛有培养基的培养瓶
37、(已灭菌)、超净工作台、培养室、橡皮筋、酒精灯、火柴、酒精、棉花球。接种器械（接种镊子、剪刀、接种针、记号笔等）四、步骤接种在培养基上一周后便逐渐形成愈伤组织，为保持愈伤组织的旺盛生长，一般约34周将愈伤组织分成小块或进行分株、分割、剪截（剪成单芽茎段）进行继代培养。1.先配制好继代培养基并灭菌。2. 在无菌条件下，用无菌的镊子（或接种针）从培养瓶中取出愈伤组织，将它们放在无菌的培养皿中。3. 用无菌解剖刀把每块愈伤组织分割成若干小块（一般不小于5mm5mm）并把已坏死的区域弃去。4. 用无菌镊子将小块愈伤组织放入新鲜的培养基上，每瓶（或管培养基可以放35块，盖上盖子）（或塞上塞子）后置于培养
38、室中继代培养。五、注意事项1.注意培养过程中出现的玻璃化、污染等现象，进行及时处理。六、实验报告1.记录观察培养中污染现象，分化情况，无菌苗是否正常分化？实验六 分化成苗、生根和驯化移栽一 实验目的1.了解和掌握试管苗生根方法2. 熟悉组培苗驯化、移栽技术。二原理从外植体形成器官或细胞无性系的形态发生，有两种方法，一种是不定芽方式，指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式，有三个不同生长阶段第一阶段，细胞和离休外植体脱分化形成愈伤组织；第二阶段，愈伤组织中形成一些分生细胞，继而形成植株结构；第三阶段是器官原基的形成。器官原基是由一个或一小团分生细胞
39、分裂而形成的，这些分生组织块只有在一定条件下，逐渐能见到构成器官的纵轴上表现出单向极性，从而分化出芽和根，另一种是胚状体方式，指由培养细胞或组织诱导分化出具胚芽和胚根的胚状体结构（胚状体）进而发育成完整植株。三 器材器具用品：镊子；水盆；蛭石和珍珠岩；育苗盘；喷雾器；竹签等；四 步骤1.生根培养配制及灭菌先配制好生根培养基，一般1/2MS+IBA+活性炭0.5%+糖3%+琼脂0.5-0.6%(PH5.8-6.0)。2、转接到生根培养基：当无菌苗芽增殖到预定数量后，在无菌条件下操作将丛生状无根芽（苗）单个切开，移到生根培养基中培养，温度282，适当加强光照和延长时间，每天光照16小时，强度：10
40、00LX3.练苗：将生根的组培苗从培养室取出，放在自然条件下12天（在温室内进行），然后打开瓶口，再放置12天。并准备好移栽基质。4.试管苗脱瓶：用镊子将甘蔗苗试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后涝出，放入干净的小盆中。5.移栽：用竹签在基质上打孔，将小苗栽入育苗穴盘中，轻轻覆盖、压实。待整个穴盘栽满后用喷雾器喷水浇平。最后将育苗盘摆入到驯化室中，正常管理。五 注意事项六 实验报告1.观察记录无菌苗生根和生长情况。2.记录试管苗移栽驯化步骤，统计移栽成活率附 康乃馨的离体快繁一、 仪器设备和试剂超净工作台、带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水培养基 N6+1 mg/L 6-BA剪刀
41、、枪型镊子量筒、酒精灯、滤纸、蒸馏水、小刷子95%乙醇、70%酒精、70%酒精棉球、0.2%升汞、甲醛、高锰酸钾、来苏尔纱布、棉塞、牛皮纸、才培纯、肥皂、酒精喷壶植物的嫩茎、侧芽、茎尖、叶片、花、愈伤组织上的不定芽、胚状体、试管苗等二、实验材料 康乃馨枝条三、方法和步骤1 外植体灭菌 取从市场上购买的康乃馨枝条，去掉大的叶片，剪取带腋芽的节结，用肥皂（洗洁精）清洗表面，再用自来水冲洗 30-60分钟，然后在无菌室（超净工作台）内用70%酒精浸没20-40秒钟（根据材料的木质化程度掌握具体的浸没时间。用0.2% 的升汞溶液浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗3-4次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待
42、用。2 接种 先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟后方可进去工作。超净工作台消毒 开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用70% 的酒精棉球擦净工作台。接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中。用酒精灯上灼烧好冷却后的镊子、剪刀取出一个侧芽或小段茎，迅速打开三角瓶口，将材料才插入瓶内，注意材料上下端的极性，不能倒插。在酒精灯边塞回锡箔纸，用记号笔在瓶体上写明日期和材料。3 培养条件： 25光照13小时/天 光强1000 Lux4 继代培养（见下一个实验）5 诱导生根：用低浓度的吲哚乙酸或者萘乙酸或无激素的N6培养基诱导生根6 试管苗移栽参见有关其