第八章酶免疫技术优秀课件.ppt

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1、第八章酶免疫技术第1页，本讲稿共60页第一节酶免疫技术的原理第一节酶免疫技术的原理第二节第二节 酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类第三节第三节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验第四节第四节 固相酶免疫测定的技术要点固相酶免疫测定的技术要点第五节第五节 酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术第六节第六节 其他酶免疫技术其他酶免疫技术第七节第七节 酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用第八章第八章 酶免疫技术酶免疫技术第2页，本讲稿共60页第一节第一节 酶免疫技术的原理酶免疫技术的原理第3页，本讲稿共60页o主要试剂主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原o酶标物特点：酶标物特点：免疫学活性免疫学活性

2、 酶对底物的催化活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性+酶促催化反应的高敏感性原理及特点第4页，本讲稿共60页特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 原理及特点第5页，本讲稿共60页第二节酶免疫技术分类第二节酶免疫技术分类 第6页，本讲稿共60页酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均 相异相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片中的抗原抗体反应 液体标本中抗原或抗体的定性和定量(ELISA)第7页

3、，本讲稿共60页用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。Ag+Ab-E Ag-Ab-E+?原理一、均相酶免疫测定第8页，本讲稿共60页最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定第9页，本讲稿共60页EMITEMIT示意图示意图第10页，本讲稿共60页CEDIACEDIA示意

4、图示意图第11页，本讲稿共60页分类：分类：液相酶免疫测定液相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相不同之处需分离游离与结合的酶标记物二、异相酶免疫测定第12页，本讲稿共60页第三节酶联免疫吸附试验第三节酶联免疫吸附试验 第13页，本讲稿共60页三个部分：免疫反应 酶与底物反应 检测方法的建立ELISA酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）高纯度的抗原

5、、高亲和力的抗体高活性、高纯度的标记用酶有效的交联方法制备高质量的酶标记物选用适宜的酶/底物系统分离结合与游离标记物的方法建立操作步骤以及研究自动化测定技术第14页，本讲稿共60页底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理第15页，本讲稿共60页固相的抗原或抗体 酶标记物 酶反应的底物 三个必要试剂 二、方法类型及反应原理第16页，本讲稿共60页双抗体夹心法（double antibody sandwich-ELISA）方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上

6、的较大分子抗原测定(乙型肝炎表面抗原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的测定。ELISA检测抗原的方法第17页，本讲稿共60页第18页，本讲稿共60页1、已知抗体包 被于载体表面3、加酶标抗体 与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物 不产生颜色双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包 被于载体表面2、加待检物无抗 原与抗体结合3、加酶标抗体 无抗原结合+-EEEEEEEEE第19页，本讲稿共60页ELISA检测抗体的方法捕获法捕获法原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类抗类抗体体加入特异性抗原和酶标记特

7、加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体异性抗原的抗体 底物显色底物显色 应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体第20页，本讲稿共60页捕获法原理+-EEEEE 1、固相化抗人IgM1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色第21页，本讲稿共60页第四第四节节 固相酶免疫测定的技术要点固相酶免疫测定

8、的技术要点试剂的准备反应条件的选择操作的标准化第22页，本讲稿共60页一、试剂的准备o（一）固相载体（一）固相载体 聚苯乙烯聚苯乙烯 特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性 形状：小试管、小珠、微量形状：小试管、小珠、微量ELISA板板 使用前检测其性能使用前检测其性能o（二）抗原和抗体（二）抗原和抗体 高纯度的高纯度的Ag 高效价的高效价的Ab 第23页，本讲稿共60页一、试剂的准备o（三）酶和底物的选择（三）酶和底物的选择 标记酶的要求：标记酶的要求：活性高活性高 性质稳定性质稳定 专一性强专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量酶催化底物的显色信号易

9、于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉第24页，本讲稿共60页辣根过氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比 RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要 ELISA中应用最为广泛的标记用酶 常用酶第25页，本讲稿共60页HRP的底物 DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2HD+2H2 2O O HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种 H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一

10、性很高（小分子醇和尿素的过氧化物）常用底物第26页，本讲稿共60页HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD四甲基联苯胺 TMB5-氨基水杨酸5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基-二二(3-(3-乙基乙基-苯并噻唑苯并噻唑啉磺酸啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTS ABTS常用底物第27页，本讲稿共60页OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。HRP的常见底物 第28页，本讲稿共60页碱性磷酸酶（ALP）菌源性ALP 肠粘膜ALP(小牛)半乳糖苷酶（半

11、乳糖苷酶（-GalGal）常用酶大肠埃希氏菌 第29页，本讲稿共60页ALP的底物-Gal的底物 对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半半-乳糖苷（乳糖苷（4MUG 4MUG）经ALP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计 测量。常用底物第30页，本讲稿共60页二、酶标记抗体或抗原的方法酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate）酶标记物 通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物 第31页，本讲稿共60页抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批

12、量生产，易纯化。制备方法要求第32页，本讲稿共60页制备方法过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原 戊二醛交联法第33页，本讲稿共60页戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。第34页，本讲稿共60页纯化标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法：葡聚糖凝胶（Sephadex）G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯亲和层析效果更好（

13、SPA-IgG;ConA-HRP）二、酶标记物的纯化和鉴定第35页，本讲稿共60页鉴定质量鉴定（ELISA法直接测定）HRP标记IgG的酶标记率（戊二醛法）酶结合量（mg/ml）IgG量（mg/ml）HRP/IgG摩尔比酶的标记率第36页，本讲稿共60页四、最适工作浓度的选择(棋盘法)10+1:10001.1710+1:10000.1510-1:10000.091.0+1:100021.0+1:10000.261.0-1:10000.120.1+1:10000.420.1+1:10000.140.1-1:10000.1110+1:50000.4610+1:50000.0310-1:500001

14、.0+1:50000.91.0+1:50000.121.0-1:50000.010.1+1:50000.120.1+1:50000.040.1-1:50000.0210+1:100000.1210+1:10000010-1:1000001.0+1:100000.221.0+1:100000.011.0-1:1000000.1+1:100000.030.1+1:1000000.1-1:100000第37页，本讲稿共60页五、测定方法的标准化o包被o加样o洗涤o孵育o结果判定第38页，本讲稿共60页第39页，本讲稿共60页第40页，本讲稿共60页o理想coating：吸附尽可能多的Ag或Ab；吸附

15、牢固；非特异性吸附较少o包被机制 1、物理性吸附（被动的）2、共价交联（戊二醛，标准化）o影响包被的因素 1、包被物质的性质及其浓度 2、包被缓冲溶液的pH及离子强度 3、包被温度和时间第41页，本讲稿共60页o包被物质的性质及其浓度 聚苯乙烯吸附抗原效果好 聚乙烯吸附抗体效果好 浓度过高引起前带现象 浓度过低引起非特异性吸附(BSA封闭)o包被缓冲溶液的pH及离子强度 相对低的离子强度有利于蛋白质分子吸附固相表面o包被温度和时间 置4冰箱过夜，或37 孵育2h第42页，本讲稿共60页o加样 加样量准确 加样位置 不产生气泡第43页，本讲稿共60页o洗涤 目的 1、洗去未结合的物质 2、洗去非

16、特异性吸附 要求 1、每孔充满液体 2、去净洗涤液（Tween20）3、冲洗次数和浸泡时间足够 4、具有传染性样品必须采用全自动冲洗第44页，本讲稿共60页o孵育 定义：定义：要使抗原抗体反应和酶催化反应顺利进行，需要合适的pH和适当离子强度的基质液，保持一定的温度，并作用一定时间，整个过程称为孵育或温育。方法：方法：干式 湿氏 推荐温度：推荐温度：37 增强作用增强作用:聚乙二醇 反应时间反应时间:以阳性标本的吸光度值达到1.0时为反应终点第45页，本讲稿共60页o结果判定 1、吸光度法（A）2、比例法(A/A0)3、滴度法（倍比稀释样品）4、吸光度直接表示阳性的程度（均一化）5、标准曲线法

17、第46页，本讲稿共60页第47页，本讲稿共60页第五节 酶免疫组织化学技术第48页，本讲稿共60页酶免疫组织化学技术(enzyme immunohistochemistry technique)o定义 在一定条件下，应用酶标抗体或抗原与细胞或普通组织切片中抗原或抗体反应，酶与底物作用形成有色沉淀物或产物电子密度发生改变，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原或抗体的分布和性质；经图像分析也可达到定量的目的。o种类 1、标记抗体免疫组织化学技术 2、非标记抗体酶免疫组织化学技术 3、酶标记免疫电镜技术第49页，本讲稿共60页o1、标记抗体免疫组织化学技术第50页，本讲稿共60页第51页，本讲稿共6

18、0页第六节 其他酶免疫技术第52页，本讲稿共60页o免疫印记法（immunoblotting test）其他酶免疫技术其他酶免疫技术第53页，本讲稿共60页o生物素-亲和素（BSA）-酶联免疫吸附试验 生物素（biotin）-亲和素（avidin）亲和素与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的亲和力至少高1万倍，且具有高度特异性和稳定性。其他酶免疫技术第54页，本讲稿共60页第七节 酶免疫测定的应用第55页，本讲稿共60页oELISA在预防医学、临床医学的应用o病原体及其抗体的检测（乙肝两对半）o蛋白质的检测o非肽类激素的检测o药物的检测o尿中毒品的检测酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用第56页

19、，本讲稿共60页oELISA在食品检测中的应用o食品中微生物的检测o食品毒素的检测（黄曲霉毒素）o食品中残留农药的检测（除草剂、杀菌剂和杀虫剂）o食品中残留抗生素的检测（氯霉素、磺胺类、呋喃类、喹诺酮类）酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用第57页，本讲稿共60页oELISA在转基因食品检测中的应用（PCR-ELISA方法）oDNA检测o蛋白质检测酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用第58页，本讲稿共60页1 1酶免疫技术的要点？酶免疫技术的要点？2 2酶联免疫吸附试验的原理（酶联免疫吸附试验的原理（ELISAELISA）？）？3 3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？竞争法在酶联免疫检测应用中的

20、原理和应用？4 4常用的底物有哪几类？特点？常用的底物有哪几类？特点？5 5常用的酶有哪几类？特点？常用的酶有哪几类？特点？6 6何谓包被与封闭？其作用？何谓包被与封闭？其作用？7 7对酶免疫技术的应用评价如何？对酶免疫技术的应用评价如何？思考题第59页，本讲稿共60页o酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免

21、疫测定两大类一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。均相两种类型。o均相酶免疫测定主要用于小分子物质和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据均相酶免疫测定主要用于小分子物质和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）,其原理可以有其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。小 结第60页，本讲稿共60页