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1、微生物细胞的破碎技术第一页，讲稿共三十二页哦 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物细胞本身：细胞本身：单细胞蛋白（单细胞蛋白（SCP）胞内产品胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等1.微生物细胞的破碎技术概述微生物细胞的破碎技术概述第二页，讲稿共三十二页哦2.细胞壁的组成和破碎阻力细胞壁的组成和破碎阻力细菌细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。酵母菌：酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。丝状真菌：丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚
2、糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。第三页，讲稿共三十二页哦第四页，讲稿共三十二页哦第五页，讲稿共三十二页哦第六页，讲稿共三十二页哦第七页，讲稿共三十二页哦各种微生物细胞壁的结构与组成各种微生物细胞壁的结构与组成 第八页，讲稿共三十二页哦3.微生物细胞的破碎技术微生物细胞的破碎技术 第九页，讲稿共三十二页哦高压匀浆法高压匀浆法高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂第十页，讲稿共三十二页哦高压匀浆法特点破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片细小，胞内物质释放完全适合格兰氏阳性菌和酵母的破碎;不适合霉
3、菌,因为容易造成堵塞;对革兰氏阳性菌破碎效果较差第十一页，讲稿共三十二页哦影响因素操作压力（5070MPa）细胞浓度（20）温度循环次数(25)第十二页，讲稿共三十二页哦高压匀浆器高压匀浆器第十三页，讲稿共三十二页哦第十四页，讲稿共三十二页哦珠磨法珠磨法 珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。第十五页，讲稿共三十二页哦高速珠磨机高速珠磨机第十六页，讲稿共三十二页哦珠磨法特点破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片较小，胞内物质释放完全温度容易急
4、剧上升，需要良好的降温配套设备相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类第十七页，讲稿共三十二页哦影响细胞破碎的因素影响细胞破碎的因素搅拌速度（7001450r/min）料液的循环速度（50500L/h）细胞浓度（0.30.5g/mL）珠粒大小和填充量（0.451mm；7090)第十八页，讲稿共三十二页哦超声波法超声波法细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体
5、发生流动，从而使细胞破碎。发生流动，从而使细胞破碎。影响因素影响因素:功率、发射时间、次数、细胞悬浮液体功率、发射时间、次数、细胞悬浮液体积积对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。，对酵母菌的效果极差。该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。能量来提供必要的冷却，这是困难的。第十九页，讲稿共三十二页哦电声超声波发生器电声超
6、声波发生器第二十页，讲稿共三十二页哦 化学法 第二十一页，讲稿共三十二页哦 化学法 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂剂酸酸使蛋白质水解成氨基酸，通常采用使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱和表面活。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。常用表面活性剂有常用表面活性剂有胆酸盐胆酸盐、磷脂、磷脂、SDS、CTAB、有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂
7、可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 第二十二页，讲稿共三十二页哦化学法化学法优点：优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备等优点，故等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备等优点，故使用较多。使用较多。缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随后缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难产物的纯化带来困难总结：总结：酸碱容易造成产物水解或变性，慎用；酸碱容易造成产物水解或变性，慎用；表面活性剂以及表面活性剂以及丁酯、丁醇、丙酮等有机溶剂丁酯
8、、丁醇、丙酮等有机溶剂适合于绝适合于绝大部分非蛋白类的物质；大部分非蛋白类的物质；第二十三页，讲稿共三十二页哦 酶解法酶解法利利用用酶酶反反应应，分分解解破破坏坏细细胞胞壁壁上上特特殊殊的的键键，从而达到破壁的目的。从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺缺点点：酶酶水水解解费费用用较较贵贵，一一般般只只适适用用于于小小规规模的实验室研究。模的实验室研究。溶溶菌菌酶酶是是应应用用最最多多的的酶酶，它它能能专专一一地地分分解解细细胞胞壁壁上上糖糖蛋蛋白白分分子子的的-1，4糖糖苷苷键键，使使脂脂多多糖糖解解离离，经经溶溶菌菌酶酶处处理理后后的
9、的细细胞胞移移至至低低渗渗溶溶液中使细胞破裂。液中使细胞破裂。第二十四页，讲稿共三十二页哦渗透压冲击渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖如一定浓度的甘油或蔗糖溶液溶液)，达到平衡后，介质被突然稀释，或，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或
10、合成受抑制而或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。强度减弱时才是合适的。第二十五页，讲稿共三十二页哦冻结冻结-融化法融化法将将细细胞胞放放在在低低温温下下突突然然冷冷冻冻和和室室温温下下融融化化，反复多次而达到破壁作用。反复多次而达到破壁作用。对对于于细细胞胞壁壁较较脆脆弱弱的的菌菌体体，可可采采用用此此法法。但但通通常常破破碎碎率率很很低低即即使使反反复复循循环环多多次次也也不不能能提提高高收收率率。另另外外，还还可可能能引引起起对对冻冻融融敏敏感感的的某某些蛋白质的变性。些蛋白质的变性。第二十六页，讲稿共三十二页哦干燥法干燥法可可采采用用空空气气干干燥燥，真真空空干干
11、燥燥，喷喷雾雾干干燥燥和和冷冻干燥等。冷冻干燥等。空空气气干干燥燥主主要要适适用用于于酵酵母母菌菌。真真空空干干燥燥适适用用于于细细菌菌的的干干燥燥。冷冷冻冻干干燥燥适适用用于于较较不不稳稳定的生化物质。定的生化物质。干干燥燥法法条条件件变变化化较较剧剧烈烈，容容易易引引起起蛋蛋白白质质或或其其它组织变性。它组织变性。第二十七页，讲稿共三十二页哦机械破碎法与非机械法比较机械破碎法与非机械法比较 第二十八页，讲稿共三十二页哦4 破碎方法的选择破碎方法的选择细胞的量破碎条件目标产物对破碎条件的敏感性破碎目标待破碎细胞的机械强度第二十九页，讲稿共三十二页哦破碎率的测定破碎率的测定 1.直接测定法直接
12、测定法2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率第三十页，讲稿共三十二页哦破碎技术的新进展破碎技术的新进展多多种种破破碎碎方方法法相相结结合合：冻冻融融法法与与匀匀浆浆法法结结合合破破碎碎酵母，有效提高破碎率酵母，有效提高破碎率与上游过程相结合：利用病毒进行裂解溶胞与上游过程相结合：利用病毒进行裂解溶胞将将细细胞胞破破碎碎与与后后续续分分离离结结合合：珠珠磨磨法法与与双双水水相相萃取萃取第三十一页，讲稿共三十二页哦5.5.基因工程表达产物的后处理基因工程表达产物的后处理 包含体的分离与复性包含体的分离与复性 什么是包含体 外外源源蛋蛋白白质质基基因因在在受受体体菌菌中中表表达达时时形形成成的的没没有有活活性性的的蛋蛋白白质质聚聚集集体体称称为为包包含含体体。包包含含体体内内除除目目标标蛋蛋白白外外还还有有微微量量的的质质粒粒，rRNA和和RNA聚合酶。聚合酶。包含体蛋白的一级结构是正确的，但空间折叠错误，故没有生物活性。第三十二页，讲稿共三十二页哦