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1、微生物的进化系统发育分类第一页，讲稿共四十八页哦第一节进化的测量指征第一节进化的测量指征高等动植物判断亲缘关系：形态结构、生理生化、行为习性等表型特征，少量的化石资料微生物：形体微小、结构简单、缺少有性繁殖过程，依靠表型特征无法测量其系统发育进化指征的选择进化指征的选择:微生物的系统发育，主要是分析和比较生物大分子的结构特征，特别是蛋白质、RNA和DNA这些反映生物基因组特征的分子序列，作为判断各类微生物乃至所有生物进化关系的主要指征蛋白质、RNA和DNA序列进化变化的显著特点是进化速率相对恒定第二页，讲稿共四十八页哦合适的指征大分子合适的指征大分子1、必须普遍存在于所研究的各个生物类群中 2
2、、在各种生物中功能同源的大分子 3、为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所选择的分子序列必须能严格线性排列，以便进行进一步的分析比较 4、根据所比较的各类生物之间的进化距离来选择适当的分子序列(选择进化速率低的分子序列)第三页，讲稿共四十八页哦1、rRNA参予生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中，其功能保持不变2、在16SrRNA分子中(系谱分析的分子尺，古化石)，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究3、16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析.（5S16S23S,120个
3、核苷酸15402900）4、rRNA普遍存在于真核生物和原核生物中，且占总RNA的90%，便于提取（伍斯）。rRNA作为进化的分子指征依据作为进化的分子指征依据第四页，讲稿共四十八页哦rRNA序列测定和分析方法1 1、寡核苷酸编目分析法、寡核苷酸编目分析法-30%-30%序列，发序列，发现古生菌现古生菌 （1）16SrRNA提取-T1核酸酶水解-同位素标记-电泳分离、放射自显影技术、电泳图谱，确定寡核苷酸分子序列 相似性系数法和序列印记法比较亲缘关系相似性系数法：通过计算相似性系数SAB值来确定微生物之间的关系（SAB=2NAB/(NA+NB)序列印记法：通过序列比较后，若发现某些序列仅为某种
4、(群)微生物所特有，这些序列即可作为该种(群)微生物的印记序列印记序列第五页，讲稿共四十八页哦电泳的原理电泳的原理序列印记序列印记通常出现在某一特定系统发育群的全部成员通常出现在某一特定系统发育群的全部成员或绝大多数成员。或绝大多数成员。20世纪世纪70年代末，生命分为三界的理论，就是采用寡核年代末，生命分为三界的理论，就是采用寡核苷酸编目分析法对大量微生物分析比较后提出来的苷酸编目分析法对大量微生物分析比较后提出来的第六页，讲稿共四十八页哦古生菌、细菌和真核生物的16S(18S)RNA的印记序列2 2、全序列分析法、全序列分析法 用反转录酶和双脱氧序列分析，可以对未经纯化的rRNA抽提物进行
5、直接的序列测定第七页，讲稿共四十八页哦双脱氧核苷终止法测定全序列第八页，讲稿共四十八页哦系统发育树系统发育树无根树：无根树：只是简单表示生物类群之间的系统发育关系，并只是简单表示生物类群之间的系统发育关系，并不不反映进化途径反映进化途径有根树有根树：不仅表示出不仅表示出A A、B B、C C、D D的的亲疏亲疏，而且反，而且反映出它们有共同的映出它们有共同的起源及起源及进化方向进化方向系统发育树系统发育树-在研究生物进化和系统分类中，常用一种树状在研究生物进化和系统分类中，常用一种树状分枝的图型来概括各种分枝的图型来概括各种(类类)生物之间的亲缘关系，这种树状分生物之间的亲缘关系，这种树状分枝
6、的图型被称为枝的图型被称为系统发育树系统发育树(phylogenetic tree)(phylogenetic tree)，简称系统，简称系统树树 第九页，讲稿共四十八页哦全生命系统树(Olsen和Woese1993)基因组系列研究表明：在域内和域间存在广泛的基因水平转移，及真核生物拥有来自细菌或古生菌的基因，两域之间也有频繁的基因交换。甚至细菌也可从真核生物域获得基因。第十页，讲稿共四十八页哦三界生物的主要特征三界生物的主要特征第十一页，讲稿共四十八页哦伍斯：用寡核苷酸序列编目分析法伍斯：用寡核苷酸序列编目分析法三界三界(域域)：Bacteria(Bacteria(细菌细菌)、Archaea
7、(Archaea(古生菌古生菌)和和Eukarya(Eukarya(真核生物真核生物)第十二页，讲稿共四十八页哦第二节细菌分类第二节细菌分类分类分类(classification)是根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育相关性)对微生物进行分群归类，排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定命名命名(nomenclature)是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称鉴定鉴定(identification或determination)则是指借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程第十三
8、页，讲稿共四十八页哦七级分类单元界界Kingdom(Regnum)门门Phylum(phybum)纲纲Class(Classis)目目Order(Ordo)科科Family(Familia)属属Gennus(Genus)种种Species(Species)“亚亚”、“超超”、“族族”辅助辅助单元单元分类单元及其等级分类单元及其等级第十四页，讲稿共四十八页哦分类单元及其等级分类单元及其等级培养物培养物(culture)，是指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。菌株菌株(strain)，从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变)所获得的某
9、一菌株的变异型-新的菌株，与野生型区别。种群种群(population)-是指一定空间中 同种个体的组合。种种(species)，是生物分类中基本的分类单元和分类等级，具有共同特征的亚种组是生物分类中基本的分类单元和分类等级，具有共同特征的亚种组成成亚种亚种(subspecies)或变种(variety)，当某一个种内的不同菌株存在少数明显而稳定的变异特征或遗传性状而又不足以区分成新种时，将这些菌株细分成两个或更多的小的分类单元-亚种。亚种是正式分类单元中地位最低的分类等级。型型(form或type)，常指亚种以下的细分 属属(genus)，是介于种(或亚种)与科之间分类等级，也是生物分类中的
10、基本分类单元。通常是把具有某些共同特征或密切相关的种归为一个高一级的分类单元，称之属。第十五页，讲稿共四十八页哦双命名法双命名法现命人.年Escherichia coli(Migula)CastellanietChalmers1919学名学名=属名属名+种名种名+首命人.年+词首大大写词首小小写通常学术论文中不写Bacillus subtilis (Ehrenberg)Cohn1872学名学名=属名属名+种名种名+亚种或变种名称“新种”(sp.nov):新被鉴定的种发表时应在其学名后标上sp.nov.的符号，新种发表前应将其模式菌株的培养物存放在一个永久性的保藏机构，并应允许人们从中取得第十六
11、页，讲稿共四十八页哦种名几点说明种名几点说明学名学名:属名词首大写,表示种的主要特征而种名词首小写,表示种的次要特征属名的缩写属名的缩写:文中首次使用不能缩写,重 复出现的可用词首大写的一或几字母加点表示BacillusBacillus为B B.种名未定时种名未定时:使用时写出属名及种名未定用sp.(一种)或spp.(几种)发音发音:应按拉丁发音规则,实际以英文发音居多第十七页，讲稿共四十八页哦种的分类地位举例种的分类地位举例单元单元 詹氏甲烷球菌詹氏甲烷球菌 大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌 八孢裂殖酵母八孢裂殖酵母界古生菌界(域)细菌界(域)菌物界门广古生菌门朊细菌门真菌门亚门(组)产甲烷菌组朊细
12、菌组子囊菌亚门纲甲烷球菌纲发酵细菌纲半子囊菌纲目甲烷球菌目肠杆菌目内孢霉目科甲烷球菌科肠杆菌科内孢酶科属甲烷球菌属埃希氏菌属裂殖酵母属种詹氏甲烷球菌大肠埃希氏菌八孢裂殖酵母M.jannaschii E.coli S.Octosporus Methanobacterium Escherichia Schizosaccharomces分类系统分类系统 系统手册系统手册2000年年 系统手册系统手册2000年年 Ainsworth词典词典1983年年第十八页，讲稿共四十八页哦亚种以下的各类型亚种以下的各类型第十九页，讲稿共四十八页哦原核生物包括古生菌与细菌两个域。其分类工作是一件意义重大又十分艰巨的
13、工作。伯杰氏手册是原核生物分类的权威经典著作，从1923年第一版至今已出了11版。从1984年开始至1989编写了新的4卷本手册，更名为伯杰氏系统细菌学手册，2000年起系统手册的第二版分五卷陆续发行。伯杰氏手册伯杰氏手册简介简介第二十页，讲稿共四十八页哦地球上生存的菌物约有150万种，目前已记载的只有7-9万种，每年以发现1500个新种的速度递增。Ainsworth系统是常用的菌物分类系统：安贝氏菌物词典之1995年已第八版，而且每版均有变化。菌物分类（真菌）菌物分类（真菌）第二十一页，讲稿共四十八页哦伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细菌学手册 第二版第二版第二版分5卷，更多地依靠系统发育资料
14、系统发育资料对细菌分类群，而不是根据表型特征。第二版：古生菌域2门8纲，细菌域23门31纲5卷大致的内容安排如下：第一卷：古生菌、蓝细菌、光合细菌和最早分支的细菌 第二卷：变形杆菌(多样的革兰氏阴性菌类)第三卷：低G+C含量（50%mol以下）的革兰氏阳性菌 第四卷：高G+C含量（50%mol以上）的革兰氏阳性细菌(含放线菌类)第五卷：浮霉状菌、螺旋体、丝杆菌、拟杆菌和梭杆菌及衣原体(属革兰氏阴性菌)第二十二页，讲稿共四十八页哦第三节微生物分类鉴定的特征和技术第三节微生物分类鉴定的特征和技术原核生物的特点原核生物的特点 单细胞及集合/基因组无膜包裹/二等分裂增殖无减数分离/无膜隔细胞器/无细胞
15、质流现象/为70S核糖体/壁含肽聚糖等从以往旧体系主要以从以往旧体系主要以表型、实用性鉴定指表型、实用性鉴定指标标遗传型系统进化分类新遗传型系统进化分类新体系体系（RNADNA蛋白等蛋白等分类依据：分类依据：第二十三页，讲稿共四十八页哦一、微生物鉴定的经典方法一、微生物鉴定的经典方法获取纯培养物获取纯培养物(pure culture)测定各鉴定指标测定各鉴定指标 各大类有各自重点指标各自重点指标 ：真菌以真菌以形态为主 酵母和放线菌酵母和放线菌则以形态与生理兼用形态与生理兼用 细菌细菌较多使用生理指标生理指标查找权威性鉴定手册查找权威性鉴定手册第二十四页，讲稿共四十八页哦经典的鉴定指标经典的鉴
16、定指标第二十五页，讲稿共四十八页哦1、常用于分类和鉴定的、常用于分类和鉴定的形态学特征形态学特征形态学特征：易于观察和比较，具有相对的稳定性第二十六页，讲稿共四十八页哦2、常用于微生物分类鉴定的、常用于微生物分类鉴定的生理生化特征生理生化特征生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因产物第二十七页，讲稿共四十八页哦3、血清学试验与噬菌体分型、血清学试验与噬菌体分型不同微生物抗原物质结构不同，赋予它们不同的抗原特征（细胞表面的蛋白决定的）血清学试验被广泛用于微生物分类鉴定的研究，但比较成功的应用是对种内(以及个别属内)不同菌株血清型的划分噬菌体对宿主的感染和裂解
17、作用常具有高度的特异性，即一种噬菌体往往只能感染和裂解某种细菌，甚至只裂解种内的某些菌株第二十八页，讲稿共四十八页哦4、氨基酸顺序和蛋白质分析、氨基酸顺序和蛋白质分析蛋白质是基因的产物，蛋白质的氨基酸顺序直接反映mRNA顺序而与编码基因密切相关蛋白质氨基酸顺序的进化速率大体上是恒定的，但功能不同的蛋白质常以不同的速率进化蛋白质的氨基酸顺序测定虽然经过不断改进，但总的说还是很烦杂耗费。在微生物分类中，常采用间接的比较方法，前述的血清学方法也是其中之一，还可以进行蛋白电泳图谱比较第二十九页，讲稿共四十八页哦5、核酸的碱基组成和分子杂交、核酸的碱基组成和分子杂交1.DNA的碱基组成(G+Cmol%)
18、DNA的碱基组成和排列顺序决定生物的遗传性状，DNA碱基组成是各种生物一个稳定的特征亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的G+C含量测定DNA碱基组成的方法很多，常用的有热变性温度法、浮力密度法和高效液相色谱法2.核酸的分子杂交 不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映这些生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近核酸分子杂交在微生物分类鉴定中的应用包括：DNA-DNA杂交、DNA-rRNA杂交、核酸杂交来检测特定核苷酸序列的核酸探针技术第三十页，讲稿共四十八页哦DNA-DNA双链DNA热处理变性解链-变性后冷处理-复性-不同株的或同源性的DNA杂交组成双链DNA-R
19、NA当非配对碱基超过10-20%DNA-DNA之间就不能形成双链，限制了DNA-DNA杂交的应用水平，若比较亲缘关系较远的菌株，就用DNA-RNA，DNA-DNA杂交率很低时，DNA-RNA仍有较高的杂交率，可比较属与属之间的或较远的核酸探针：核酸探针：指能识别特异核苷酸序列的、带标记的一段单链DNA或RNA分子，即是能与特定的核苷酸序列（靶序列）结合，而不与其他序列结合的带标记的单个核苷酸片段。系统发育树探针全rRNA探针科属的特异性探针第三十一页，讲稿共四十八页哦染色体的原位杂交染色体的原位杂交荧光探针杂交第三十二页，讲稿共四十八页哦第三十三页，讲稿共四十八页哦遗传重组遗传重组原核生物中，
20、虽然没有有性生殖，但它们可以通过转化、转导和接合作用进行染色体基因的交换发生接合、转化和普遍性转导的细菌之间需要存在广泛的染色体同源性，否则此类重组(同源重组)即不能发生质粒及转座子的基因转移在细菌分类中的意义也是值得注意的基因的垂直转移基因的垂直转移 和水平转移和水平转移第三十四页，讲稿共四十八页哦第四节微生物的快速鉴定和自动化分析第四节微生物的快速鉴定和自动化分析技术技术一、微量多项试验鉴定系统一、微量多项试验鉴定系统原理：根据微生物生理生化特征鉴定的结果，而进行的数码分类鉴定国外的产品已标准化、系统化和商品化，主要有法国生物-梅里埃集团的API/ATB；瑞士罗氏公司的Micro-ID，E
21、nterotube,Minitek；美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统优点：快速、敏感、准确、重复性好，简易，节省人力、物力、时间和空间 广泛应用于动植物检疫、临床检验、食品卫生、药品检验、环境监测、发酵控制和生态研究。第三十五页，讲稿共四十八页哦“APIAPI”细菌数值鉴定系统细菌数值鉴定系统API由bioMerieux（生物-梅里埃公司，法国）依据20,000多株标准菌株,大约1000种不同细菌生化试验于1970年开始开发的系列产品。它的出现是对细菌学领域传统技术的一次标准化、微量化的彻底变革。它使细菌鉴定更加简单、快速和可靠，已被微生物学家的广泛使用,并成为全球的鉴定细菌的参考标
22、准。API创建了独特的数值鉴定法，并设计了相应的计算机软件APILAB plus。它较API鉴定检索书更为高效、可靠、全面、详尽、方便,故APILAB Plus能够鉴定很多非典型菌。该软件做为一种判断结果的工具,只要键入生化反应结果的数值编码,就可立刻获得鉴定报告结果。第三十六页，讲稿共四十八页哦API10S最常见革兰氏阴性杆菌APINH奈瑟民菌、嗜血杆菌属API20STREP链球菌及有关菌APICAMPY弯曲杆菌APICORYNE棒状菌群MILISTERIA李斯特菌属API20E革兰氏阴性杆菌(肠杆菌科)API2ONE菲肠道革兰民阴性杆菌API2OA厌氧菌API20CAUX酵由菌APISTA
23、PH葡萄球菌和微琼菌APIAPI已包括已包括1515个鉴定系列个鉴定系列,700,700多个细菌种：多个细菌种：第三十七页，讲稿共四十八页哦API20E反应判定表第三十八页，讲稿共四十八页哦API 20E鉴定卡示意图第三十九页，讲稿共四十八页哦操操 作作 简简 便便每管接种0.1ml浓度适中的细菌，2448h保温，即可观察结果。结合一些补充指标，再按规定进行编码、检索第四十页，讲稿共四十八页哦EnterotubeEnterotube系统系统称为肠道管系统。鉴定卡：由带有12个分隔室的一根塑料管组成，每个分隔室内装有不同的培养基琼脂斜面，能检验微生物的15种生理生化反应，一根接种接种丝丝穿过全部
24、分隔室的各种培养基，并在塑料管的两端突出，被两个塑料帽盖着，像一根火腿肠鉴定步骤：将塑料管的两端帽子移去，用接种丝一端的突出尖端接触平板上待鉴定的菌落中心，然后在另一端拉出接种丝，通过全部分隔室，使所有培养基都被接种，再将一段接种丝插回到4个分隔室的培养基中，以保持其还原或厌氧条件。由美国由美国“RocheRoche”公司开发公司开发第四十一页，讲稿共四十八页哦EnterotubeEnterotube系统的接种过程系统的接种过程第四十二页，讲稿共四十八页哦“Biolog”全自动和手动系统全自动和手动系统 由美国安普科技中心（由美国安普科技中心（ATC USATC US）1989 1989 年开
25、发的产品年开发的产品 ，1991 1991 年年 被被 列列 为为 全全 球球 100 100 项项 最最 好好 的的 科科 技技 产产 品。特点是自动化，品。特点是自动化，快速（快速（424h424h）、准）、准 确、高效和应用范围广。确、高效和应用范围广。关键部件是一个关键部件是一个9696孔细菌培养板。原理是利用细菌对孔细菌培养板。原理是利用细菌对95 95 种不同种不同碳源培养基利用和代谢情况进行鉴碳源培养基利用和代谢情况进行鉴 定定 。目前可鉴定目前可鉴定 千余种菌，包千余种菌，包括细菌、真菌、放线菌等括细菌、真菌、放线菌等 。手动系统以手动形式将鉴定板的结果输入电脑，进行菌种的自手
26、动系统以手动形式将鉴定板的结果输入电脑，进行菌种的自动鉴定。动鉴定。第四十三页，讲稿共四十八页哦细菌生理生化全自动鉴定仪第四十四页，讲稿共四十八页哦大肠菌测试卡可携带的检测水中大肠菌数的大肠菌测试卡在一块拇指大小的塑料板上，装有一薄层脱水干燥的大肠菌选择鉴定培养基，其上覆盖微孔滤膜(0.45m)，整个塑料板有一外套统计滤膜上形成的兰或绿色菌落数。菌落的多少可以表明水中污染大肠菌群的状况第四十五页，讲稿共四十八页哦6个鉴定系统的优、缺点比较第四十六页，讲稿共四十八页哦二、快速、自动化微生物检测仪器和设备二、快速、自动化微生物检测仪器和设备下述三方面测量出的数据，分别或综合起来就能够获得每种微生物的特征“指纹图”，用目测法或计算机将未知微生物的特征“指纹图”与已知微生物的“指 纹图”比较分析，能对未知微生物作出快速鉴定。第一，每种微生物的化学组成化学组成都有其独特之处，其结构、性能有 差别，能用这些通用的仪器测量出来；第二，每种微生物代谢过程代谢过程的不同，特异性的代谢产物，能量变换和信息传递的差异，也能用这类精密仪器测量出；第三，不同的微生物对环境有着不同的影响对环境有着不同的影响，包括对环境中物质的降解、能量和信息的变化等的不同，通用的这类仪器都可用于测量分析。第四十七页，讲稿共四十八页哦几种微生物快速测量仪第四十八页，讲稿共四十八页哦