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1、色谱分离第四章色谱分离第四章第1页，共54页，编辑于2022年，星期二(1)利用保留时间或保留体积定性利用保留时间或保留体积定性将已知纯物质和未知物在相同的色谱条件进样分析将已知纯物质和未知物在相同的色谱条件进样分析被测组分被测组分tR5min某纯物质某纯物质tR5min可能是同一物质可能是同一物质优点：操作简单快速优点：操作简单快速缺点：柱温、流动相流速、进样量等操作条件缺点：柱温、流动相流速、进样量等操作条件 对保留值的影响较大对保留值的影响较大第2页，共54页，编辑于2022年，星期二（2）加入已知纯物质增加峰高定性）加入已知纯物质增加峰高定性第3页，共54页，编辑于2022年，星期二（
2、3）双色谱系统定性）双色谱系统定性 改变色谱条件以改变分离选择性，使不同的物改变色谱条件以改变分离选择性，使不同的物质显示不同保留值质显示不同保留值.观察未知物和标准物的保留是否改变以验证是否为同观察未知物和标准物的保留是否改变以验证是否为同一物质一物质.GC:双柱定性，或降低柱温提高定性的准确性双柱定性，或降低柱温提高定性的准确性LC：改变流动相或固定相，或者两者同时改变改变流动相或固定相，或者两者同时改变第4页，共54页，编辑于2022年，星期二4.1.2 利用文献保留数据定性利用文献保留数据定性(1)相对保留值定性相对保留值定性第5页，共54页，编辑于2022年，星期二（2）保留指数定性
3、）保留指数定性 保留指数保留指数I以正构烷烃作为参比标准，人以正构烷烃作为参比标准，人为的定义正构烷烃的保留指数为它的碳原子为的定义正构烷烃的保留指数为它的碳原子数乘以数乘以100，如：，如：正已烷正已烷 I=600，正庚烷正庚烷 I=700 组分的保留指数用适当的正构烷烃的保组分的保留指数用适当的正构烷烃的保留值表示。留值表示。第6页，共54页，编辑于2022年，星期二 测定组分的保留指数测定组分的保留指数IX时，选定两个正时，选定两个正构烷烃作为标准，其中一个碳原子数为构烷烃作为标准，其中一个碳原子数为z，另另一个碳原子数为一个碳原子数为z+n，被测组分的调整保留值被测组分的调整保留值应在
4、两者之间。应在两者之间。第7页，共54页，编辑于2022年，星期二Ix100z nlg tR(x)lg tR(z)lg tR(z+n)lg tR(z)I 只与固定相的性质、柱温有关第8页，共54页，编辑于2022年，星期二4.1.3 利用检测器选择性响应定性利用检测器选择性响应定性 如：火焰光度检测器对如：火焰光度检测器对S、P物质组成有物质组成有响应响应;电子捕获检测器对电负性大的组分灵敏度高电子捕获检测器对电负性大的组分灵敏度高;氢火焰检测器只对有机物有响应氢火焰检测器只对有机物有响应;在实际工作中，可采用双检测器定性在实际工作中，可采用双检测器定性.第9页，共54页，编辑于2022年，星
5、期二4.1.5 化学方法定性化学方法定性（1）柱前反应）柱前反应 在样品进入色谱柱前加入特征试剂，使样在样品进入色谱柱前加入特征试剂，使样品中的某些组分与特征试剂反应，使色谱峰的品中的某些组分与特征试剂反应，使色谱峰的保留值发生变化或色谱峰消失。比较反应前后保留值发生变化或色谱峰消失。比较反应前后的色谱图，判断样品中存在的组分。的色谱图，判断样品中存在的组分。第10页，共54页，编辑于2022年，星期二（2）柱上扣除反应）柱上扣除反应 在分析柱前加一预柱（前置柱），预在分析柱前加一预柱（前置柱），预柱中装有特殊的试剂，使得某些组分在其柱中装有特殊的试剂，使得某些组分在其上发生不可逆反应而除去。
6、例如：酸性前上发生不可逆反应而除去。例如：酸性前置柱能把胺不可逆地吸附于其中。置柱能把胺不可逆地吸附于其中。用作扣除反应的仪器，一般在柱前装用作扣除反应的仪器，一般在柱前装有切换阀，样品既能通过前置柱后进入分有切换阀，样品既能通过前置柱后进入分析柱，也能直接进入分析柱，以利比较。析柱，也能直接进入分析柱，以利比较。第11页，共54页，编辑于2022年，星期二（3）柱后反应）柱后反应 收集色谱柱后的流出物，再与各种收集色谱柱后的流出物，再与各种官能团试剂反应，利用官能团定性反应官能团试剂反应，利用官能团定性反应对组分定性。对组分定性。第12页，共54页，编辑于2022年，星期二4.1.5 色谱与
7、其它仪器联用方法定性色谱与其它仪器联用方法定性将色谱与质谱或红外光谱联用定性。将色谱与质谱或红外光谱联用定性。实质实质色谱仪质谱仪（或红外光谱仪）的进样装置色谱仪质谱仪（或红外光谱仪）的进样装置质谱仪（红外光谱仪）色谱仪的检测器质谱仪（红外光谱仪）色谱仪的检测器第13页，共54页，编辑于2022年，星期二（1）色谱质谱联用）色谱质谱联用色谱质谱联用流程图色谱质谱联用流程图第14页，共54页，编辑于2022年，星期二试样试样色谱柱色谱柱分子分离器分子分离器样品分子样品分子离子源室离子源室质量分析器质量分析器载气载气真空系统真空系统离子检测室离子检测室总离子流图总离子流图质谱图质谱图第15页，共5
8、4页，编辑于2022年，星期二大气悬浮物中有机物的总离子流图大气悬浮物中有机物的总离子流图第16页，共54页，编辑于2022年，星期二桉叶油素质谱图桉叶油素质谱图第17页，共54页，编辑于2022年，星期二第18页，共54页，编辑于2022年，星期二（2）色谱红外光谱联用）色谱红外光谱联用第19页，共54页，编辑于2022年，星期二 联用系统获取的色谱图并不是检联用系统获取的色谱图并不是检测信号的直接输出，而是将红外检测测信号的直接输出，而是将红外检测器记录的干涉图经计算机处理后的结器记录的干涉图经计算机处理后的结果，称为重建色谱图。果，称为重建色谱图。第20页，共54页，编辑于2022年，星
9、期二化学图（化学图（chemigram)化学图又称为官能团色谱图。这是一种从所化学图又称为官能团色谱图。这是一种从所收集的全部光谱信息中选取感兴趣信息加以显收集的全部光谱信息中选取感兴趣信息加以显示的方法。化学图的横坐标为随时变化的光谱示的方法。化学图的横坐标为随时变化的光谱信号或时间，纵坐标为强度。信号或时间，纵坐标为强度。第21页，共54页，编辑于2022年，星期二第22页，共54页，编辑于2022年，星期二 Gram-Schmidt 重建色谱图重建色谱图 利用利用GramSchmidt矢量正交化方法直接从矢量正交化方法直接从干涉图取样而建立的色谱图。干涉图取样而建立的色谱图。下面是一个烷
10、基酚粗产品的分析：下面是一个烷基酚粗产品的分析：主要试验条件：主要试验条件：Varian 3400气相色谱仪，交联气相色谱仪，交联甲基聚硅氧烷柱甲基聚硅氧烷柱3000.53min（id），），膜厚膜厚7m，载气（载气（N2）：）：1.58mLmin-1，不分流，无尾吹。不分流，无尾吹。进样进样2 m，柱温：柱温：126，保持，保持10min，然后以然后以4min-1升到升到200。Nicolet 5SS红外光谱仪。红外光谱仪。光管：长：光管：长：15cm，内径：内径：1mm，光管和传输线光管和传输线温度：温度：200。第23页，共54页，编辑于2022年，星期二第24页，共54页，编辑于202
11、2年，星期二第25页，共54页，编辑于2022年，星期二红外总吸收色谱图（红外总吸收色谱图（TIA）与化学图相似，其峰的响应是相应的干涉图与化学图相似，其峰的响应是相应的干涉图变换成光谱图后全波数或部分波数区的红外吸收变换成光谱图后全波数或部分波数区的红外吸收强度的积分值。该图类似于强度的积分值。该图类似于GCMS中的总离子中的总离子流图（流图（TIC），），但其横坐标为数据点而不是时间。但其横坐标为数据点而不是时间。第26页，共54页，编辑于2022年，星期二（3）多机联用技术）多机联用技术质谱法质谱法 优点：检测灵敏度高，能提供相对优点：检测灵敏度高，能提供相对分子质量，分子碎片等结构信息
12、，且谱库分子质量，分子碎片等结构信息，且谱库数据丰富数据丰富 缺点：对分子的空间构型和各结构缺点：对分子的空间构型和各结构单元间的连接方式的判断有困难单元间的连接方式的判断有困难红外光谱法红外光谱法 优点：可提供整个分子的基因信息优点：可提供整个分子的基因信息 缺点：检测灵敏度较低缺点：检测灵敏度较低第27页，共54页，编辑于2022年，星期二色谱红外光谱质谱联用可以在线获得色谱红外光谱质谱联用可以在线获得更多的结构信息。更多的结构信息。第28页，共54页，编辑于2022年，星期二 例：使用串联式的例：使用串联式的GC/FTIR/MS对一个镇静对一个镇静药混合物进行分析的实验。药混合物进行分析
13、的实验。使用使用HP-5（SE-54）色谱柱，柱长色谱柱，柱长25m，内径内径0.32mm，膜厚膜厚0.52m。光管和质谱接口光管和质谱接口传输线为传输线为HP-5柱，柱长柱，柱长1.1m，内径内径0.1mm，膜厚膜厚0.17 m。载气：载气：He，柱温：由柱温：由70以以15 min-1升到升到275。第29页，共54页，编辑于2022年，星期二第30页，共54页，编辑于2022年，星期二 按出峰顺序各组分依次为：仲丁巴比妥，按出峰顺序各组分依次为：仲丁巴比妥，异戊巴比妥，戊巴比妥，度冷丁，速巴比妥，异戊巴比妥，戊巴比妥，度冷丁，速巴比妥，导眠能和苯巴比妥。它们大多很容易被鉴别。导眠能和苯巴
14、比妥。它们大多很容易被鉴别。但但2号峰和号峰和3号峰的质谱图和光谱图十分相似。号峰的质谱图和光谱图十分相似。第31页，共54页，编辑于2022年，星期二第32页，共54页，编辑于2022年，星期二（4）多维色谱联用技术）多维色谱联用技术 目前已出现的多维色谱联用有目前已出现的多维色谱联用有GC/GC/MS，GC/GC/MS/MS，LC/GC/MS，LC/GC/FTIR等等 例：例：GC/GC/MS分析苯乙烯中含量在百万分析苯乙烯中含量在百万分之几的杂质。分之几的杂质。主要试验条件：某一级色谱柱为主要试验条件：某一级色谱柱为3m，内径内径2mm的的3silar 10c pyrex填充柱，第填充柱
15、，第2级色谱级色谱为柱长为为柱长为30mm的的DB-170熔融石英毛的管径。熔融石英毛的管径。第33页，共54页，编辑于2022年，星期二左图为第一维色谱获得的色谱图，其中进入冷阱并被左图为第一维色谱获得的色谱图，其中进入冷阱并被导入第二维色谱柱的流出物用导入第二维色谱柱的流出物用A表示，表示，B为苯乙烯的峰。为苯乙烯的峰。右图为第二维色谱获得的色谱图，经质谱分析表明，图右图为第二维色谱获得的色谱图，经质谱分析表明，图中中1-3号峰为二甲苯的异构体，号峰为二甲苯的异构体，4-6号峰为含号峰为含3个碳的烷基个碳的烷基苯的异构体。苯的异构体。第34页，共54页，编辑于2022年，星期二4.2 色谱
16、定量分析色谱定量分析定量依据：定量依据：定量计算定量计算准确测定峰的面积或峰高准确测定峰的面积或峰高求出定量校正因子求出定量校正因子选择定量的方法选择定量的方法第35页，共54页，编辑于2022年，星期二4.2.1 峰面积的测量峰面积的测量（1）峰高乘半峰宽峰高乘半峰宽峰形对称，且不太窄时适应峰形对称，且不太窄时适应这样计算的峰面积是实际峰面积的这样计算的峰面积是实际峰面积的0.94倍，倍，实际的峰面积应为：实际的峰面积应为：作相对计算时，作相对计算时，1.065可以省略。可以省略。第36页，共54页，编辑于2022年，星期二（2）峰高乘平均峰宽）峰高乘平均峰宽 不对称峰采用此法计算较为准确不
17、对称峰采用此法计算较为准确（3）峰高代替峰面积定量）峰高代替峰面积定量 对于一定的样品，操作条件严格不变对于一定的样品，操作条件严格不变时，在一定的进样范围内，半峰宽不变。时，在一定的进样范围内，半峰宽不变。当峰形较窄时，用此法定量更准确。当峰形较窄时，用此法定量更准确。第37页，共54页，编辑于2022年，星期二（4）峰高乘保留时间）峰高乘保留时间 在一定操作条件下，同系物的半峰宽与在一定操作条件下，同系物的半峰宽与保留时间成正比，对于狭窄峰或半峰宽以上保留时间成正比，对于狭窄峰或半峰宽以上重叠的峰可用此法计算。重叠的峰可用此法计算。作相对计算时，作相对计算时，1.065和和b可以略去。这种
18、可以略去。这种方法对含量相对较大的组分有一定的误差。方法对含量相对较大的组分有一定的误差。第38页，共54页，编辑于2022年，星期二（5）数字积分仪和色谱数据工作站）数字积分仪和色谱数据工作站第39页，共54页，编辑于2022年，星期二4.2.2 定量校正因子定量校正因子同一检测器对不同类型物质的响应值不同同一检测器对不同类型物质的响应值不同 m1 m2时，时，A1 A2 所以，不能用所以，不能用A直接计算含量，必须乘上一个校直接计算含量，必须乘上一个校正因子，使组分的面积值转化为相应的物质量正因子，使组分的面积值转化为相应的物质量.第40页，共54页，编辑于2022年，星期二第41页，共5
19、4页，编辑于2022年，星期二第42页，共54页，编辑于2022年，星期二例：乙酸乙酯：乙酸丁酯：乙酸戊酯例：乙酸乙酯：乙酸丁酯：乙酸戊酯 5mL:5mL:5mL 0.901：0.882：0.871第43页，共54页，编辑于2022年，星期二第44页，共54页，编辑于2022年，星期二4.2.3 定量分析方法定量分析方法（1）归一化法）归一化法 样品中所有组分都能流出色谱柱，且样品中所有组分都能流出色谱柱，且检测器都能检出响应信号时，可用此法检测器都能检出响应信号时，可用此法进行定量计算进行定量计算.第45页，共54页，编辑于2022年，星期二设样品中有几个组分，则组分设样品中有几个组分，则组
20、分I的百分含量为：的百分含量为：第46页，共54页，编辑于2022年，星期二第47页，共54页，编辑于2022年，星期二采用峰高定量时应注意：采用峰高定量时应注意：操作条件严重影响峰高；操作条件严重影响峰高；柱吸附，柱超载会使色谱峰变形；柱吸附，柱超载会使色谱峰变形；进样速度直接影响峰高和峰宽。进样速度直接影响峰高和峰宽。第48页，共54页，编辑于2022年，星期二（2）内标法当试样中的组分不能全部出峰，或不需定量的色谱峰未能定性或重叠时，可用此法。例：醇类混合物中乙醇含量的测定（丙酮作内标物）第49页，共54页，编辑于2022年，星期二设试样质量为 m(g)，内标物为 ms(g)，待测物：m
21、ifiAi内标物：msfsAs%Ci 100 100 mi m ms fiAi fsAs m fiAi fsAs ms m100第50页，共54页，编辑于2022年，星期二内标法一般以内标物为基准，即fs1.00若m、ms固定，则式子可化简为：%Ci 常数AiAs第51页，共54页，编辑于2022年，星期二以Ci%对Ai/As作图，可得内标标准曲线。第52页，共54页，编辑于2022年，星期二（3）外标法（标准曲线法）若试样中被测组分浓度变化不大时，可采用单点校正法。Ci%Cs%AiAs 用一系列不同浓度C标准溶液进样测量峰面积A,以A对C作图绘出标准曲线第53页，共54页，编辑于2022年，星期二4-2-4影响定量分析准确性的因素（1）样品的稳定性和代表性；（2）样品的导入,样品量取误差为2-5%；（3）柱系统的影响：分离状况、热分解和吸附等；（4）操作条件的影响：柱温、载气流速、检测器等。第54页，共54页，编辑于2022年，星期二