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1、流式细胞技术现在学习的是第1页，共60页第四节第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、五、AIDSAIDS病检测中的应用病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关六、自身免疫性疾病相关HLAHLA抗原分析抗原分析 七、移植免疫中的应用七、移植免疫中的应用思考题思考题小结小结现在学习的是第2页，共60页流式细胞术流式细胞术(flow cyto
2、metry,FCM)是以流式细胞是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。术。现在学习的是第3页，共60页 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。定量分析或纯化分选。流式细胞术的特点流式细胞术的特点现在学习的是第4页，共
3、60页第一节 概述现在学习的是第5页，共60页 流式细胞仪流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、（如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。术。现在学习的是第6页，共60页现在学习的是第7页，共60页细胞胞组成成细胞功能胞功能大小大小细胞表面胞表面/胞胞浆/核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性胞活
4、性DNA,RNADNA,RNA含量含量胞内胞内细胞因子胞因子蛋白蛋白质含量含量激素激素结合位点合位点钙离子离子,PH,PH值,膜膜电位位酶活性活性流式细胞仪常检测的细胞特性流式细胞仪常检测的细胞特性现在学习的是第8页，共60页采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；保证检测的灵敏度和特异性；一、工作原理一、工作原理 现在学习的是第9页，共60页用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细用计算机系统对流动的单细胞悬液
5、中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。了检测速度与统计分析精确性。现在学习的是第10页，共60页 （1 1）液流系统液流系统 （2 2）光学系统光学系统 （3 3）数据处理系统数据处理系统1.流式细胞仪的基本结构：现在学习的是第11页，共60页由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的荧光染料标记的单抗对其染色单抗对其染色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进入流从样品管进入流动室形成样本流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是鞘液：辅助样本流
6、被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。（1）液流系统现在学习的是第12页，共60页激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/短波长，通过短短波长，通过短/长波长长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通光电倍增管：光电倍增管：FS,SSFS,SS（散射光），（散射光）
7、，FL1,FL1,FL2,FL3,FL4FL2,FL3,FL4（荧光）（荧光）（2）光学系统现在学习的是第13页，共60页FlowTipLaserSS and FLDetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图现在学习的是第14页，共60页主要由计算机及其软件组成主要由计算机及其软件组成（3）数据处理系统）数据处理系统现在学习的是第15页，共60页基本工作原理现在学习的是第16页，共60页区别区别流式细胞仪流式细胞仪显微镜显微镜光源光源激光激光自然光、灯光自然光、灯光对象对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子细胞、组织等细胞、组织等承载工具承载工具鞘液及流动室鞘液及流动室载玻片载
8、玻片检测信号检测信号光学信号光学信号形态及染色形态及染色放大方式放大方式PMTPMT、放大电路、放大电路目镜目镜物镜、光学放大物镜、光学放大统计统计计算机，计算机，50005000人工，人工，200200结果结果多参数，综合分析多参数，综合分析简单，单参数简单，单参数流式细胞仪与显微镜的区别流式细胞仪与显微镜的区别现在学习的是第17页，共60页 细胞在液柱中与激光束相交时向周围细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，它的强弱立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为主要分为前向散射光前向散射
9、光和和侧向散射光侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定现在学习的是第18页，共60页现在学习的是第19页，共60页前向散射光（前向散射光（forward scatter,FSforward scatter,FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5(0.510)10)向前方散射的讯号用于检测向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比积大小成正比。现在学习的是第20页，共60页侧向散射光（侧向散射光（side scatter,SSside scatter,SS）：）：激光激光
10、束照射细胞时，光以束照射细胞时，光以9090角散射的讯号，角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。用于检测细胞内部结构属性。现在学习的是第21页，共60页 测得的测得的FSFS与与SSSS信号通过计算机处理，可信号通过计算机处理，可得到得到FS-SSFS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。析表面分子。光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群亚群 现在学习的是第22页，共60页荧光
11、信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。不同。三、荧光测量三、荧光测量现在学习的是第23页，共60页每种荧光染料会产生特定波长的荧光每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。分开，送入不同的光电倍增管。现在学习的是第24页，共60页选择不同的单抗及染料就可同时测定选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。一个细胞上
12、的多个不同特征。线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器现在学习的是第25页，共60页荧光染料的特性荧光染料的特性激发波长激发波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)现在学习的是第26页，共60页 通过流式细胞仪进行细胞分选主要通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。培养和研究时进行的。四、细胞分选原理四、细胞分选原理现在学习的是第27页，共60页细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴
13、含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电（一）分选基本原理（一）分选基本原理现在学习的是第28页，共60页分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。的百分率。（二）分选的技术要求（二）分选的技术要求现在学习的是第29页，共60页分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成过测量点的分选细胞
14、之间的比率。与纯度成反比。反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。率。与分选速度成反比。现在学习的是第30页，共60页第二节 数据的显示与分析现在学习的是第31页，共60页参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双参数散点图、双参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维等高图、假三维等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）设门分析技术设门分析技术 现在学习的是第32页，共60页FSF
15、S：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、一、参数参数现在学习的是第33页，共60页单参数直方图单参数直方图双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图三参数直方图三参数直方图多参数分析多参数分析直分析方图直分析方图二、数据显示方式二、数据显示方式现在学习的是第34页，共60页 由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量
16、的多少。颗粒数量的多少。（一）单参数直方图（一）单参数直方图现在学习的是第35页，共60页双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。就可以确定细胞在图上的表达位置。（二）双参数直方图（二）双参数直方图现在学习的是第36页，共60页双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的是通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗
17、粒数量的多少。粒数量的多少。现在学习的是第37页，共60页2.二维等高图二维等高图由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即绝对数，即“等高等高”。曲线层次越高曲线层次越高(越里面的线越里面的线)所代表的细胞数愈所代表的细胞数愈多。多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。现在学习的是第38页，共60页 多参数分析：当细胞标记了多色荧多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光，被激发光激发
18、后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数分析（四）流式细胞仪的多参数分析现在学习的是第39页，共60页第四第四节 流式流式细胞胞仪免疫分析的技免疫分析的技术要求要求 现在学习的是第40页，共60页样本制备样本制备标记染色标记染色液相芯片技术液相芯片技术 质量控制质量控制 现在学习的是第41页，共60页外周血淋巴细胞样品的制备外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞分离单个核细胞培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞脱落使贴壁细胞脱落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤单细
19、胞悬液单细胞悬液一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备现在学习的是第42页，共60页新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械法机械法酶处理法酶处理法化学试剂处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法表面活性剂处理法现在学习的是第43页，共60页单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周）甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）现在学习的是第44页，共60页适用条件适用条件:有较高的量子产额和消光系数有较高的量子产额和消光系数对对488nm488nm的激发光波长有较强的吸收的激发光波长
20、有较强的吸收发射光波长与激发光波长间有较大的波长差发射光波长与激发光波长间有较大的波长差易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记染色现在学习的是第45页，共60页名称名称染料染料激激发波波长荧光光颜色色溶解性溶解性对PHPH敏敏感性感性特点特点异硫异硫氰酸酸荧光素光素FITCFITC488488绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州得州红Texas Texas redred568568红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶定，偶联后量子后量子产额低低
21、藻藻红蛋白蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具具较多多发光基光基团，消光系数和量子消光系数和量子产额高高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋藻青蛋白白APCAPC633633红670670能量能量传递复合染料复合染料PEcy5PEcy5488488红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用的几类荧光染料常用的几类荧光染料现在学习的是第46页，共60页 用化学法将两种不同激发波长的染料结合用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在在一起，在488nm488nm激发光照射下，通过一个荧光染激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长
22、再激发另一荧光染料产料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。能量传递复合染料能量传递复合染料现在学习的是第47页，共60页荧光染料与细胞成分的四种结合方式荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式结构亲和式嵌入结合嵌入结合共价键结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合荧光标记抗体特异性结合（二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记现在学习的是第48页，共60页免疫荧光标记方法免疫荧光标记方法 直标直标:干扰少干扰少,但需购买多种单抗但需购买多种单抗 间标间标:步骤多步骤多,干扰多干扰多,不需标记多种不需标记多种抗体抗体组合标
23、记组合标记现在学习的是第49页，共60页免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有有“液相芯片液相芯片”之称之称 。三、免疫胶乳颗粒技术的应用三、免疫胶乳颗粒技术的应用现在学习
24、的是第50页，共60页微小的乳胶微球分别染成上百种不同的微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）芯片则是用颜色来编码）现在学习的是第51页，共60页第四第四节 在免疫学在免疫学检验中的中的应用用现在学习的是第52页，共60页 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，细胞仪对细胞表面的抗原成分进行
25、标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。加了有效的手段和帮助。现在学习的是第53页，共60页T T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生产生IgM型自身抗体型自身抗体,参与免疫参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关调节、与自身免疫病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激受外来抗原刺激,产生高亲和性特产生高亲和性特异性抗体异性抗体NK细胞分析细胞分析NK(CD3-CD1
26、6+CD56+)一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析现在学习的是第54页，共60页细胞介导细胞毒性试验细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例死细胞与活细胞比例)细胞内细胞因子测定细胞内细胞因子测定二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析现在学习的是第55页，共60页三、淋巴造血系统及白血病免疫分型三、淋巴造血系统及白血病免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型型用于选择化疗方案、判断预后及用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变检出微小残留病变现在学习的是第56页，共60页CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例MDR(+)表示对化疗药物耐药
27、四、肿瘤耐药基因分析四、肿瘤耐药基因分析五、五、AIDS病检测中的应用病检测中的应用现在学习的是第57页，共60页HLA-B27可出现在可出现在58%97%的强直性的强直性脊椎炎脊椎炎(As)患者患者六、自身免疫病相关六、自身免疫病相关HLA抗原分析抗原分析现在学习的是第58页，共60页 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术应用主要包括流式细胞术的交叉配型（的交叉配型（Flow cytometry cros
28、s-matching,FCXM）和群体反应性抗体（）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody,PRA）检测。）检测。七、移植免疫中的应用七、移植免疫中的应用现在学习的是第59页，共60页思考题思考题1.流式细胞仪的分析检测原理是什么？流式细胞仪的分析检测原理是什么？2.流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。的检测意义。3.何谓荧光补偿？何谓何谓荧光补偿？何谓“液相芯片液相芯片”技术？技术？4.细胞分选的基本原理。细胞分选的基本原理。5.FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？其设门分析的意义？现在学习的是第60页，共60页