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1、关于植物体细胞无性系变异及突变体筛选第1页，此课件共37页哦 将植物外植体在组织培养过程中，由于受到非生物因将植物外植体在组织培养过程中，由于受到非生物因子的诱导发生变异，进而导致再生植株发生遗传变异的子的诱导发生变异，进而导致再生植株发生遗传变异的现象称为体细胞无性系变异（现象称为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。）。植物体细胞无性系变异现象是植物组织培养中的普遍植物体细胞无性系变异现象是植物组织培养中的普遍现象。并可产生有益变异性状，对品种改良具有重要意现象。并可产生有益变异性状，对品种改良具有重要意义，已成为植物种质资源创新和品种选育的有效途径。义，已成为植物
2、种质资源创新和品种选育的有效途径。第2页，此课件共37页哦一、体细胞无性系变异的广泛性一、体细胞无性系变异的广泛性 体细胞无性系变异主要表现：体细胞无性系变异主要表现：(1)植株外部形态变异，如株高、叶形、叶色等；植株外部形态变异，如株高、叶形、叶色等；(2)育性上的变异；育性上的变异；(3)生长势上的变异；生长势上的变异；(4)抗性变异；抗性变异；(5)某些酶及同工酶变化；某些酶及同工酶变化；(6)次生代谢物的差异。次生代谢物的差异。第3页，此课件共37页哦第4页，此课件共37页哦第5页，此课件共37页哦二、植物体细胞无性系变异的来源二、植物体细胞无性系变异的来源1.源于外植体预先存在的变异
3、源于外植体预先存在的变异2.所用外植体体内存在变异细胞，由变异细胞再生所用外植体体内存在变异细胞，由变异细胞再生的植株可能为变异植株。的植株可能为变异植株。3.2.离体培养诱导的变异：离体培养诱导的变异：4.植物组织培养本身对植物细胞产生一种胁迫作用，植物组织培养本身对植物细胞产生一种胁迫作用，从而诱发植物细胞发生可遗传变异和表观遗传变异从而诱发植物细胞发生可遗传变异和表观遗传变异（epigenetic variation）。表观遗传变异是指不是由）。表观遗传变异是指不是由DNA序序列改变而引起的植株表型变异。列改变而引起的植株表型变异。第6页，此课件共37页哦（1）培养基成分和培养条件：）培
4、养基成分和培养条件：植物激素和生长调节剂是诱导体细胞无性系变异的重要原因之一，培养植物激素和生长调节剂是诱导体细胞无性系变异的重要原因之一，培养基中含有多种激素时，其诱变率大于单一激素。基中含有多种激素时，其诱变率大于单一激素。生长素既能促进多倍体细胞分裂，又能诱导多倍体，尤其是生长素既能促进多倍体细胞分裂，又能诱导多倍体，尤其是2，4-D具具有更强的诱变作用。有更强的诱变作用。此外，高温、低温等培养条件也能促进染色体变异。部分植物细胞悬浮培此外，高温、低温等培养条件也能促进染色体变异。部分植物细胞悬浮培养比固体培养易变异。养比固体培养易变异。（2）植株再生途径：）植株再生途径：体细胞胚胎发生
5、途径遗传稳定性优于器官发生途径，尤其是经历体细胞胚胎发生途径遗传稳定性优于器官发生途径，尤其是经历脱分化形成愈伤组织的间接器官发生途径变异频率较高。脱分化形成愈伤组织的间接器官发生途径变异频率较高。第7页，此课件共37页哦（3）培养时间和继代频率：）培养时间和继代频率：继代培养时间越长，变异率越高。如香蕉茎尖繁殖经过继代培养时间越长，变异率越高。如香蕉茎尖繁殖经过5、7、9、11次继代培养，体细胞无性系变异率分别为次继代培养，体细胞无性系变异率分别为1.3%、1.3%、2.9%、3.8%。（4）母本植株的遗传状态：）母本植株的遗传状态：不同物种再生植株变异率存在差异，同意物种不同品种无性系变不
6、同物种再生植株变异率存在差异，同意物种不同品种无性系变异率也有差别，同一物种多倍体变异率高于二倍体。同一植株不同异率也有差别，同一物种多倍体变异率高于二倍体。同一植株不同外植体变异率也存在差异。外植体变异率也存在差异。第8页，此课件共37页哦三、体细胞突变体的特征和类型：三、体细胞突变体的特征和类型：1.特征：特征：(1)突变发生的频率较低；突变发生的频率较低；(2)(2)突变随机发生具有偶然性；突变随机发生具有偶然性；(3)(3)突变的表型在没有选择压力的条件下仍然稳突变的表型在没有选择压力的条件下仍然稳定；定；(4)(4)表现型应能通过有性传递保持其特性。表现型应能通过有性传递保持其特性。
7、第9页，此课件共37页哦2.体细胞突变体的类型：体细胞突变体的类型：（1）营养缺陷型：）营养缺陷型：EMS(甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯)处理烟草悬浮细胞诱导突变，处理烟草悬浮细胞诱导突变，通过加入通过加入BUdR（5-溴脱氧尿苷）进行筛选。溴脱氧尿苷）进行筛选。已已 选择出需要生物素、次黄嘌呤、对氨基苯甲酸、选择出需要生物素、次黄嘌呤、对氨基苯甲酸、赖氨酸、精氨酸及脯氨酸的六种营养缺陷型。赖氨酸、精氨酸及脯氨酸的六种营养缺陷型。第10页，此课件共37页哦（2）抗性突变体：）抗性突变体：A.抗氨基酸及类似物的突变体抗氨基酸及类似物的突变体 选择相应的氨基酸生产过量的抗性突变体，原理是选择相应的氨基
8、酸生产过量的抗性突变体，原理是关键酶对反馈抑制不敏感，超越常量的合成对应氨基关键酶对反馈抑制不敏感，超越常量的合成对应氨基酸，或能减少或拒绝摄入氨基酸或类似物，或能分解酸，或能减少或拒绝摄入氨基酸或类似物，或能分解和转化而解毒。和转化而解毒。第11页，此课件共37页哦B.抗抗菌素药物突变体：抗抗菌素药物突变体：抗链霉素、卡那霉素和氯霉素等突变体，抗链霉素、卡那霉素和氯霉素等突变体，多为细胞质遗传。多为细胞质遗传。烟草细胞抗链霉素细胞系在（烟草细胞抗链霉素细胞系在（250-500ug/ml）的链霉素培养基上再生植株表现绿色。的链霉素培养基上再生植株表现绿色。第12页，此课件共37页哦C.抗除草剂
9、突变体：抗除草剂突变体：培养在添加除草剂培养在添加除草剂Picloram（4-氨基氨基-3，5，6三三氯吡啶羧酸）培养基上的烟草中，分离出抗除氯吡啶羧酸）培养基上的烟草中，分离出抗除草剂突变体。草剂突变体。这类抗性属于单个显性或半显性突变遗传。这类抗性属于单个显性或半显性突变遗传。第13页，此课件共37页哦D.抗病突变体：抗病突变体：烟草单倍体细胞经烟草单倍体细胞经EMS处理后，培养在添加蛋处理后，培养在添加蛋氨酸磺基圬（病毒素类似物）的培养基上，由存活的氨酸磺基圬（病毒素类似物）的培养基上，由存活的细胞产生愈伤组织并分化成植株，对病原体感染不敏细胞产生愈伤组织并分化成植株，对病原体感染不敏感
10、。感。第14页，此课件共37页哦E.其他突变体：其他突变体：抗核酸碱基类似物的突变体体；碳源利用突抗核酸碱基类似物的突变体体；碳源利用突变体；激素自养型突变体；温度敏感突变体；变体；激素自养型突变体；温度敏感突变体；耐盐、耐早等环境胁迫的突变体等。耐盐、耐早等环境胁迫的突变体等。第15页，此课件共37页哦四、体细胞无性系变异的遗传学基础：四、体细胞无性系变异的遗传学基础：体细胞无性系变异具有其遗传基础，表现在染色体结构和数量的变异、体细胞无性系变异具有其遗传基础，表现在染色体结构和数量的变异、基因突变、扩增、丢失、重排和转座子激活等。基因突变、扩增、丢失、重排和转座子激活等。1.染色体数目变异
11、染色体数目变异 体细胞培养中产生的染色体数目变异主要源自有丝分裂过程体细胞培养中产生的染色体数目变异主要源自有丝分裂过程中纺锤体的异常。在细胞分裂的后期，不同程度的纺锤体缺失导中纺锤体的异常。在细胞分裂的后期，不同程度的纺锤体缺失导致染色体不分离、移向多级、滞后或不聚集，最终产生变异。致染色体不分离、移向多级、滞后或不聚集，最终产生变异。第16页，此课件共37页哦（1）整倍体变异）整倍体变异 染色体自然加倍现象称为体细胞内多倍染色体自然加倍现象称为体细胞内多倍化，可能是在有丝分裂过程中纺锤体合成受阻引起，也可化，可能是在有丝分裂过程中纺锤体合成受阻引起，也可能是细胞质不分裂而形成多核细胞。能是
12、细胞质不分裂而形成多核细胞。（2）非整倍体变异）非整倍体变异 非正倍体的出现多是由于多级纺锤体非正倍体的出现多是由于多级纺锤体出现、染色体不分离或滞后以及核碎裂等导致。出现、染色体不分离或滞后以及核碎裂等导致。2.染色体结构变异染色体结构变异 包括染色体断裂后经过修复和重新连接形成的易位、倒位、包括染色体断裂后经过修复和重新连接形成的易位、倒位、缺失和重复等结构变异。缺失和重复等结构变异。第17页，此课件共37页哦（3）基因突变）基因突变 包括核基因突变和细胞质基因突变。基因突变分包括核基因突变和细胞质基因突变。基因突变分为隐形单基因或多基因突变和显性单基因或多基因突变。为隐形单基因或多基因突
13、变和显性单基因或多基因突变。（4）转座因子活化）转座因子活化 转座因子是指能在基因组中移动和修饰基因表转座因子是指能在基因组中移动和修饰基因表达的达的DNA序列。转座因子插入到新的基因位点引起邻近基因转录特序列。转座因子插入到新的基因位点引起邻近基因转录特性不稳定地抑制或修饰，转座作用可可以造成染色体断裂、染色体性不稳定地抑制或修饰，转座作用可可以造成染色体断裂、染色体缺失、重复、倒位和易位，而引起性状变异。转座子激活也是体细缺失、重复、倒位和易位，而引起性状变异。转座子激活也是体细胞无性系变异的主要原因之一。胞无性系变异的主要原因之一。(5)DNA甲基化甲基化 甲基化是指甲基化是指DNA复制
14、后，在复制后，在DNA甲基化酶的催甲基化酶的催化下，将化下，将S-腺苷酰甲硫氨酸（腺苷酰甲硫氨酸（SAM）上的甲基转移到）上的甲基转移到DNA分子的胞嘧啶分子的胞嘧啶碱基上的碱基上的DNA修饰过程。当一些基因的某些位置甲基化后，其基因表现修饰过程。当一些基因的某些位置甲基化后，其基因表现为不活跃的非表达基因；去甲基化后，则活跃表达。组织培养诱发的突变为不活跃的非表达基因；去甲基化后，则活跃表达。组织培养诱发的突变直接或间接与直接或间接与DNA甲基化状态改变有关。甲基化状态改变有关。第18页，此课件共37页哦五、体细胞突变体的诱发和筛选：五、体细胞突变体的诱发和筛选：1、材料的选择：、材料的选择
15、：选择原则：避免采用不能再生或难以再生的材料；选择原则：避免采用不能再生或难以再生的材料；要选用染色体稳定的细胞系进行起始诱导。要选要选用染色体稳定的细胞系进行起始诱导。要选择生长速度快的细胞。择生长速度快的细胞。第19页，此课件共37页哦2、细胞的来源：、细胞的来源：愈伤组织、悬浮培养细胞和原愈伤组织、悬浮培养细胞和原生质体。生质体。（1）愈伤组织：）愈伤组织：优点：取材方便优点：取材方便 缺点：生长较悬浮细胞慢；接触缺点：生长较悬浮细胞慢；接触选择剂不均匀；聚集体较大，抗性细选择剂不均匀；聚集体较大，抗性细胞不易正常生长；物理或化学诱变作胞不易正常生长；物理或化学诱变作用不均一。用不均一。
16、第20页，此课件共37页哦（2）悬浮细胞：）悬浮细胞：广泛采用的材料；广泛采用的材料；缺点是存在细胞聚集的现象影响诱变效果。缺点是存在细胞聚集的现象影响诱变效果。（3）原生质体：）原生质体：是比较理想的诱变细胞来源。是比较理想的诱变细胞来源。缺点是植株再生困难。缺点是植株再生困难。第21页，此课件共37页哦3、突变的诱发：、突变的诱发：（1）诱变因素：）诱变因素：可以采用物理或化学的方法进行诱变处理。如，如可以采用物理或化学的方法进行诱变处理。如，如EMS，NG(亚硝基胍亚硝基胍)，和，和r射线等。射线等。但诱变剂并非必需，许多突变体的获得不需添加诱变剂，但诱变剂并非必需，许多突变体的获得不需
17、添加诱变剂，如抗菌素突变体的获得无需加入诱变剂，直接利用选择剂进如抗菌素突变体的获得无需加入诱变剂，直接利用选择剂进行筛选。行筛选。第22页，此课件共37页哦第23页，此课件共37页哦物理诱变剂：物理诱变剂：优点不需洗涤诱变剂，优点不需洗涤诱变剂，缺点是需要特定的设备。缺点是需要特定的设备。UV是常用的诱变因是常用的诱变因子；子；射线等进行辐射处理诱变。射线等进行辐射处理诱变。第24页，此课件共37页哦化学诱变剂：诱变处理后需要去除。化学诱变剂：诱变处理后需要去除。依据对依据对DNA作用方式可分为三类：作用方式可分为三类：A.与核酸碱基反应而且留在原位，从而引起与核酸碱基反应而且留在原位，从而
18、引起DNA复制复制时碱基配对的改变。如亚硝酸，硫酸二乙酯，时碱基配对的改变。如亚硝酸，硫酸二乙酯，EMS，乙，乙烯亚胺，亚硝基胍等；烯亚胺，亚硝基胍等；B.天然碱基类似物，在核酸复制时，它们可掺入到新天然碱基类似物，在核酸复制时，它们可掺入到新合成的合成的DNA分子中。如分子中。如BUdR，8-氨基鸟嘌呤，氨基鸟嘌呤，2-氨基嘌氨基嘌呤等；呤等；C.移码突变，如丫啶类物质等。移码突变，如丫啶类物质等。第25页，此课件共37页哦（2）诱变因子剂量与诱变方法选择：）诱变因子剂量与诱变方法选择：诱变时期、诱变剂量、剂量率影响诱变效果。诱变时期、诱变剂量、剂量率影响诱变效果。诱变方法：较低剂量的诱变剂
19、处理，或不同剂量率诱变方法：较低剂量的诱变剂处理，或不同剂量率的诱变剂处理，或采用复合诱变，两种诱变剂同时使的诱变剂处理，或采用复合诱变，两种诱变剂同时使用；一种诱变剂多次使用；两种诱变剂交替使用。用；一种诱变剂多次使用；两种诱变剂交替使用。第26页，此课件共37页哦 当诱变处理时，可在培养基中加入诱变剂。当诱变处理时，可在培养基中加入诱变剂。诱变处理后用大量稀释法或用解毒剂终止诱变剂诱变处理后用大量稀释法或用解毒剂终止诱变剂的作用。的作用。诱变处理的另一种方法是，先在植株水平上进行诱变处理的另一种方法是，先在植株水平上进行诱变处理，再在组织培养中筛选如抗除草剂突变体诱变处理，再在组织培养中筛
20、选如抗除草剂突变体的获得。的获得。第27页，此课件共37页哦第28页，此课件共37页哦4、突变体的选择：、突变体的选择：（1）正选择法：）正选择法：直接选择法，突变细胞能够在有直接选择法，突变细胞能够在有毒或有害培养基上生长。抗性突变体，激素自养毒或有害培养基上生长。抗性突变体，激素自养型突变体等。型突变体等。第29页，此课件共37页哦（2）负选择法：）负选择法：采用某一非允许条件的培养基，使突变体不能生采用某一非允许条件的培养基，使突变体不能生长，而野生型能够生长，然后添加一负选择剂，杀死长，而野生型能够生长，然后添加一负选择剂，杀死生长细胞，而不能杀死不生长的突变细胞，而保留下生长细胞，而
21、不能杀死不生长的突变细胞，而保留下来受到选择。来受到选择。第30页，此课件共37页哦（3）突变体鉴定：）突变体鉴定：细胞从选择性培养基转移到非选挥性培养基上细胞从选择性培养基转移到非选挥性培养基上快速生长，当细胞团达到足够大时再转移到选择快速生长，当细胞团达到足够大时再转移到选择性培养基上，然后再转移到植株分化培养基上性培养基上，然后再转移到植株分化培养基上(非非选择性培养基选择性培养基)，可在植株水平上检测突变的表达。，可在植株水平上检测突变的表达。第31页，此课件共37页哦六、突变体的利用：理论研究和品种改良方面应六、突变体的利用：理论研究和品种改良方面应用。用。1.生化代谢途径的研究；生
22、化代谢途径的研究；营养缺陷型突变体研究，如烟草硝酸还原酶突营养缺陷型突变体研究，如烟草硝酸还原酶突变体研究。变体研究。第32页，此课件共37页哦第33页，此课件共37页哦2、植物细胞遗传操作中的选择标记、植物细胞遗传操作中的选择标记 体细胞杂交中作为选择标记，硝酸还原酶细胞突体细胞杂交中作为选择标记，硝酸还原酶细胞突变体及激素自养型突变体的利用。变体及激素自养型突变体的利用。第34页，此课件共37页哦3、基因突变位点的分析：、基因突变位点的分析：硝酸还原酶硝酸还原酶cnx和和nia突变体细胞融合后，恢突变体细胞融合后，恢复硝酸还原酶活性表明二者突变位点不同。复硝酸还原酶活性表明二者突变位点不同。第35页，此课件共37页哦4、筛选有益突变进行品种改良、筛选有益突变进行品种改良 抗氨基酸突变体中氨基酸含量提高，可抗氨基酸突变体中氨基酸含量提高，可以用于高品质育种的材料。以用于高品质育种的材料。抗性突变体筛选可以获得抗性株系。抗性突变体筛选可以获得抗性株系。第36页，此课件共37页哦感谢大家观看第37页，此课件共37页哦