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1、紫外可见吸收光谱法(2)第1页，共56页，编辑于2022年，星期一2.1 紫外-可见吸收光谱法基本原理 分子的紫外分子的紫外-可见吸收光谱法是基于分子内电子跃迁可见吸收光谱法是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析法。产生的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析法。分子在紫外分子在紫外-可见区的吸收与其电子结构紧密相关。可见区的吸收与其电子结构紧密相关。紫外光谱的研究对象大多是具有共轭双键结构的分子。紫外光谱的研究对象大多是具有共轭双键结构的分子。2.1.1 概述第2页，共56页，编辑于2022年，星期一电电磁磁辐辐射波射波谱谱和相关的能量和相关的能量跃跃迁迁 可可 见见
2、光光第3页，共56页，编辑于2022年，星期一 紫外紫外-可见以及近红外光谱区域的详细划分如图所示。紫外可见以及近红外光谱区域的详细划分如图所示。紫外-可可见光区一般用波长（见光区一般用波长（nmnm）表示。其研究对象大多在）表示。其研究对象大多在200-380 nm200-380 nm的近的近紫外光区和紫外光区和/或或380-780 nm380-780 nm的可见光区有吸收。的可见光区有吸收。紫外紫外-可见吸收测定的灵敏度取决于产生光吸收分子的摩尔吸可见吸收测定的灵敏度取决于产生光吸收分子的摩尔吸光系数。该法仪器设备简单光系数。该法仪器设备简单,应用十分广泛。如医院的常规化验中，应用十分广泛
3、。如医院的常规化验中，95%95%的定量分析都用紫外的定量分析都用紫外-可见分光光度法。在化学研究中，如平可见分光光度法。在化学研究中，如平衡常数的测定、求算主衡常数的测定、求算主-客体结合常数等都离不开紫外客体结合常数等都离不开紫外-可见吸收可见吸收光谱光谱第4页，共56页，编辑于2022年，星期一分子吸收现象分子吸收现象CuSO4溶液吸收黄色光溶液吸收黄色光,其其溶液呈现出蓝色；溶液呈现出蓝色；KMnO4分子强烈地吸黄分子强烈地吸黄绿色光，对其他颜色的绿色光，对其他颜色的光吸收很少或不吸收，光吸收很少或不吸收，溶液呈紫红色。溶液呈紫红色。问问题题：Na2SO4溶溶液液无无色色透透明明,其分
4、子吸光情况其分子吸光情况?C CuS(固固态态)呈呈黑黑色色，其分子吸光又如何？其分子吸光又如何？700 nm530 nm420 nm580 nm470 nm620 nm第5页，共56页，编辑于2022年，星期一2.1.2 紫外紫外-可见吸收光谱法产生机理可见吸收光谱法产生机理1 1、分子能级轨道简介、分子能级轨道简介 分子对电磁辐射的吸收是分子总能量变化之和，即：分子对电磁辐射的吸收是分子总能量变化之和，即：E=Eel+Evib+Erot，式中，式中E代表分子的总能量，代表分子的总能量，Eel，Evib，Erot分别代表分别代表电子能级的能量、振动能级的能量以及转动能级的能量。电子能级的能量
5、、振动能级的能量以及转动能级的能量。注意：注意：电子能级、转动能级及振动能级是量子化能级电子能级、转动能级及振动能级是量子化能级 分分子子在在吸吸收收过过程程中中发发生生电电子子能能级级跃跃迁迁的的同同时时伴伴随随振振动动能能级级和和转转动动能能级级的的能能量量变变化化。一一般般原原子子对对电电磁磁辐辐射射的的吸吸收收只只涉涉及及原原子子核核外外电电子子能能量量的的变变化化，是是一一些些分分离离的的特特征征锐锐线线，而而分分子子的的吸吸收收光光谱谱是是由由成成千千上上万万条条彼彼此此靠靠得得很很紧紧的的谱谱线线组组成成，看看起起来来是是一一条条连续的吸收带连续的吸收带 所以分子吸收光谱也称为分
6、子的电子光谱所以分子吸收光谱也称为分子的电子光谱 第6页，共56页，编辑于2022年，星期一 从图中观察分子的三种能级跃迁，结合已有知识比较三种光谱出现的从图中观察分子的三种能级跃迁，结合已有知识比较三种光谱出现的区域。区域。第7页，共56页，编辑于2022年，星期一线光谱线光谱带光谱带光谱第8页，共56页，编辑于2022年，星期一2、紫外、紫外-可见光谱曲线示意图可见光谱曲线示意图第9页，共56页，编辑于2022年，星期一3 3、有机物分子紫外可见光谱有机物分子紫外可见光谱从化学从化学键键性性质质考考虑虑，与有机物分子紫外与有机物分子紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱有关有关的的电电子是：形成子
7、是：形成单键单键的的s s电电子，形成双子，形成双键键的的p p电电子以及未共享子以及未共享的或称的或称为为非非键键的的n n电电子。有机物分子内各种子。有机物分子内各种电电子的能子的能级级高低高低次序如次序如图图所示，所示，s s*p p*n n p p s s。标标有有*者者为为反反键电键电子子 第10页，共56页，编辑于2022年，星期一 从图中可以看出：理论上有机物的紫外可见光谱有从图中可以看出：理论上有机物的紫外可见光谱有6种跃迁形式。它们是种跃迁形式。它们是 s s s s*；s s p p*；n n s s*；n n p p*；p p p p*；p p s s*其中s p*；p
8、s*是禁阻的 s s s s*跃跃迁所需能量最大，迁所需能量最大，maxmax 170 nm170 nm，位于，位于远远紫外区或真空紫外区。一紫外区或真空紫外区。一般紫外般紫外-可可见见分光光度分光光度计计不能用来研究不能用来研究远远紫外吸收光紫外吸收光谱谱。如甲。如甲烷烷，maxmax=125 nm=125 nm。饱饱和有机化合物的和有机化合物的电电子子跃跃迁在迁在远远紫外区。紫外区。n ns s*跃跃迁迁。含有未共享含有未共享电电子子对对的取代基都可能的取代基都可能发发n ns s*跃跃迁迁 ，含有含有S S，N N，O O，Cl,BrCl,Br，I I等等杂杂原子的原子的饱饱和和烃烃衍生
9、物都出衍生物都出现现一个一个n ns s*跃跃迁迁产产生生的吸收的吸收谱带谱带。n ns s*跃跃迁也是高能量迁也是高能量跃跃迁，一般迁，一般 maxmax 200 nm200 nm，落在，落在远远紫外区。但紫外区。但跃跃迁所需能量与迁所需能量与n n电电子所属原子的性子所属原子的性质质关系很大。关系很大。杂杂原子的原子的电负电负性越小，性越小，电电子越易被激子越易被激发发，激，激发发波波长长越越长长。有。有时时也落在近紫外区。如甲也落在近紫外区。如甲胺，胺，maxmax=213 nm=213 nm 第11页，共56页，编辑于2022年，星期一 p pp p*所所需需能能量量较较少少，并并且且
10、随随双双键键共共轭轭程程度度增增加加，所所需需能能量量降降低低。若若两两个个以以上上的的双双键键被被单单键键隔隔开开，则则所所呈呈现现的的吸吸收收是是所所有有双双键键吸吸收收的的叠叠加加；若若双双键共轭，则吸收大大增强，波长红移，键共轭，则吸收大大增强，波长红移，maxmax和和 maxmax均增加。均增加。如如单单个个双双键键，一一般般 maxmax为为150-200nm150-200nm，乙乙烯烯的的 maxmax =185nm185nm；而而共共轭轭双双键键如如丁丁二二烯烯 maxmax =217nm=217nm，己三烯，己三烯 maxmax=258nm=258nm。n np p*所所需
11、需能能量量最最低低，在在近近紫紫外外区区，有有时时在在可可见见区区。但但p pp p*跃跃迁迁几几率率大大，是是强强吸吸收收带带；而而n np p*跃跃迁迁几几率率小小，是是弱弱吸吸收收带带，一一般般 maxmax 500500。许许多多化化合合物物既既有有p p电电子子又有又有n n电子，在外来辐射作用下，既有电子，在外来辐射作用下，既有pppp*又有又有n np p*跃迁。跃迁。如如-COOR-COOR基基团团，p pp p*跃跃迁迁 maxmax=165=165 nmnm，maxmax=4000=4000；而而n np p*跃跃迁迁 maxmax=205nm=205nm，maxmax=5
12、0=50。p pp p*和和n np p*跃迁都要求有机化合物分子中含有不饱和基团，以提供跃迁都要求有机化合物分子中含有不饱和基团，以提供p p轨道。轨道。第12页，共56页，编辑于2022年，星期一 含含有有p p键键的的不不饱饱和和基基团团引引入入饱饱和和化化合合物物中中，使使饱饱和和化化合合物物的的最最大大吸吸收收波波长长移移入入紫紫外外-可可见见区区。这这类类能能产产生生紫紫外外-可可见见吸吸收收的的官官能能团团，如如一一个个或或几几个个不不饱饱和和键键，C=C,C=O,N=N,N=OC=C,C=O,N=N,N=O等等称称为生色团（为生色团（chromophorechromophore
13、）有有些些基基团团本本身身在在200 200 nmnm以以上上不不产产生生吸吸收收，但但这这些些基基团团的的存存在在能能增增强强生生色色团团的的生生色色能能力力（改改变变分分子子的的吸吸收收位位置置和和增增加加吸吸收收强强度度），这这类类基基团团称称为为助助色色团团(auxochrome)(auxochrome)。一一般般助助色色团团为为具具有有孤孤对对电电子子的基团，如的基团，如-OH,-NH-OH,-NH2 2,-SH,-SH等等 含含有有生生色色团团或或生生色色团团与与助助色色团团的的分分子子在在紫紫外外光光区区有有吸吸收收并并伴伴随随分分子子本本身身电电子子能能级级的的跃跃迁迁，不不同
14、同官官能能团团吸吸收收不不同同波波长长的的光光。作作波波长长扫扫描描，记记录录吸吸光光度度对对波波长长的的变变化化曲曲线线，就就得得到到该该物物质质的的紫紫外外-可见吸收光谱可见吸收光谱第13页，共56页，编辑于2022年，星期一吸收带的划分吸收带的划分第14页，共56页，编辑于2022年，星期一4 4、无机物的紫外可见光谱无机物的紫外可见光谱 与与无机无机物分子紫外物分子紫外-可可见见吸收光吸收光谱谱有关的是：有关的是：电荷迁移电荷迁移/转移和配位转移和配位场跃迁场跃迁 电电荷荷转转移移/迁迁移移光光谱谱：当当外外来来辐辐射射照照射射某某些些有有机机或或无无机机化化合合物物时时,可可能能发发
15、生生一一个个电电子子从从体体系系具具有有电电子子给给予予体体特特性性部部分分(称称为为给给体体,donor)转转移移到到该该体体系系的的另另一一具具有有电电子子接接受受体体特特性性的的部部分分(称称为为受受体体，acceptor)，这种电子转移产生的吸收谱带，称为电荷转移吸收带。，这种电子转移产生的吸收谱带，称为电荷转移吸收带。电电荷荷转转移移吸吸收收带带涉涉及及的的是是给给体体的的一一个个电电子子向向受受体体的的一一个个电电子子轨轨道道上上的的跃跃迁，激发态是这一内氧化还原过程的产物。电荷转移过程可表示如下迁，激发态是这一内氧化还原过程的产物。电荷转移过程可表示如下 式中式中D与与A分别代表
16、电子给体与受体。下面三例是能产生电荷转分别代表电子给体与受体。下面三例是能产生电荷转移吸收带的一些化合物。移吸收带的一些化合物。第15页，共56页，编辑于2022年，星期一Fe2+是电子给体是电子给体,H H2 2O O是电子受体是电子受体-NR2是电子给体是电子给体,苯环是电子受体苯环是电子受体 苯环是电子给体，氧是电子受体苯环是电子给体，氧是电子受体 电电荷荷转转移移吸吸收收带带的的一一个个特特点点是是吸吸收收强强度度大大，e emax 104l/molcm，因因此此含含有有这这类类结结构构的的分分子子测测定定灵灵敏敏度度高高，该该原原理理已已被被广广泛泛应应用于分子识别的主体分子设计中用
17、于分子识别的主体分子设计中第16页，共56页，编辑于2022年，星期一配位体场吸收带配位体场吸收带:某些无机金属离子也会产生紫外某些无机金属离子也会产生紫外-可见吸收。如含可见吸收。如含d电子的过渡金属离子会产电子的过渡金属离子会产生配位体场吸收带。生配位体场吸收带。依据配位场理论，无配位场存在时依据配位场理论，无配位场存在时dxdx，dydy，dzdz，d d，dxdx，能量简并；，能量简并；当过渡金属离子处于配位体形成的负电场中时，当过渡金属离子处于配位体形成的负电场中时，5 5个简并的个简并的d d轨道会分裂成轨道会分裂成能量不同的轨道。能量不同的轨道。在外来辐射激发下，在外来辐射激发下
18、，d电子从能量低的轨道跃迁到能量高的轨道时产生配电子从能量低的轨道跃迁到能量高的轨道时产生配位体场吸收带。一般配位体场吸收带在可见区，位体场吸收带。一般配位体场吸收带在可见区，max约约0.1100 l/molcm，吸收，吸收很弱。因此配位体场吸收带对定量分析用处不大很弱。因此配位体场吸收带对定量分析用处不大 镧镧系系及及锕锕系系离离子子5 5 电电子子跃跃迁迁产产生生的的电电子子跃跃迁迁吸吸收收谱谱带带出出现现在在紫紫外外-可可见见区区。由于由于 轨道为外层轨道所屏蔽，受溶剂性质或配位体的影响很小，故谱带窄轨道为外层轨道所屏蔽，受溶剂性质或配位体的影响很小，故谱带窄 少少数数无无机机阴阴离离
19、子子，如如NONO3 3-(maxmax=313=313 nm)nm)、COCO3 32-2-(maxmax =217=217 nm)nm)、NONO2 2-(maxmax =360=360、280 280 nm)nm)、N N3 3-(maxmax=230 nm)=230 nm)、CSCS3 32-2-(maxmax=500 nm)=500 nm)等也有紫外等也有紫外-可见吸收可见吸收第17页，共56页，编辑于2022年，星期一Typical Organic UV/Vis SpectraNote how the same molecule displays markedly differen
20、t spectral features depending upon the environment in which it finds itself.第18页，共56页，编辑于2022年，星期一Inorganic-Transition MetalsSpectra from transition element ions arise from the 3d and 4d electrons.These spectra are quite broad,often in the visible(solutions are brightly coloured),and are significant
21、ly affected by ligands and solvents.Ligand Field Theory is a molecular orbital approach to understand these effects.Essentially it assets that the d-orbital energies are split in solution(or with ligands)and transitions between these split levels are at the source of their UV/Vis spectroscopy.第19页，共
22、56页，编辑于2022年，星期一Inorganic-LanthanidesUV/Vis spectra of lanthanide ions arise from 4f levels(5f for the actinides).These are rather well-screened from outside influences and as such the spectra are comparatively sharp,and only weakly influenced by ligands and solvents.第20页，共56页，编辑于2022年，星期一Inorganic-
23、Charge TransferInorganic complexes metal ions with surrounding ligands can undergo absorption processes where the electron jumps from an orbital mostly centered on the ligand to an orbital mostly centered on the metal ion(the opposite can occur,but less frequently).Transitions are intense.Fig.14-10
24、in Skoog,Holler,Nieman.第21页，共56页，编辑于2022年，星期一提高无机物紫外可见光谱灵敏度的有效途径提高无机物紫外可见光谱灵敏度的有效途径1、合成新的高灵敏有机显色剂、合成新的高灵敏有机显色剂（1）增大有机显色剂分子的共轭体系）增大有机显色剂分子的共轭体系 偶氮胂偶氮胂 偶氮胂偶氮胂第22页，共56页，编辑于2022年，星期一（2）在有机显色剂分子中引入取代基）在有机显色剂分子中引入取代基对一系列成络基团：对一系列成络基团：SO3H,COOH,AsO3H2,OH含含COOH,AsO3H2 的试剂对稀土元素反应的试剂对稀土元素反应灵敏度最高。灵敏度最高。取代基取代基C
25、l,Br,COCH3 处于苯环中偶氮基处于苯环中偶氮基的对位时，对稀土元素反应灵敏度最高。的对位时，对稀土元素反应灵敏度最高。第23页，共56页，编辑于2022年，星期一与稀土显色反应与稀土显色反应 max （104）不反应不反应 不反应不反应 734 18.4 670 10.6 700 1.87第24页，共56页，编辑于2022年，星期一（3）高灵敏显色剂）高灵敏显色剂不对称变色酸双偶氮类试剂不对称变色酸双偶氮类试剂 吡啶及噻唑偶氮衍生物吡啶及噻唑偶氮衍生物卟啉类试剂：大环化合物卟啉类试剂：大环化合物有色高分子聚合物有色高分子聚合物纳米粒子：金纳米粒子（胶体金）纳米粒子：金纳米粒子（胶体金）
26、第25页，共56页，编辑于2022年，星期一2、多元配合物高灵敏显色体系、多元配合物高灵敏显色体系三元或四元配合物分子有更大的分子截面积三元或四元配合物分子有更大的分子截面积金属金属-三羟基荧光酮三羟基荧光酮-表面活性剂表面活性剂金属金属-变色酸双偶氮衍生物变色酸双偶氮衍生物-阳离子表面活性剂阳离子表面活性剂混配胶束四元配合物混配胶束四元配合物 三元配合物中引入表面活性剂三元配合物中引入表面活性剂金属络阴离子与碱性染料阳离子形成离子缔合金属络阴离子与碱性染料阳离子形成离子缔合 第26页，共56页，编辑于2022年，星期一9.1.3 紫外可见吸收光谱法常用术语紫外可见吸收光谱法常用术语生色团生色
27、团助色团助色团红移和蓝移红移和蓝移增色效应和减色效应增色效应和减色效应强带与弱带强带与弱带谱带类型谱带类型（）（）带带（）带（）带（）带和带（）带和带第27页，共56页，编辑于2022年，星期一1生色团 紫外-可见光谱中，生色团(Chromophore)是指能在近紫外和可见光区产生特征吸收的基团。有机化合物中，生色团一般是具有电子的特征基团，如C=C，CC，C=O，C=N，CN，C=S，N=N，N=O，S=O等，如表9-4。这类基团在有机化合物中孤立存在时，将在远紫外光区产生特征吸收谱带。当化合物中存在多个生色团，且处于共轭状态时，最大吸收峰将位于近紫外光区和可见光区，对应于跃迁和跃迁。第28
28、页，共56页，编辑于2022年，星期一助色团有些基团本身在紫外-可见光区不产生吸收，但这些基团与生色团相连时，能使生色团的最大吸收波长向长波长方向移动，吸收峰强度增加，这类基团称为助色团(Auxochrome)。如-X，-OH，-OR，-NH2，-NR-，-SH，-SR-等。当它们连接到生色团上时，n电子与电子相互作用，相当于增大了共轭体系，使轨道间能级差减小，生色团的最大吸收波长向长波长方向移动，且吸收峰强度增加。第29页，共56页，编辑于2022年，星期一红移和蓝移 当取代基或溶剂体系发生变更时，化合物的最大吸收波长(ma)向长波方向移动的现象称为红移(Bathochromic shift
29、 or red shift)，向短波方向移动的现象称为蓝移(或紫移，Hypsochromic shift or blue shift)。第30页，共56页，编辑于2022年，星期一增色效应和减色效应最大吸收带的摩尔吸收系数增加时称为增(浓)色效应(Hyperchromic effect)；最大吸收带的摩尔吸收系数减小时称为减(浅)色效应(Hypochromic effect)。第31页，共56页，编辑于2022年，星期一强带与弱带强带多由允许跃迁产生，是最大摩尔吸收系数max 104 Lmol-1cm-1的吸收带；弱带多由禁阻跃迁产生，是最大摩尔吸收系数max 103 Lmol-1cm-1的吸
30、收带。第32页，共56页，编辑于2022年，星期一谱带类型(1)R带 R带是含p-共轭体系的生色团，如-N=O,-C=O，-N=N-等，发生产生的吸收带。该带的最大吸收峰一般位于200400 nm之间，吸收强度弱，最大摩尔吸光系数max 104 Lmol-1cm-1。K带的最大吸收波长随溶剂极性和共轭体系的增加而红移；R带的最大吸收波长随溶剂极性增加蓝移，随共轭体系的变化不如K带明显。第33页，共56页，编辑于2022年，星期一(3)B带和E带B带和E带是芳香族和杂芳香族化合物的跃迁产生的特征光谱吸收带，B带吸收峰位于70230nm之间，中心波长在254 nm左右，最大摩尔吸收系数(max)约
31、在200 Lmol-1cm-1，为一伴有多重小峰的宽峰结构，又称精细结构。属于禁阻跃迁产生的弱吸收带，当苯环上有取代基时，B带的精细结构减弱或消失。在极性溶剂中，由于溶质与溶剂的相互作用，其精细结构消失或变得不明显。第34页，共56页，编辑于2022年，星期一E带分为E1带(又称B带、带)和E2带(又称La带、p带)。属于跃迁概率较大或中等的允许跃迁。E1带最大吸收波长在184 nm左右，吸收强度大，最大摩尔吸收系数max 104 Lmol-1cm-1；E2带出现在204 nm左右，最大摩尔吸收系数max103 Lmol-1cm-1。当苯环上引入共轭取代基(或带n电子基团)时，最大吸收波长红移
32、，吸光强度增大。第35页，共56页，编辑于2022年，星期一9.1.4 影响紫外影响紫外-可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素1.共轭效应 共轭体系增加，最大吸收波长红移，最大摩尔吸收系数增加2.取代基效应 共轭双键两端有给电子基或吸电子基时，化合物的最大吸收波长和吸光强度会发生改变 讲解Woodward-Fieser规则 3.溶剂效应及溶剂选用规则第36页，共56页，编辑于2022年，星期一Woodward-Fieser规则规则 第37页，共56页，编辑于2022年，星期一9.2 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计第38页，共56页，编辑于2022年，星期一9.2.1 仪器基本结构仪器基
33、本结构典型光谱仪的组成:(1)稳定的辐射源-光源(2)色散元件-单色器(3)固定试样用的透明容器-样品池(4)检测器(5)信号处理器或输出装置0.575光源光源单色单色器器吸收池吸收池检测器检测器显示显示第39页，共56页，编辑于2022年，星期一9.2.2 紫外紫外-可见分光光度计类型可见分光光度计类型1.单光束分光光度计第40页，共56页，编辑于2022年，星期一2.双光束紫外双光束紫外-可见分光光度计可见分光光度计 双光束分光光度双光束分光光度计计光路示意光路示意图图第41页，共56页，编辑于2022年，星期一3.双波长紫外双波长紫外-可见分光光度计可见分光光度计 双波长分光光度计示意图
34、双波长分光光度计示意图 第42页，共56页，编辑于2022年，星期一4.多道分光光度计多道分光光度计多道分光光度多道分光光度计计示意示意图图第43页，共56页，编辑于2022年，星期一9.3 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 的应用的应用9.3.1 纯度检查纯度检查鉴定甲醇或乙醇中的杂质苯鉴定甲醇或乙醇中的杂质苯四氯化碳中有无二硫化碳杂质四氯化碳中有无二硫化碳杂质第44页，共56页，编辑于2022年，星期一9.3.2 定性分析1.标准图谱对照法2.最大波长计算法3.结构推断4.异构体判断5.构象判断第45页，共56页，编辑于2022年，星期一9.3.3 定量分析定量分析1.基本术语2.朗
35、伯-比尔定律 A=abc A=第46页，共56页，编辑于2022年，星期一3.分光光度滴定法分光光度滴定法 以一定的标准溶液滴定待测物溶液，测定滴定中溶液的吸光度变化，通过作图法求得滴定终点，从而计算待测组分含量的方法称为分光光度滴定。一般有直接滴定法和间接滴定法两种。前者选择被滴定物、滴定剂或反应生成物之一摩尔吸光系数最大的物质的max为吸收波长进行滴定。滴定曲线有如下几种形式。间接滴定法需使用指示剂 光度滴定已用于酸碱滴定、氧化还原滴定、沉淀滴定和络合滴定等光度滴定已用于酸碱滴定、氧化还原滴定、沉淀滴定和络合滴定等第47页，共56页，编辑于2022年，星期一 4.差示分光光度法差示分光光度
36、法 吸光度吸光度A在在0.2-0.8范围内误差最小。超出此范围，如高浓度范围内误差最小。超出此范围，如高浓度或低浓度溶液，其吸光度测定误差较大。尤其是高浓度溶液，或低浓度溶液，其吸光度测定误差较大。尤其是高浓度溶液，更适合用差示法更适合用差示法 一般分光光度测定选用试剂空白或溶液空白作为参比，差示一般分光光度测定选用试剂空白或溶液空白作为参比，差示法则选用一已知浓度的溶液作参比。该法的实质是相当于透光率标法则选用一已知浓度的溶液作参比。该法的实质是相当于透光率标度放大度放大第48页，共56页，编辑于2022年，星期一 高吸收法在测定高浓度高吸收法在测定高浓度溶液时使用。选用比待测溶溶液时使用。
37、选用比待测溶液浓度稍低的已知浓度溶液液浓度稍低的已知浓度溶液作标准溶液，调节透光率为作标准溶液，调节透光率为100%。低吸收法在测定低浓度低吸收法在测定低浓度溶液时使用。选用比待测液溶液时使用。选用比待测液浓度稍高的已知浓度溶液作浓度稍高的已知浓度溶液作标准溶液，调节透光率为标准溶液，调节透光率为0。最精密法是同时用浓度比待最精密法是同时用浓度比待测液浓度稍高或稍低的两份已知测液浓度稍高或稍低的两份已知溶液作标准溶液，分别调节透光溶液作标准溶液，分别调节透光率为率为0或或100%。第49页，共56页，编辑于2022年，星期一5.导数分光光度法导数分光光度法 用吸光度对波长求一阶或高阶导数并对波
38、用吸光度对波长求一阶或高阶导数并对波长长 作图，可以得到导数光谱。对比尔定律作图，可以得到导数光谱。对比尔定律A=bC求导，得到求导，得到：因此，吸光度因此，吸光度A的导数值与浓度的导数值与浓度C成比例。成比例。从图中可以看出，随着导数阶数的增从图中可以看出，随着导数阶数的增加，谱带变得尖锐，分辨率提高，但原吸加，谱带变得尖锐，分辨率提高，但原吸收光谱的基本特点逐渐消失。收光谱的基本特点逐渐消失。导数光谱的特点在于灵敏度高，可减导数光谱的特点在于灵敏度高，可减小光谱干扰。因而在分辨多组分混合物的小光谱干扰。因而在分辨多组分混合物的谱带重叠、增强次要光谱谱带重叠、增强次要光谱(如肩峰如肩峰)的清
39、晰的清晰度以及消除混浊样品度以及消除混浊样品散射的影响时有利 第50页，共56页，编辑于2022年，星期一 6.双波长分光光度法双波长分光光度法 前面已经介绍了双波长分光光度计的结构。它是通过两前面已经介绍了双波长分光光度计的结构。它是通过两个单色器分别将光源发出的光分成个单色器分别将光源发出的光分成 1，2两束单色光，经斩光两束单色光，经斩光器并束后交替通过同一吸收池。因此检测的是试样溶液对两波器并束后交替通过同一吸收池。因此检测的是试样溶液对两波长光吸收后的吸光度差。长光吸收后的吸光度差。12=即两束光通过吸收池后的吸光度差与待测组分浓度即两束光通过吸收池后的吸光度差与待测组分浓度成正比成
40、正比 第51页，共56页，编辑于2022年，星期一特点特点(1)可用于悬浊液和悬浮液的测定，消除背景吸收。可用于悬浊液和悬浮液的测定，消除背景吸收。因悬浊液的参比溶液不易配制，使用双波长分光光度法时，可固定因悬浊液的参比溶液不易配制，使用双波长分光光度法时，可固定 1为不受待测组分为不受待测组分含量影响的等吸收点含量影响的等吸收点(于样品中依次加入待测组分，记录吸收光谱，得到的吸光于样品中依次加入待测组分，记录吸收光谱，得到的吸光度重叠的点为等吸收点，测定度重叠的点为等吸收点，测定 2处的吸光度变化，可以抵消混浊的干扰，提高测处的吸光度变化，可以抵消混浊的干扰，提高测定精度定精度(因为使用同一
41、吸收池因为使用同一吸收池)。(2)无须分离，可用于吸收峰相互重叠的混合组分的同时测定。无须分离，可用于吸收峰相互重叠的混合组分的同时测定。(3)可测定导数谱。可测定导数谱。固定固定 1和和 2两波长差为两波长差为1-2nm进行波长扫描，得到一阶导数光谱进行波长扫描，得到一阶导数光谱(DA/D l)。有的仪器还带有测定二阶导数光谱的电路。有的仪器还带有测定二阶导数光谱的电路第52页，共56页，编辑于2022年，星期一分析条件的选择分析条件的选择 溶剂的选择和波长选择溶剂的选择和波长选择 所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波长区间内吸收小，不易挥发选择合适的分析波长（max）A：0
42、.2-0.8，选择适当的参比溶液定量分析方法：定量分析方法：标准曲线法（略）标准加入法（略）混合物分析 根据吸光度的加和性，测定混合物中n个组分的浓度，可在n个不同波长处测量n个吸光度值，列出n个方程联立求解 ij为在波长i测定组分j的摩尔吸收系数，Ai为在波长i测得的该体系的总吸光度，Cj为第j组分的浓度 第53页，共56页，编辑于2022年，星期一 平衡常数的测定平衡常数的测定 在化学平衡研究、分子识别中常常需要测定酸解离常数、pH值、氢键结合度等等。设均一水溶液中酸解离及其与金属的络合平衡如下：只考虑酸解离型体的吸收时，酸解离引起的吸光度增加低pH下酸性型体HL,MHL的吸收，为一常数。
43、第54页，共56页，编辑于2022年，星期一络合物结合比的测定络合物结合比的测定 通过紫外通过紫外-可见吸收光谱的测定，可以求得主客体络合物的结合比。可见吸收光谱的测定，可以求得主客体络合物的结合比。常用以下几种方法。常用以下几种方法。摩尔比法摩尔比法 设有络合反应设有络合反应mM+nY=MmYn，固定一个组分，固定一个组分(如如M)的浓度不变，改的浓度不变，改变另一组分变另一组分(如如Y)的浓度，求得一系列的浓度，求得一系列Y/M比，在络合物比，在络合物MmYn的最大的最大吸收波长处测定吸光度的变化。则开始时，随吸收波长处测定吸光度的变化。则开始时，随Y/M的增加，溶液吸光度的增加，溶液吸光
44、度线性增加，到达络合物的组成比后，继续增加线性增加，到达络合物的组成比后，继续增加Y/M，会有三种不同情况：，会有三种不同情况：(1)吸光度达到饱和，不再增加。说明试剂吸光度达到饱和，不再增加。说明试剂Y无吸收，吸光度的增加只无吸收，吸光度的增加只是络合物的单独贡献。如是络合物的单独贡献。如Fe(III)-钛铁试剂络合物。钛铁试剂络合物。(2)吸光度出现一转折点后继续增加。说明试剂吸光度出现一转折点后继续增加。说明试剂Y在络合物的在络合物的lmax处稍有吸收。处稍有吸收。如如Zn-PAN络合物。络合物。PAN：1-(2-吡啶基偶氮吡啶基偶氮)-2-萘酚。萘酚。(3)吸光度出现一转折点后呈直线下降。说明分步生成了摩尔吸光系数小于络吸光度出现一转折点后呈直线下降。说明分步生成了摩尔吸光系数小于络合物合物 的高次络合物。如的高次络合物。如Bi-二甲酚橙络合物。二甲酚橙络合物。第55页，共56页，编辑于2022年，星期一 下图代表了第一种情况。曲线转折点对应的摩尔浓度比Y/M=n:m，即为该络合物的组成比。连续变换法或job法 保持金属离子M和络合剂Y的总摩尔数不变，连续改变两组分的比例，并逐一测定体系的吸光度A。以A对摩尔分数fY=Y/(M+Y)或fM=M/(M+Y)作图，曲线拐点即为络合物的组成比。但此法对n/m 4的体系不适用。第56页，共56页，编辑于2022年，星期一